摘要： 為了解不同生長時(shí)期灰樹花（Grifola frondosa）菌絲體的代謝產(chǎn)物差異及其通路，該研究采用HPLC-MS/MS分析方法對(duì)培養(yǎng)10、20、30 d的灰樹花菌絲體進(jìn)行分析。結(jié)果表明：（1）共42類584種代謝物被鑒定出，其中159種、47種和165種代謝物在對(duì)照組（10 d vs 20 d、20 d vs 30 d、10 d vs 30 d）中表現(xiàn)出不同的積累模式，不同培養(yǎng)時(shí)間的代謝物成分差異顯著。（2）培養(yǎng)10 d產(chǎn)生較多與促進(jìn)菌絲體生長和氧化供能有關(guān)的物質(zhì)，培養(yǎng)20 d產(chǎn)生或積累了多種對(duì)人體有益的次生代謝物，如橄欖苦甙、甘膽酸、N-甲基酪胺、Alprazolam，培養(yǎng)30 d菌絲體中含有多種與產(chǎn)生香氣有關(guān)的物質(zhì)。（3）KEGG代謝通路富集分析，10 d vs 20 d比較組、20 d vs 30 d比較組和10 d vs 30 d比較組分別富集到163條、81條、137條代謝通路，氨基酸代謝在菌絲體不同培養(yǎng)時(shí)間中的影響最大。該研究初步探索了灰樹花菌絲體的差異代謝物及代謝通路，并發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)時(shí)間灰樹花菌絲體代謝產(chǎn)物具有明顯的差異，以及菌絲體中部分成分含量與培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，對(duì)灰樹花菌絲體的質(zhì)量控制和機(jī)理研究具有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞： 灰樹花菌絲體， 培養(yǎng)時(shí)間， 代謝產(chǎn)物， 代謝通路， HPLC-MS/MS

中圖分類號(hào)： Q946文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 1000-3142（2024）07-1337-15

Metabolomic analysis of Grifola frondosa myceliumin different culture periods

LIU Jinrong1，2， ZHANG Yancheng2， LIU Yan2， ZHANG Qiang3，L Huqiang3，4， MOU Guangfu2*

（ 1. College of Life Sciences， Guangxi Normal University， Guilin 541006， Guangxi， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Plant Conservationand Restoration Ecology in Karst Terrain， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academyof Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China; 3. Department of Pharmacognosy， Pharmacy School， Guilin MedicalUniversity， Guilin 541199， Guangxi， China; 4. Xi’an Research Institute of Chinese Lacquer Under AllChina Federation of Supply and Marketing Cooperatives， Xi’an 710061， China ）

Abstract： To gain a comprehensive understanding of the metabolite differences and metabolic pathways involved in the mycelium of Grifola frondosa during various culture periods， this study employed HPLC-MS/MS analysis to thoroughly investigate the mycelium cultured for 10， 20， 30 d. The results were as follows： （1） We identified a total of 584 metabolites belonging to 42 different categories. Notably， among these metabolites， 159， 47， and 165 metabolites exhibited distinct accumulation patterns in the control comparison groups of 10 d vs 20 d， 20 d vs 30 d， and 10 d vs 30 d， respectively. This significant variation in metabolite composition across different culture periods suggested that the metabolic activities of the mycelium were dynamically changing as it grew. （2） During the early stage of culturing （10 d）， the mycelium produced a higher concentration of metabolites related to promoting its growth and oxidative energy supply. As the culture progressed to 20 d， the mycelium began to produce or accumulate various secondary metabolites that were beneficial to humans. These included compounds like oleuropein， glycyrrhetic acid， N-methyltyramine， and alprazolam， which were known for their biological activities and potential in health benefits. As the culture progressed to 30 d， the mycelium contained multiple compounds were associated with aroma production. （3） To further understand the underlying metabolic processes， we conducted KEGG metabolic pathway enrichment analysis. This analysis revealed that the comparison groups of 10 d vs 20 d， 20 d vs 30 d， and 10 d vs 30 d were enriched in 163， 81， and 137 metabolic pathways， respectively. Among these， amino acid metabolism emerged as the most significantly influenced pathway in different culture periods， and this finding underscored the importance of amino acid metabolism in driving the metabolic activities of the mycelium during its growth cycle. In conclusion， this study initially explores the differential metabolites and metabolic pathways of the mycelium of G. frondosa， and finds that there are significant differences in the metabolites of the mycelium of G. frondosa in different culture periods， and that the contents of some components in the mycelium is related to the culture time， which has a certain reference value for the quality control and mechanism research of the mycelium of G. frondosa.

