關(guān)鍵詞：微藻；沼液；兼養(yǎng)；葡萄糖；乙酸鈉

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的集約化發(fā)展，養(yǎng)殖場面臨嚴(yán)峻的糞污處置難題。厭氧消化技術(shù)是集約化養(yǎng)殖場畜禽糞污處理的高效手段之一，但同時也產(chǎn)生大量沼液。據(jù)報道，我國每年產(chǎn)生的沼液有8-10億。目前，沼液處理主要有資源化利用與達(dá)標(biāo)排放處理兩種途徑。其中，資源化利用最主要的方式是直接還田。但由于沼液的大量、連續(xù)產(chǎn)生與作物的養(yǎng)分需求季節(jié)性規(guī)律存在矛盾，且養(yǎng)殖場周邊配套農(nóng)田有限，過量還田將引發(fā)水體富營養(yǎng)化、土壤板結(jié)、空氣污染等一系列環(huán)境污染風(fēng)險；另一方面，一些規(guī)?；B(yǎng)殖場利用厭氧好氧反應(yīng)池、序批式反應(yīng)器、膜生物反應(yīng)器等污水處理常規(guī)生化工藝手段，深度凈化沼液COD、氮、磷等污染物，使其達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。但達(dá)標(biāo)處理建設(shè)及維護(hù)成本高、能耗大，處理過程也無任何資源化收益，中小型養(yǎng)殖場往往難以負(fù)擔(dān)。因此，如何實(shí)現(xiàn)沼液的無害化處置與資源化利用已成為我國養(yǎng)殖行業(yè)亟待攻關(guān)的重點(diǎn)技術(shù)問題。

近年來，微藻廢水處理技術(shù)已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，特別是利用微藻凈化畜禽沼液回收養(yǎng)分的研究獲得了廣泛關(guān)注。微藻可通過生物吸附、生物降解等方式實(shí)現(xiàn)沼液污染物的深度去除，具備以下優(yōu)勢：（1）對碳、氮、磷養(yǎng)分去除效率高，可實(shí)現(xiàn)沼液深度凈化；（2）可在不同的生長模式下，收獲蛋白、油脂、色素等生物質(zhì)及高品質(zhì)有機(jī)肥等藻類產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)沼液生物處理的環(huán)境增值效益；（3）沼液培養(yǎng)微藻技術(shù)具有減污降碳協(xié)同增效的屬性，可助力畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)達(dá)成“雙碳”戰(zhàn)略要求。與沼液常規(guī)處理方式相比，利用沼液培養(yǎng)微藻無需占用農(nóng)業(yè)耕地，單位面積的沼液消納能力與養(yǎng)分去除效率更高，不僅降低了環(huán)境污染風(fēng)險，也具備較高的技術(shù)附加值及資源化收益。然而，利用沼液培養(yǎng)微藻目前仍然存在生物量積累較低的問題，因而該技術(shù)擴(kuò)大應(yīng)用的前提便是進(jìn)一步強(qiáng)化微藻生物量產(chǎn)量。

微藻兼養(yǎng)培養(yǎng)是目前已知生物量產(chǎn)量最高的微藻培養(yǎng)模式，其能夠協(xié)同利用有機(jī)碳源和光能獲得能量，克服自養(yǎng)單一光合作用的限制大幅強(qiáng)化生物質(zhì)積累。在兼養(yǎng)代謝下，有機(jī)碳通過磷酸戊糖、乙醛酸循環(huán)和三羧酸循環(huán)等路徑合成碳骨架并為生命活動提供“能量貨幣”ATP。在光合磷酸化、氧化磷酸化的協(xié)同增益下，微藻對能量和碳源的攝取更加靈活。沼液培養(yǎng)微藻技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的最大障礙是光衰減導(dǎo)致的光合效率下降問題：高濃度沼液色度、濁度較高，光透性差，不利于微藻光合作用受光，使得微藻生物質(zhì)產(chǎn)量及沼液污染物去除率下降。同時，沼液氨氮濃度通常較高，高濃度氨氮會增加微藻光敏性，放大光損傷，破壞光合系統(tǒng)，從而對微藻生長造成抑制。微藻兼養(yǎng)培養(yǎng)對光的依賴較自養(yǎng)大幅降低，當(dāng)光透性不佳時，微藻可利用有機(jī)碳源或沼液COD中所含多糖、有機(jī)酸等通過氧化磷酸化途徑代謝產(chǎn)能生長。因此，沼液養(yǎng)藻與兼養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)在原理上高度契合，但目前國內(nèi)外利用沼液培養(yǎng)微藻的相關(guān)研究多基于光合自養(yǎng)，缺乏兼養(yǎng)模式相關(guān)研究。