Key words： mycelium of Grifola frondosa， culture time， metabolite， metabolic pathway， HPLC-MS/MS

灰樹花（Grifola frondosa），又名貝葉多孔菌、舞茸、栗茹、栗蘑、云蕈，隸屬于蘑菇綱（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales），灰樹花孔菌科（Grifolaceae），樹花孔菌屬（Grifola）。最新研究的觀點(diǎn)（謝雪嬌等，2024），產(chǎn)自中國的灰樹花學(xué)名為灰樹花（Grifola albicans f. huishuhua）。灰樹花子實(shí)體肉質(zhì)、脆嫩，呈珊瑚狀分枝，多生長在闊葉樹的樹樁或樹干周圍。灰樹花中含有豐富的天然活性成分，如多糖（糖蛋白）、核苷類、多酚、氨基酸等活性物質(zhì)，其中灰樹花多糖的藥理活性研究較為深入（趙小坤等，2023）?；覙浠ň哂锌鼓[瘤（Adachi et al.， 1987）、誘導(dǎo)干擾素合成（熊雯宇等，2022）、改善人體免疫功能（張婷，2021）及抗病毒（肖建勇等，2022）等多種藥理作用。此外，灰樹花營養(yǎng)豐富、味道鮮美，野生灰樹花在很久以前就被采擷食用（徐錚奎，2010），現(xiàn)作為一種藥食兩用真菌，深受人們喜愛，被稱為“食用菌之王”（Chen， 2015）。

灰樹花深層發(fā)酵菌絲體具有與子實(shí)體相近的營養(yǎng)組成（周昌艷等，2001）和藥理作用（張醫(yī)芝，2017），可替代子實(shí)體作為產(chǎn)品原料。目前，國內(nèi)對(duì)灰樹花菌絲體的研究主要集中在不同發(fā)酵液成分對(duì)菌絲體生長的影響（鐘敏，2018）、活性成分提取工藝優(yōu)化（黃忠等，2016；鐘敏等，2017）、轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)（王偉科等，2016）等方面，關(guān)于灰樹花菌絲體生長過程中代謝物途徑的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。代謝物是菌絲體藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)不同發(fā)育階段差異代謝物種類和表達(dá)在不斷變化，厘清灰樹花菌絲體在不同培養(yǎng)時(shí)間代謝物的變化將有利于活性物質(zhì)的適時(shí)采收和菌種的維護(hù)。

代謝組學(xué)是一種研究微生物代謝產(chǎn)物差異及代謝機(jī)理的重要方法，同時(shí)，因其具有靈敏度高、精密度好等特點(diǎn)，而在大型真菌領(lǐng)域越來越受重視（鄭煥等，2023）。代謝組學(xué)研究方法在大型真菌中的應(yīng)用，主要集中在研究大型真菌在不同生長時(shí)期或受到某種刺激前后所有小分子代謝產(chǎn)物的相應(yīng)變化，進(jìn)而揭示多種大型真菌的代謝規(guī)律（Zhang et al.， 2019；Li et al.， 2019；Wangsawat et al.， 2021）。Sato等（2017）對(duì)不同木屑培養(yǎng)基中兩種灰樹花子實(shí)體進(jìn)行CE-MS代謝組學(xué)分析，揭示了兩種培養(yǎng)基中子實(shí)體初級(jí)代謝物的變化情況；雷露等（2020）運(yùn)用UPLC-QTOF-MS結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析的方法，探討了添加天麻苦蕎復(fù)配液對(duì)灰樹花菌體代謝產(chǎn)物的差異，并發(fā)現(xiàn)添加天麻苦蕎復(fù)配液有助于增加灰樹花胞外多糖產(chǎn)量和提升發(fā)酵液的營養(yǎng)價(jià)值與功能特性。本研究以培養(yǎng)10、20、30 d的灰樹花菌絲體為研究對(duì)象，采用非靶向代謝組學(xué)（HPLC-MS/MS）分析方法，研究灰樹花菌絲體不同生長階段的代謝產(chǎn)物，探討灰樹花菌絲體不同生長階段代謝物變化情況，以期為灰樹花菌絲體代謝產(chǎn)物的開發(fā)和生產(chǎn)提供理論參考。