為探究沼液兼養(yǎng)培養(yǎng)微藻的應(yīng)用潛力及碳源施用影響，筆者團(tuán)隊在前期工作中從自然水體中分離、純化出3株可兼養(yǎng)生長的微藻藻株。本研究首先研究了這3株微藻的沼液兼養(yǎng)培養(yǎng)潛力：以豬糞沼液為培養(yǎng)介質(zhì)，對3株微藻的生長、光合色素積累、沼液養(yǎng)分去除等進(jìn)行了考察，進(jìn)而優(yōu)選出一株可快速適應(yīng)沼液并具有生物量優(yōu)勢的強(qiáng)健藻株。在此基礎(chǔ)上，分別選擇以三羧酸循環(huán)為代謝途徑的葡萄糖和以乙醛酸循環(huán)為代謝途徑的乙酸鈉作為兼養(yǎng)碳源，通過考察該株微藻的生長、碳代謝及光合性能等，探討兩種碳源及不同濃度對促進(jìn)微藻兼養(yǎng)生長的影響，以評估沼液微藻兼養(yǎng)代謝的碳源施用，以期為規(guī)?；B(yǎng)殖場畜禽沼液的就地消納及高值轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1供試藻種及培養(yǎng)條件

本研究所用藻種為南京仙林地區(qū)自然水體中分離、純化獲得的3株兼養(yǎng)型微藻，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定分別為小球藻，蛋白核小球藻和柵藻利用滅菌（121℃，0.12MPa，30min）后的BG-11培養(yǎng)基對上述藻種于光照培養(yǎng)架上擴(kuò)培，光源為LED（暖白光，4500K），光強(qiáng)為60umol·m-2．s-1，溫度為26.5+0.5℃，光暗周期為12h：12h，藻液每日振蕩混勻多次。本文所有試驗皆取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻液接種。

1.2供試沼液

試驗所用沼液取自江蘇洋宇生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司正常運(yùn)行的豬糞厭氧消化黑膜沼氣池，沼液主要指標(biāo)為：COD（7480.1+83.5）mg·L-1、氨氮（NH4-N）（1197.5±23.5）mg·L-1、總氮（TN）（1410.4+26.2）mg·L-1、總磷（TP） （80.6+4.3）mg·L-1，沼液pH為7.4+0.1。培養(yǎng)微藻前，對沼液進(jìn)行離心預(yù)處理（8000r·min-1，10min）以去除污泥等固形雜質(zhì)，分離獲得的上清液經(jīng)高壓滅菌處理（121℃，0.12MPa，30min），使用1mol·L-1的NaOH與1moI·L-1的HCI調(diào)節(jié)pH至7.2后備用。為保證不同藻種、代謝模式下各處理組微藻至少可生長，用去離子水將滅菌沼液稀釋至（150+10）mol·L-1的氨氮濃度水平。

1.3試驗設(shè)計

1.3.1豬糞沼液兼養(yǎng)培養(yǎng)微藻的可行性研究

以葡萄糖作為外源有機(jī)碳，對Csp、C.pyrenoido-sa、Scenedesmus sp．3株微藻進(jìn)行沼液兼養(yǎng)培養(yǎng)（以M表示）并以光合自養(yǎng)（以P表示）作為對照，探究3株微藻沼液兼養(yǎng)培養(yǎng)的可行性。試驗在500mL錐形瓶中進(jìn)行（300mL有效體積），各處理組微藻接種生物量為0.05g·L-1。兼養(yǎng)組外源有機(jī)碳為5g·L-1葡萄糖。試驗在恒溫光照培養(yǎng)架上開展，光源為LED（暖白光，色溫4500K），光照強(qiáng)度為（100+5）umol·m-2．s-1。培養(yǎng)溫度為（26.5±0.5）℃，光暗周期為12h：12h。當(dāng)某一組葡萄糖耗盡時，試驗結(jié)束。試驗分別對各處理組（M-C．sp，P-C. sp，M-C.p，P-C.p，M-S．sp，P-5．sp）微藻生理指標(biāo)及沼液污染物去除等進(jìn)行測定。