1材料與方法

1.1 供試菌株

子實(shí)體采自廣西姑婆山自然保護(hù)區(qū)殼斗科植物林下（圖1），分離純化后得到菌株，再將測試的灰樹花菌株接種于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d，進(jìn)行菌株的活化。

1.2 培養(yǎng)基配方

GPC固體培養(yǎng)基（g·L-1）配方：20 g葡萄糖，6 g蛋白胨，10 g玉米漿，15 g瓊脂，0.5 g硫酸鎂，蒸餾水1 000 mL。培養(yǎng)基于錐形瓶中攪拌均勻，高溫滅菌，備用。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備采用平板培養(yǎng)法，配制的培養(yǎng)基均為同一批次藥品、試劑以及相同的培養(yǎng)基配方且為同一批次分裝，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。用直徑1 cm的打孔器打孔取同一來源的菌絲塊接至GPC培養(yǎng)基，3個(gè)重復(fù)于同一培養(yǎng)環(huán)境下（同一溫度、濕度等）培養(yǎng)，確保用于測試的菌株除培養(yǎng)時(shí)間不同外，其余培養(yǎng)條件保持一致。

1.3.2 菌絲體鑒定分別夾取培養(yǎng)10、20、30 d培養(yǎng)基內(nèi)部干凈的灰樹花菌絲體，放入1.5 mL的離心管中，按照植物基因組DNA快速提取試劑盒（康維世紀(jì)生物科技股份有限公司，CW0531M，江蘇）的說明書進(jìn)行操作，完成DNA提取。PCR擴(kuò)增ITS片段（ITS4/ITS5），PCR程序：94～95 ℃預(yù)變性4～5 min；94～95 ℃變性40～60 s，52～54 ℃退火40～60 s，72 ℃延伸1.0～1.5 min，33～35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，15 ℃保存。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，將測序的結(jié)果在NCBI上比對(duì)DNA序列，根據(jù)輸出的比對(duì)結(jié)果，初步確定供試菌株所屬的物種，排除樣品污染。在NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇灰樹花及同屬不同種的序列，用 MEGA 11中的Clustal X程序進(jìn)行多序列比對(duì)，用Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 代謝組學(xué)分析樣品制備、提取物分析、代謝物的鑒定、定量分析和生物信息學(xué)分析，均由生工生物工程（上海）股份有限公司（網(wǎng)址：https：//www.sangon.com/）嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行操作。

供試樣品的制備：參考周嬡婷等（2023）和何亞瓊等（2020）的方法，從第10天開始每隔10 d取樣1次直至培養(yǎng)到30 d，每次取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。分別稱取適量樣品于2 mL離心管中，加入鋼珠；加入1 000 μL 50%甲醇水（4 ℃保存），充分混勻后置于2 mL適配器里，浸入液氮充分研磨至粉末狀；將樣品置于4 ℃，12 000 r·min-1 離心10 min；吸取上清液，濃縮干燥，準(zhǔn)確加入300 μL 50%2-氯-L-苯丙氨酸（4 mg·mg-1）溶液復(fù)溶樣品，取上清液過0.22 μm膜進(jìn)行過濾，得供試樣品。

液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm × 150 mm，1.8 μm）（Waters，Milford，MA，USA）；色譜條件：0.25 mL·min-1流速，40 ℃柱溫，進(jìn)樣量2 μL。正離子模式，流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈（B2）和0.1%甲酸水（A2），負(fù)離子模式，流動(dòng)相為乙腈（B3）和5 mmol·L-1甲酸銨水（A3）。梯度洗脫程序：0～1.0 min，2%B；1.0～9.0 min由2%B升至50%B；9.0～12.0 min，由50%B升至98%B；12.0～13.5 min，保持98%B；13.5～14.0 min，由98%B降至2%B；14.0～20.0 min，保持2%B。