1.3.2不同有機(jī)碳源對沼液兼養(yǎng)培養(yǎng)C.pyrenoidosa的影響

在上述可行性研究基礎(chǔ)上，選取在沼液中兼養(yǎng)生長能力最好的C.pyrenoidosa施加兩種典型的具備不同碳代謝途徑的有機(jī)碳源（葡萄糖一三羧酸循環(huán)、乙酸鈉一乙醛酸循環(huán)），以探明其對C.pyrenoidosa沼液生長的影響。試驗在500mL錐形瓶中進(jìn)行（300mL有效體積）。C.pyrenoidosa接種生物量為0.20g·L-1。葡萄糖及乙酸鈉的濃度分別設(shè)置為1、2.5、5、10g·L-1及20g·L-1，對應(yīng)的處理名分別為MG-1、MG-2、MG-3．MG-4、MG-5和MS-1、MS-2、MS-3、MS-4、MS-5。試驗在恒溫室光照培養(yǎng)架上開展，光源為LED（暖白光，色溫4500K），光照強(qiáng)度為（100+5）umol·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度為（26.5±0.5）℃，光暗周期為12h：12h。當(dāng)某一組有機(jī)碳源耗盡時，試驗結(jié)束。試驗分別對各處理組微藻生理指標(biāo)、光合性能等進(jìn)行測定。

1.4分析項目與方法

試驗過程中每24h取樣10mL，置于10mL規(guī)格離心管中。在4℃下以8000r·min-1轉(zhuǎn)速離心10min（Centrifuge 5430R，Eppendorf公司，德國），固液分離后上清液置于50mL規(guī)格離心管中，底部沉淀加等量去離子水搖勻后重復(fù)離心操作一次，再收集上清液，沉淀部分重懸于10mL去離子水，其中3mL用于測定微藻生物量，3mL用于分析葉綠素?zé)晒猓‵v/Fm、P5Ⅱ、NPQ、NO），4mL用于測定色素含量，分離收集的上清液經(jīng)0.22um孔徑水系濾膜過濾后測定沼液水質(zhì)指標(biāo)（COD、NH4-N、TN、TP）和殘留葡萄糖。

1.4.1微藻生物量的測定

微藻生物量通過分光光度法（UV-1200紫外一可見分光光度計，MRCY公司，上海）確定，測得藻液在波長680nm下的吸光度OD680，3株微藻生物量干質(zhì)量與吸光度OD680的線性關(guān)系式分別為：

1.4.2葡萄糖的測定

采用DNS試劑盒（Solarbio公司，北京）檢測上清液中殘留葡萄糖，參考3，5-二硝基水楊酸比色法：取1 mL過濾后的上清液，加入2mL DNS試劑進(jìn)行混合，100℃水浴加熱5min（HH-4號恒溫水浴鍋，國華公司，南京），冷卻至室溫后加入9mL去離子水稀釋，最后利用紫外一可見一近紅外分光光度計在540nm波長下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測上清液中的葡萄糖濃度。

1.4.3蛋白質(zhì)的測定

微藻細(xì)胞蛋白含量采用Lowry法蛋白試劑盒（So-larbio公司，北京）測定：取2 mL藻液于離心管內(nèi)，在4℃、8000r·min-1條件下離心10min后棄去上清液，加入1mL細(xì)胞裂解液（Solarbio公司，北京）于冰浴環(huán)境超聲破碎（JY92-IIN，Scientz公司，寧波），功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次。破碎完畢后在4℃、6600r·min-1條件下離心10min，取上清液加入反應(yīng)試劑，于37℃放置30min，利用分光光度法在750nm波長下根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測上清液中的蛋白質(zhì)濃度。

1.4.4脂質(zhì)的測定

取40mg冷凍干燥（Alpha 1-2 LD，Christ公司，德國）藻粉加入3mL混合提取劑（V氯仿：V甲醇=2：1），振蕩提取5min，靜置15min，重復(fù)操作3次，靜置30min后倒入50mL離心管，在4800r·min-1下離心5min。收集上層清液倒入新試管中，底部藻渣重復(fù)提取兩次。最后，將9mL上清液倒入50mL離心管中，加入3mL甲醇和5.4mL水（V水：V氯仿：V甲醇=1.8：2：2）?；靹蚝?，重復(fù)離心2min，最后取底層液體置于事先稱質(zhì)量的樣品瓶中，干燥并稱質(zhì)量。脂質(zhì)含量的計算方法見式（4）：

1.4.5水質(zhì)指標(biāo)的測定

沼液水質(zhì)指標(biāo)采用國家環(huán)境保護(hù)總局規(guī)定的方法測定，其中，化學(xué)需氧量（COD）按重鉻酸鹽法測定，氨氮（NH4-N）按納式試劑分光光度法測定，總氮（TN）按堿性過硫酸鉀分光光度法測定，總磷（TP）按鉬酸銨分光光度法測定。

1.4.6微藻色素含量的測定

葉綠素a、葉綠素b的測定依據(jù)王學(xué)奎等研究中記載的方法。樣品在4℃下用95%乙醇萃取24h后，利用分光光度法，以95%乙醇溶液標(biāo)0，分別測定665、649nm波長下的吸光度，計算方式如式（5）-式（7）所示：

1.4.7微藻葉綠素?zé)晒獾臏y定

葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)參數(shù)的測定采用藻類熒光測量儀（AquaPen-C AP 110-C，PSI公司，捷克），藻液暗適應(yīng)時間為15min。直接測量參數(shù)包括最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（表示藻細(xì)胞的健康狀況和受脅迫程度）、PSⅡ?qū)嶋H量子產(chǎn)量PSⅡ（實(shí)際光合效率）、光化學(xué)淬滅參數(shù)q及非光化學(xué)猝滅參數(shù)NPQ。調(diào)節(jié)性能量耗散量子產(chǎn)量NPQ（熱耗散能力）、非調(diào)節(jié)性能量耗散量子產(chǎn)量NO（光損傷恢復(fù)能力）通過式（8）、式（9）計算獲得：

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析；采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗和單因素方差分析（ANOVA）；采用Origin 2019軟件進(jìn)行圖形繪制。所有試驗處理設(shè)置3個重復(fù)，以Plt;0.05表征組間顯著性差異。

2結(jié)果與討論

2.1 3株微藻在沼液中的生物量積累及生化組分

圖1a為3株微藻在沼液中自養(yǎng)及兼養(yǎng)的生長曲線。C．sp.、C.pyrenoidosa、Scenedesmus sp．在沼液兼養(yǎng)生長的生物積累量較光合自養(yǎng)分別提高了5.40、5.05倍及5.67倍。可見，微藻兼養(yǎng)生長下，光合磷酸化和氧化磷酸化的協(xié)同代謝產(chǎn)能促進(jìn)了生物量的積累。兼養(yǎng)模式下C.pyrenoidosa表現(xiàn)出了更高的耐污能力，培養(yǎng)周期內(nèi)生物量達(dá)到了1.51g·L-1，生長性能顯著優(yōu)于C. sp（0.51g·L-1）和Scenede.smus sp.（1.23g·L-1）（Plt;0.05），且高于吳曉梅等以豬場沼液培養(yǎng)的蛋白核小球藻（1.32g·L-1）?？梢?，兼養(yǎng)培養(yǎng)策略可通過微藻生物量的快速積累以應(yīng)對接種初期沼液的脅迫環(huán)境。