質(zhì)譜條件：Orbitrap Exploris 120質(zhì)譜檢測器（Thermo Fisher Scientific，USA），電噴霧離子源（ESI），用正負(fù)離子模式分別采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為-2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度325 ℃，以分辨率70 000進(jìn)行一級(jí)全掃描，一級(jí)離子掃描范圍100～1 000 m/z，并采用HCD進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞能量為30 eV，二級(jí)分辨率為17 500，采集信號(hào)前8的離子進(jìn)行碎裂，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除法去除無必要的MS/MS信息（Trygg et al.， 2002）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Proteowizard軟件包將原始質(zhì)譜下機(jī)文件轉(zhuǎn)換為mzXML文件格式，利用R軟件進(jìn)行峰檢測、峰過濾、峰對(duì)齊處理，得到物質(zhì)定量列表。主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）使用R軟件包Ropl進(jìn)行分析；物質(zhì)的鑒定利用公共數(shù)據(jù)庫HMDB、massbank、LipidMaps、mzcloud、KEGG及自建物質(zhì)庫。根據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)計(jì)算P值、OPLS-DA降維方法計(jì)算變量投影重要度（VIP值）；統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值）使用t檢驗(yàn)來計(jì)算，當(dāng)P值<0.05和VIP值>1時(shí)，認(rèn)為代謝物分子具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1 灰樹花菌絲體鑒定分析

將自測序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示培養(yǎng)10、20、30 d的菌絲體比對(duì)結(jié)果靠前的均為灰樹花。將所取灰樹花菌絲體樣品（GPS10 d、GPS20 d、GPS30 d）與樹花孔菌屬內(nèi)物種ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得的系統(tǒng)樹如圖2所示。由圖2可知，3個(gè)培養(yǎng)時(shí)間的菌株與灰樹花菌株聚為一支，支持率為100，表明所培養(yǎng)的菌絲體為灰樹花菌絲體。

2.2 灰樹花不同生長時(shí)期菌絲體代謝物主成分分析（PCA）

為初步分析灰樹花菌絲體不同生長時(shí)期代謝物積累的差異，對(duì)灰樹花菌絲體代謝物進(jìn)行主成分分析（PCA）。PCA中，正離子和負(fù)離子模式下R2分別為0.515和0.517，均大于0.5，說明實(shí)驗(yàn)建立的PCA模型穩(wěn)定，可以用于代謝差異分析。正負(fù)離子模式下，菌絲體培養(yǎng)10、20、30 d由主成分1（PC 1=35.1%/30.6%）和主成分2（PC 2=16.4%/21.1%）建立的得分圖上有分離趨勢，說明不同培養(yǎng)時(shí)間的代謝產(chǎn)物存在一定差異。其中，培養(yǎng)10 d分別與培養(yǎng)20、30 d的菌絲體樣本差異較大，而培養(yǎng)20 d與30 d樣本差異較小，并且存在部分重疊現(xiàn)象，但總體分離趨勢仍然比較明顯（圖3）。因此，我們推測這是由灰樹花菌絲體在培養(yǎng)20 d和30 d時(shí)體內(nèi)代謝物變化不明顯而造成。

圖4為差異代謝物的聚類熱圖，可以用來推測灰樹花菌絲體已知或未知代謝物的生物學(xué)功能。由圖4可知，在正離子模式下，培養(yǎng)20 d的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別與培養(yǎng)10、30 d聚成兩個(gè)分支，不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲體代謝物組間差異不明顯，但是這種趨勢僅限于培養(yǎng)時(shí)間相近的組，如培養(yǎng)10 d與20 d、20 d與30 d，培養(yǎng)時(shí)間不相近的組之間的差異較為明顯。陰離子模式下，培養(yǎng)10 d聚為一個(gè)分支，其他培養(yǎng)時(shí)間聚為一個(gè)分支，與PCA得分圖推測一樣。

2.3 灰樹花菌絲體代謝物正交偏最小二乘法（OPLS-DA）分析

為了消除隨機(jī)誤差，采用OPLS-DA法進(jìn)一步分析培養(yǎng)10、20、30 d菌絲體的差異代謝產(chǎn)物（Want et al.， 2013），結(jié)果在正離子和負(fù)離子模式下R2Y（cum）和Q2（cum）都接近于1，表明本研究的OPLS-DA模型可以展示灰樹花菌絲體不同培養(yǎng)時(shí)期代謝產(chǎn)物的差異和區(qū)別。

利用OPLS-DA對(duì)鑒定出的代謝物進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5）顯示，消除無關(guān)的組內(nèi)誤差和與研究目的無關(guān)的隨機(jī)誤差后，其組間分離的效果明顯優(yōu)于PCA。除培養(yǎng)20 d外，組內(nèi)分布集中，組內(nèi)樣本重復(fù)性較好。此外，OPLS-DA模型的置換檢驗(yàn)顯示，Q2的回歸直線與y軸的交點(diǎn)在負(fù)半軸，正離子模式R2（0，0.96）、Q2（0，0.13），負(fù)離子模式R2（0，0.96）、Q2（0，0.13），從左到右的藍(lán)色Q2點(diǎn)都低于最右的原始綠色R2點(diǎn)且Q2<0，說明所建立模型可靠性良好，不存在過擬合現(xiàn)象。

2.4 灰樹花菌絲體差異代謝物鑒定

利用HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)灰樹花不同培養(yǎng)階段的菌絲體化學(xué)組分在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行分析，經(jīng)鑒定的灰樹花菌絲體在不同培養(yǎng)時(shí)期中正離子模式下有31 382個(gè)差異代謝物，負(fù)離子模式下有26 659個(gè)代謝物。3個(gè)培養(yǎng)階段的灰樹花菌絲體共篩選出584種差異代謝物，根據(jù)標(biāo)樣的質(zhì)譜信息，對(duì)差異化合物進(jìn)行了鑒定分析（圖6），按一級(jí)分類分屬于42個(gè)類別（表1）。

2.5 差異代謝物分析

2.5.1 不同培養(yǎng)時(shí)間共有差異代謝物分析由表1可知，不同培養(yǎng)時(shí)間的共有差異代謝物中，其他類的組分最多，有108種；在剩余的組分中，羧酸及其衍生物的種類最多，有104種；緊隨其后為脂肪酸（68種）、有機(jī)氧化合物（51種）、苯和取代衍生物（31種）、類固醇和類固醇衍生物（29種）等。由此可見，灰樹花菌絲體中含有豐富的羧酸及其衍生物（氨基酸類化合物），并且培養(yǎng)前期氨基酸的種類比培養(yǎng)后期的種類多。除此之外，核苷酸及其衍生物、有機(jī)氧化合物、類固醇和類固醇衍生物、脂肪酸、苯和取代衍生物等化合物的種類隨培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，說明培養(yǎng)前期含有更加豐富的代謝物。對(duì)于次生代謝產(chǎn)物如黃酮類、酚類和生物堿類物質(zhì)的種類在菌絲體培養(yǎng)各個(gè)時(shí)期保持相似水平。

2.5.2 培養(yǎng)10 d與培養(yǎng)20 d間差異代謝物分析10 d vs 20 d比較組中共鑒定出159種差異代謝物，菌絲體培養(yǎng)10 d較培養(yǎng)20 d含量高的有69種，約有25種初生代謝產(chǎn)物的化學(xué)組分含量高于培養(yǎng)20 d，含量比較高的主要有腺苷酸、維生素B6、維生素B5、維生素B1、胸腺嘧啶、L-蘇氨酸、鳥氨酸、哌啶酸等。其余大部分化學(xué)組分主要為次生代謝物，其中表達(dá)量比較高的主要有海藻糖、葉辛木素、異膽酸、Alprazolam和驅(qū)蛔素等。其中，維生素B5、D-半乳糖、維生素B3、胸腺嘧啶、羥基丙酮酸等差異代謝物在此時(shí)顯著表達(dá)（圖7）。

培養(yǎng)20 d相對(duì)含量高于培養(yǎng)10 d有90種代謝物，約有21種初生代謝物含量高于培養(yǎng)10 d，相對(duì)含量比較高的有4-羥基脯氨酸、維生素B3、維生素B8、D-絲氨酸、瓜氨酸、脫氧胞苷、L-丙氨酰-D-谷氨酰胺、N-甲基酪胺、L-亮氨酸；剩下主要為次生代謝物，主要包括異煙酸、曲酸、鯡油酸、玉紅堿、烯蟲酯、橄欖苦甙、順烏頭酸、莽草酸、千里光堿等化合物。其中，4-羥脯氨酸、N-甲基酪胺、脫氧胞苷、雄酮、D-丙酰基絲氨酸在此時(shí)顯著表達(dá)（圖7）。

2.5.3 培養(yǎng)20 d和培養(yǎng)30 d間差異代謝物分析培養(yǎng)20 d vs 30 d比較組中共鑒定出47種差異代謝物，培養(yǎng)20 d較培養(yǎng)30 d含量高的有27種，包括4種初生代謝物（β-酪氨酸、β-丙氨酰-L-精氨酸、變腎上腺素）和部分次生代謝物（Alprazolam、尸胺、橄欖苦甙、亞麻堿、N-甲基酪胺、亞麻酸等）。其中，3-氨基-4-甲基羥基苯甲酸、Neostigmine、甘膽酸、N1，N8-Bis（4-coumaroyl）spermidine、β-酪氨酸等在菌絲體培養(yǎng)20 d時(shí)顯著表達(dá)。