3株微藻在自養(yǎng)、兼養(yǎng)兩種培養(yǎng)模式下的生化組分如圖1b所示。3株微藻在兼養(yǎng)培養(yǎng)下蛋白質(zhì)含量較自養(yǎng)組普遍低1%-5%（Plt;0.05），其中，P-Csp的細(xì)胞相對蛋白含量最高，達(dá)545.13mg·g-1。有研究表明，微藻在兼養(yǎng)培養(yǎng)下更多的碳用于淀粉合成，而不是蛋白質(zhì)合成。同時，不同藻種在兼養(yǎng)代謝下合成蛋白質(zhì)的潛力也有很大不同，目前關(guān)于兼養(yǎng)微藻蛋白質(zhì)積累方式和途徑的相關(guān)研究較少，仍需進(jìn)一步研究解析這一過程。從圖2b中可以看出微藻在不同培養(yǎng)模式下脂質(zhì)積累也有較大差異，兼養(yǎng)組脂質(zhì)含量均高于自養(yǎng)組（Plt;0.05）。這是由于微藻利用葡萄糖進(jìn)行TCA循環(huán)路徑會產(chǎn)生大量磷酸二羥丙酮，從而合成更多的甘油磷脂。因此，微藻在不同的營養(yǎng)方式下的生化組分有所差異，正如Liu等的試驗中，在城市廢水中兼養(yǎng)培養(yǎng)的柵藻脂質(zhì)含量提升了2.40倍，與本試驗結(jié)果均表明兼養(yǎng)代謝途徑更有利于脂質(zhì)積累。

2.2 3株微藻在沼液中生長的色素含量變化

葉綠素a是光反應(yīng)中心的光合活性色素，而葉綠素b則是擴(kuò)展光吸收范圍的輔助色素，兩者都是主要光合捕光色素。葉綠素含量的變化能夠直觀地反映微藻細(xì)胞光合系統(tǒng)對光能的需求與利用。由圖2可知，在整個生長周期，3株微藻自養(yǎng)組的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量普遍高于兼養(yǎng)組（Plt;0.05）。對于光合自養(yǎng)，當(dāng)沼液養(yǎng)分逐漸被藻細(xì)胞同化降解，介質(zhì)透光改善，捕光色素在培養(yǎng)中期的合成有所放緩。在培養(yǎng)后期，C.pyrenoidosa和Scenedesmus sp．生物量分別達(dá)到了1.51g·L-1和1.24g·L-1，微藻細(xì)胞相互遮蔽，導(dǎo)致大量藻細(xì)胞處于弱受光狀態(tài)，因此需要合成大量的葉綠素來捕獲光能，兩者7d總?cè)~綠素分別提高76%、25%（圖2c）；在兼養(yǎng)模式下，微藻光能攝取更加靈活，隨著沼液營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，介質(zhì)光透性提高，藻細(xì)胞受光程度增強(qiáng)，光合磷酸化代謝路徑產(chǎn)能隨之增加。當(dāng)光合效率處于較低水平時，微藻的碳代謝途徑加強(qiáng)，強(qiáng)化氧化磷酸化以彌補(bǔ)光合作用削弱而減少的能量獲取。因此，3株微藻的兼養(yǎng)組均表現(xiàn)出葉綠素持續(xù)下降，表明隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，光合作用產(chǎn)能需求在不斷降低。同行的研究中也發(fā)現(xiàn)，微藻在以甘油作為有機(jī)碳源的兼養(yǎng)培養(yǎng)下，藻細(xì)胞葉綠素含量顯著低于自養(yǎng)培養(yǎng)。葉綠素合成的減少是沼液微藻兼養(yǎng)代謝下光合、氧化磷酸化協(xié)同作用的標(biāo)志之一。

2.3 3株微藻兼養(yǎng)、自養(yǎng)下對沼液污染物的去除

3株微藻在自養(yǎng)、兼養(yǎng)下對于沼液污染物的去除如圖3所示，C．pyrenoidosa、Scenedesmus sp．在兼養(yǎng)下對于COD的去除率達(dá)81.33%和75.71%，較自養(yǎng)組分別提高了20、33個百分點(diǎn)（圖3a），表明了外源有機(jī)碳的供給促進(jìn)微藻生物量積累的同時能夠協(xié)同提升沼液COD去除。C．sp、C.pyrenoidosa、Scenedesmus sp．在兼養(yǎng)培養(yǎng)下TP的去除率較自養(yǎng)分別提高了51、32、24個百分點(diǎn)（圖3b）。對于兼養(yǎng)試驗組，TP在培養(yǎng)前2d的快速去除主要源于微藻生長過程存在的“磷奢侈攝取”現(xiàn)象：當(dāng)培養(yǎng)液磷養(yǎng)分豐富時，微藻超量攝入磷并以聚合磷酸鹽形態(tài)儲存于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)磷缺乏時則通過分泌堿性磷酸酶將聚合磷酸鹽分解為具有生理活性的正磷酸鹽以保證藻細(xì)胞的生長需求。