其余20種成分在培養(yǎng)30 d時(shí)相對(duì)含量比培養(yǎng)20 d高。初生代謝物有維生素B5、γ-L-谷?；?D-丙氨酸，次生代謝產(chǎn)物包括可可堿、別膽酸、氧化石竹烯、金合歡醇、糠酸乙酯。高異檸檬酸、順式-已二烯二酸、維生素B5、二磷酸胞苷等在培養(yǎng)30 d時(shí)顯著表達(dá)（圖8）。

2.5.4 培養(yǎng)10 d和培養(yǎng)30 d間差異代謝物分析培養(yǎng)10 d vs 30 d比較組中共鑒定出165種差異代謝物，培養(yǎng)10 d菌絲體代謝物相對(duì)含量比培養(yǎng)30 d高的有77種，包括異亮氨酸、γ-谷氨酰丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、前列腺素G2、L-苯丙氨酸、β-酪氨酸、L-甲硫氨酸等15種初生代謝物以及甘膽酸、染料木黃酮、橄欖苦苷、密葉辛木素、淺藍(lán)菌素、N-甲基酪胺、Alprazolam、尸胺等次生代謝物，其余88種成分在培養(yǎng)30 d時(shí)相對(duì)含量較高，含量最高的3種代謝物為前列腺素C1、氧化型谷胱甘肽、尿苯丙酸。其中，尸胺、3-氨基-4-羥基苯甲酸、Neostigmine、Alprazolam等代謝物在培養(yǎng)10 d時(shí)顯著表達(dá)，12-氧代植物二烯酸、雄酮、高異檸檬酸等代謝物在培養(yǎng)30 d時(shí)顯著表達(dá)（圖9）。

各培養(yǎng)階段僅有少部分差異代謝物為初生代謝物，約有75%的差異代謝物為次生代謝物。由此可見，次生代謝產(chǎn)物是灰樹花菌絲體培養(yǎng)過程中的主要組分。培養(yǎng)10 d初生代謝產(chǎn)物如維生素B6、維生素B5、維生素B1、胸腺嘧啶、蘇氨酸、鳥氨酸等氨基酸類和維生素類物質(zhì)顯著表達(dá)，但隨著菌絲體的成熟，總的表達(dá)量有所降低。培養(yǎng)20 d橄欖苦甙、甘膽酸、N-甲基酪胺、雄甾酮顯著表達(dá)；培養(yǎng)30 d含量高的化學(xué)組分主要集中在次生代謝物方面，如咖啡因、別膽酸、可可堿、金合歡醇等。

糖類作為灰樹花菌絲體不可忽略的有效成分之一，研究發(fā)現(xiàn)其在培養(yǎng)前期含量較高，鼠李糖、麥芽三糖、景天庚酮糖、D-半乳糖、海藻糖、D-木糖醇6種糖類物質(zhì)僅在10 d vs 20 d比較組檢測到且在10 d表現(xiàn)上調(diào)，說明培養(yǎng)前期糖類顯著表達(dá)。

2.6 KEGG通路富集分析

將組間有KEGG ID的差異代謝物與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配和代謝富集分析，可獲得差異代謝物參與的通路。10 d vs 20 d比較組中富集到163條通路，其中差異顯著（P＜0.05）的代謝通路共49條（圖10：A）。在顯著富集的前20條通路中有7條氨基酸代謝通路顯著富集（圖10：B），分別為氨基酸的生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，β-丙氨酸代謝，組氨酸代謝，丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝，賴氨酸降解，精氨酸生物合成；其余的代謝通路分別有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成，蛋白質(zhì)消化吸收，亞油酸代謝，2-氧羧酸代謝，輔因子的生物合成，鳥氨酸、賴氨酸和煙酸衍生生物堿的生物合成，癌癥的中心碳代謝，礦物質(zhì)吸收，泛酸和輔酶a的生物合成，代謝通路。

20 d vs 30 d比較組中共富集到81條通路（圖10：C），其中差異顯著的代謝通路有12條（圖10：D），包含氨基酸的生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，β-丙氨酸代謝，3條氨基酸代謝通路顯著富集，其余通路為植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、代謝途徑、組氨酸和嘌呤衍生的生物堿的生物合成、輔因子的生物合成、不同環(huán)境下的微生物代謝、咖啡因代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、半乳糖代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成。

10 d vs 30 d比較組中共富集到137條通路（圖10：E），其中差異顯著的代謝通路有26條，在顯著富集的前20條通路中有5條氨基酸代謝通路顯著富集（圖10：F），分別為氨基酸的合成代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、色氨酸代謝；其余的代謝通路分別有亞油酸代謝，鳥氨酸、賴氨酸和煙酸衍生生物堿的生物合成，植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成，植物激素的生物合成，α亞麻酸代謝，輔因子的生物合成，嘧啶代謝，莨菪烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，2-氧羧酸代謝，由組氨酸和嘌呤衍生的生物堿的生物合成，癌癥的中心碳代謝，谷胱甘肽代謝，代謝途徑，玉米素生物合成等代謝通路。

3討論與結(jié)論

3.1 灰樹花菌絲體不同生長時(shí)期差異代謝物

通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)10、20、30 d的灰樹花菌絲體內(nèi)差異代謝物進(jìn)行分析。我們共篩選出42類584種差異代謝物。在灰樹花菌絲體培養(yǎng)10 d時(shí)，氨基酸、維生素、糖類以及核苷酸類化合物的種類和含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長呈下降趨勢。由于含氮化合物主要從培養(yǎng)基中引入，以菌絲體蛋白、核酸、游離氨基酸或幾丁質(zhì)的形式積累在營養(yǎng)菌絲體中，此時(shí)氨基酸表達(dá)量增加，因此培養(yǎng)早期的菌絲體可能是提取游離氨基酸成分的最佳時(shí)期。隨著菌絲體的成熟游離氨基酸可能會(huì)合成其他含氮成分，導(dǎo)致表達(dá)量下降（Terashita et al.， 1984）。維生素具有促進(jìn)菌絲體生長（凌亞飛，2000；賀曉龍等，2014）、減緩細(xì)胞凋亡和修復(fù)損傷的作用，還具有提高菌絲體通透性（張函等，2021）、抑制微生物生長（Grange et al.， 2009；Yan et al.， 2022）的作用，是細(xì)胞正常生命活動(dòng)必不可少的重要成分之一。

糖類和核苷酸類化合物可能具有氧化供能和抗脅迫的作用。海藻糖、AMP分別為本研究菌株糖類和核苷酸的主要成分，與Sato等（2017）研究在不同含鋸末培養(yǎng)基上培養(yǎng)的兩種菌株子實(shí)體的差異代謝物結(jié)論相似。Kong等（2012）研究表明，白靈側(cè)耳經(jīng)外源海藻糖處理后，在高溫條件下受到損傷明顯降低。本研究的灰樹花菌絲體并沒有受到高熱、干燥脅迫處理，但在培養(yǎng)前期海藻糖含量持續(xù)升高，可能是培養(yǎng)時(shí)外界溫度過高導(dǎo)致菌絲體受到一定程度的氧化脅迫所致。Brunton和Gadd（1989）研究發(fā)現(xiàn)，加入一定濃度的核苷酸有助于酵母菌絲體的萌發(fā)，AMP的積累可能與促進(jìn)菌絲體的發(fā)育、氧化供能有關(guān)。

灰樹花菌絲體在培養(yǎng)20 d時(shí)產(chǎn)生或積累了多種對(duì)人體有益的次生代謝物，如橄欖苦甙、甘膽酸、N-甲基酪胺、Alprazolam。橄欖苦甙作為一種天然提取物，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎和抗菌作用，與化學(xué)合成抗生素一樣，是治療和預(yù)防手術(shù)部位感染的替代和輔助藥物。橄欖苦甙可以安全有效地治療和預(yù)防銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌手術(shù)部位感染，特別是在手術(shù)后的早期和后期（Bayaktar & Okyay， 2023）。N-甲基酪胺是由L-酪氨酸脫羧和N-甲基化而形成，已被證明可通過對(duì)胃泌素和胰腺分泌物的刺激作用增強(qiáng)食欲和食物的消化，是一種良好的膳食補(bǔ)充劑（Stohs & Hartman， 2015）。據(jù)報(bào)道，甘膽酸可以抑制炎癥并激活法氏體X受體表達(dá)（Ge et al.， 2023），Alprazolam有抗焦慮、抗抑郁、鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥及肌肉松弛等作用，后續(xù)可進(jìn)一步分離純化這些化合物，充分提高灰樹花的藥用價(jià)值。