在豬糞沼液中，相較于純培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)氮源硝態(tài)氮，氨氮無需經(jīng)硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶轉(zhuǎn)化，因而更易于微藻攝取，但過量的NH4-N會對微藻產(chǎn)生毒性，抑制細(xì)胞生長和光合作用，甚至導(dǎo)致死亡。C．sp、C.pyrenoidosa、Scenedesmus sp．在兼養(yǎng)培養(yǎng)下的NH4-N和TN去除率較自養(yǎng)分別提高了0.21倍和0.49倍、0.36倍和0.41倍、0.26倍和0.46倍（圖3c、3d）。結(jié)果表明，微藻兼養(yǎng)可以提高沼液氨氮去除水平，且3株微藻中C．pyrenoidosa具備更強(qiáng)的沼液抗逆性及污染去除能力，對COD、TP、NH4-N的7d去除率分別高達(dá)81.33%、78.51%、88.25%。本試驗結(jié)果表明有機(jī)碳源的補(bǔ)給，通過碳代謝產(chǎn)能促進(jìn)了微藻的生物量積累，協(xié)同提高了對C、N、P的去除效率，實(shí)現(xiàn)沼液的深度凈化。

本試驗證明了兼養(yǎng)策略是沼液微藻生物修復(fù)的可行手段。且所用的3株兼養(yǎng)微藻中C.pyrenoidosa在豬糞沼液中兼養(yǎng)生長具備明顯的生物量優(yōu)勢，因此針對C.pyrenoidosa進(jìn)一步展開不同代謝途徑有機(jī)碳源施用的效果研究。

2.4不同有機(jī)碳源條件下C．pyrenoidosa的生長動力學(xué)及生化組分分析

目前已知兼養(yǎng)微藻可通過檸檬酸循環(huán)（TCA）和乙醛酸循環(huán)（GAC）兩種途徑分別對糖類和乙酸鹽加以同化利用。葡萄糖因其高利用率而被廣泛研究，被認(rèn)為是微藻培養(yǎng)的第一有機(jī)碳源。而在有機(jī)碳資源中，乙酸鈉是工業(yè)生產(chǎn)的一種廉價的化學(xué)副產(chǎn)品，價格低廉且易于獲取，被認(rèn)為可能是最有應(yīng)用前景的一種微藻培養(yǎng)碳源。本研究選用這兩種典型有機(jī)碳源作為兼養(yǎng)模式碳源。不同有機(jī)碳源條件下C.py-renoidosa生長情況如圖4a所示。

C．pyrenoidosa的生物量與葡萄糖濃度呈正相關(guān)，20 g-L。1的初始葡萄糖濃度下生物量最高（達(dá)1.03g·L-1）。這是由于在沼液中C.pyrenoidosa的光合作用受到抑制，其生長高度依賴外源有機(jī)碳提供能量。1mol葡萄糖通過TCA循環(huán)可生成25分子ATP，隨著葡萄糖濃度的提高，藻細(xì)胞碳代謝產(chǎn)生的ATP隨之增加，可直接促進(jìn)藻生物量積累。然而1mol乙酸鈉通過GAC循環(huán)只能生成5分子ATP，能量供給方面弱于葡萄糖。此外，藻類光合作用高度依賴C02的可用性，它直接影響C3分子的合成。但沼液中低濃度的溶解態(tài)C02（約0.04%）限制了微藻光合生長的碳供應(yīng)速率。藻細(xì)胞通過TCA循環(huán)可提供細(xì)胞內(nèi)源C02供給葉綠體中卡爾文循環(huán)，提高C3分子的合成效率。但乙酸鈉進(jìn)行GAC循環(huán)相較于糖代謝缺少兩個產(chǎn)生C02的酶促反應(yīng)，無C02合成。結(jié)合試驗結(jié)果及從能量合成和內(nèi)源性C02供給推測，以乙酸鈉為碳源時無法形成較好的光合一碳代謝的協(xié)同增益，以滿足Cpyrenoidosa在沼液中的兼養(yǎng)生長與抗逆。

由圖4a、圖4d可知，1-2.5g·L-1葡萄糖濃度下C．pyrenoidosa具有較高的單位生物量產(chǎn)率，其中，1g·L-1葡萄糖濃度下單位有機(jī)碳生物量產(chǎn)率達(dá)到0.35g·g-1，是20g·L-1葡萄糖濃度的5.76倍。但低濃度碳源并不能滿足C.pyrenoidosa后續(xù)生長的碳需求，濃度過高也會引起底物抑制，使酪氨酸羥化酶、乙酰膽堿脂酶等多種酶的活性降低約20%。同時，有機(jī)碳源的高濃度投加，不僅提高了投入成本，亦會增加沼液有機(jī)負(fù)荷提升污染風(fēng)險。因此，適宜的有機(jī)碳源濃度對于平衡光合作用與碳代謝比率至關(guān)重要。正如Pang等的文章中提到，為了在沼液微藻兼養(yǎng)培養(yǎng)下實(shí)現(xiàn)有機(jī)碳源的高效轉(zhuǎn)化，分批投加碳源可能是更為高效的碳源供給策略。

從各處理組C．pyrenoidosa的生化組分積累差異（圖4b）可以看出，C．pyrenoidosa的蛋白相對含量與有機(jī)碳源濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，MG-5組和MS-5組蛋白相對含量分別比MG-1組和MS-1組低9個和8個百分點(diǎn)。這是因為沼液本身碳、氮比例失衡，碳源的投加放大了元素相對含量差異，高碳、低氮的介質(zhì)環(huán)境會減弱藻細(xì)胞合成氨基酸的能力，從而導(dǎo)致藻細(xì)胞蛋白相對含量降低。脂質(zhì)相對含量與有機(jī)碳源濃度則呈正相關(guān)關(guān)系，以葡萄糖作為有機(jī)碳源的處理組更為顯著，MG-5組脂質(zhì)細(xì)胞相對含量達(dá)到24.16%，比MG-1處理組高10個百分點(diǎn)左右。正如Kanda等研究發(fā)現(xiàn)，微藻在兼養(yǎng)代謝下，過剩的碳流會傾向于碳水化合物和脂質(zhì)的合成，能量多以脂粒的形式儲存在藻細(xì)胞中。而乙酸鈉作為碳源進(jìn)行GAC循環(huán)路徑會消耗2分子的脂肪酸，合成糖異生的原料，從而導(dǎo)致C.pyrenoidosa的生化組分相對差異較小。因此，在沼液兼養(yǎng)培養(yǎng)微藻中，不同代謝路徑的碳源及其濃度對微藻細(xì)胞目標(biāo)組分積累具有重要影響。類似的研究中，Kong等利用小球藻以復(fù)合碳源（甘油和葡萄糖）為有機(jī)底物，刺激了小球藻脂質(zhì)和可溶性碳水化合物的生物合成，光合色素和蛋白質(zhì)的合成代謝減少，與本試驗結(jié)果表述一致。

2.5兩種不同濃度有機(jī)碳源條件下C．pyrenoidosa的光合性能分析

盡管已有一些文獻(xiàn)報道在不同脅迫條件下純培養(yǎng)自養(yǎng)微藻的葉綠素?zé)晒馀c光合性能差異，但仍缺乏關(guān)于沼液兼養(yǎng)培養(yǎng)微藻過程的葉綠素?zé)晒庖?guī)律研究。對于微藻來說，即使處于太陽能轉(zhuǎn)換最大理論效率（約11%）的情況下，外細(xì)胞層也會出現(xiàn)光能的高耗散率（gt;80%），未被利用的能量會激活光保護(hù)機(jī)制，這種高能量耗散是由于暗反應(yīng)期間能量吸收和利用之間的不匹配造成的。葉綠素?zé)晒鈪?shù)可清晰表征沼液微藻在不同代謝模式下的光合特性和能量流。由圖5a、圖5b所示，當(dāng)微藻利用葡萄糖進(jìn)行TCA循環(huán)時，C.pyrenoidosa在沼液中兼養(yǎng)生長的PSⅡ最大量子產(chǎn)量和實(shí)際量子產(chǎn)量均處于較高水平，達(dá)到0.60-0.68、0.21-0.22，顯著高于施用乙酸鈉的各處理組（Plt;0.05），與生物量趨勢保持一致（圖4a）?？梢姡谴x不僅提升了C.pyrenoidosa的異養(yǎng)代謝水平，也強(qiáng)化了沼液中微藻的光合性能。沼液中高氨氮、光衰減等脅迫條件導(dǎo)致兼養(yǎng)微藻通過光合、氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP大量地被用于解除生長抑制，但C．pyre-noidosa利用乙酸鈉通過GAC循環(huán)途徑的產(chǎn)能較葡萄糖代謝更少，使得其熒光猝滅幾乎全部流向光化學(xué)過程，而熱耗散則一直處于較低水平，因而乙酸鈉組QNPQ遠(yuǎn)低于葡萄糖組（43%-80%，圖5c）；另一方面，沼液的弱透光性導(dǎo)致微藻對于光子能量的吸收受到阻礙，長時間光照反而會在達(dá)到光飽和點(diǎn)后損害光反應(yīng)中心，不利于光系統(tǒng)損傷恢復(fù)。乙酸鈉組的NO普遍高于葡萄糖組（7%-10%，圖5d），正是這種弱光環(huán)境下持續(xù)光照所引發(fā)的光系統(tǒng)恢復(fù)機(jī)制受損導(dǎo)致的。本試驗表明，在透光性較弱的沼液介質(zhì)中兼養(yǎng)培養(yǎng)微藻，以三羧酸循環(huán)路徑進(jìn)行代謝過程的葡萄糖作為有機(jī)碳源通過氧化磷酸化產(chǎn)能不僅可彌補(bǔ)光照不足時細(xì)胞的能量需求，也能在一定程度上強(qiáng)化持續(xù)光照后的光系統(tǒng)損傷恢復(fù)機(jī)制，協(xié)同提升微藻的光合性能。

3結(jié)論

（1）本研究所考察的三株微藻中，C．pyrenoidosa在沼液中展現(xiàn)出最佳的生物量及養(yǎng)分去除優(yōu)勢，培養(yǎng)7d生物量可達(dá)1.51g·L-1，為光合自養(yǎng)的5.40倍，沼液COD、NH4-N、TN、TP去除率較光合自養(yǎng)分別能提高20、36、41、32個百分點(diǎn)。

（2）與乙酸鈉相比，以檸檬酸循環(huán)為主要代謝路徑的葡萄糖更適宜作為C pyrenoidosa在沼液中兼養(yǎng)生長的有機(jī)碳源，且葡萄糖濃度與利用效率呈負(fù)相關(guān)：5-10g·L-1的葡萄糖濃度下有機(jī)碳源利用率較低，而1g·L-1的葡萄糖濃度下C．pyrenoidosa具有最高的單位生物量產(chǎn)率。

（3）在沼液中，兼養(yǎng)C．pyrenoidosa通過代謝葡萄糖會協(xié)同提升光合性能，使得PSⅡ最大量子產(chǎn)量、實(shí)際量子產(chǎn)量、調(diào)節(jié)性能量耗散量子產(chǎn)量等維持較高水平。以葡萄糖為碳源時，氧化磷酸化代謝不僅可彌補(bǔ)光照不足時細(xì)胞的能量需求，也能在一定程度上強(qiáng)化持續(xù)光照后的光系統(tǒng)損傷恢復(fù)機(jī)制。

（4）利用兼養(yǎng)策略培養(yǎng)沼液微藻可在大幅強(qiáng)化藻生物量積累的同時協(xié)同提升沼液污染物去除，是具備良好可行性的沼液資源化利用模式，有較好的應(yīng)用前景。