培養(yǎng)30 d的菌絲體中含有多種與產(chǎn)生香氣有關(guān)的物質(zhì)，如氧化石竹烯、金合歡醇、糠酸乙酯等?？匪嵋阴ツ墚a(chǎn)花果香香韻及蘑菇似的香氣（趙瑋等，2012）。據(jù)研究，金合歡醇和氧化石竹烯是許多芳香植物香味的貢獻(xiàn)者之一（張美芬等，2023），推測氧化石竹烯、金合歡醇和糠酸乙酯可能與灰樹花菌絲體產(chǎn)生特殊香味有關(guān)，值得關(guān)注的是氧化石竹烯和金合歡醇本身還具有多種抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等活性（袁媛，2019；修志儒，2023）。

本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)不同時(shí)間的灰樹花菌絲體代謝物相對(duì)含量呈先上升后下降的趨勢，代謝物數(shù)量整體呈下降趨勢。這與王倩（2016）和方亮（2022）等不同培養(yǎng)時(shí)間下的粉被瑪利婭霉和暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲體代謝物數(shù)量變化略有不同。我們推測可能是前期培養(yǎng)基營養(yǎng)充足，菌絲體代謝活躍、生長旺盛，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物數(shù)量增加，而培養(yǎng)20 d后由于培養(yǎng)基營養(yǎng)減少，代謝產(chǎn)物為了獲取生長能量通過代謝途徑轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)中后期代謝產(chǎn)物數(shù)量比培養(yǎng)10 d少。此外，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)時(shí)間間隔差距過大，缺乏菌絲體培養(yǎng)前期和后期的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，未能很好地體現(xiàn)灰樹花菌絲體培養(yǎng)各個(gè)時(shí)期的代謝過程，后期應(yīng)該將培養(yǎng)時(shí)間細(xì)化或者有梯度增加，可能會(huì)解決這一問題。

3.2 灰樹花菌絲體不同生長時(shí)期代謝通路

基于數(shù)據(jù)庫對(duì)主要差異代謝物進(jìn)行注釋并研究其相應(yīng)通路，在10 d vs 20 d比較組中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑和氨基酸的生物合成顯著較高且富集的代謝物多，表明其具有較高的代表性。20 d vs 30 d比較組中代表性較高的是代謝途徑，在10 d vs 30 d比較組中代表性較高的是氨基酸生物合成和亞油酸代謝。亞油酸代謝主要與菌絲體的生長發(fā)育、細(xì)胞分化、孢子萌發(fā)有關(guān)（Tsitsigiannis & Keller， 2007；Niu et al.， 2020）；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑與灰樹花菌絲體的關(guān)聯(lián)機(jī)制尚不明確，根據(jù)崔亞忠等（2016）和陳道波等（2021）的研究，我們推測其可能與響應(yīng)非生物脅迫、分生孢子萌發(fā)和菌絲生長以及抵抗有毒物質(zhì)的能力有關(guān)，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)前期酪氨酸、脯氨酸、組氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸大量表達(dá)，與雷露等（2020）統(tǒng)計(jì)發(fā)酵7 d的灰樹花菌絲體代謝組學(xué)研究現(xiàn)象一致。氨基酸除了作為蛋白質(zhì)成分，還參與菌絲體的生長和發(fā)育、抗氧化、代謝能量產(chǎn)生和生物脅迫。趙翰卿等（2020）研究表明，一定濃度的精氨酸和丙氨酸可以促進(jìn)雙孢蘑菇菌絲體的生長，濃度過高對(duì)菌絲體產(chǎn)生抑制。食用菌中氨基酸含量對(duì)其菌絲體生長發(fā)育、品質(zhì)和風(fēng)味等均具有重要影響，菌絲體中的谷氨酸和天冬氨酸可作為天然的鮮味劑且菌株游離氨基酸組分比達(dá)最適狀態(tài)是確保菌株正常生長發(fā)育的重要生理基礎(chǔ)（劉愛民等，2010；王艦等，2023）。

此外，我們發(fā)現(xiàn)3個(gè)比較組均顯著富集到植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑，推測灰樹花菌絲體可能具有類似菌根真菌產(chǎn)生植物激素的能力（王有智和黃亦存，1997）。值得注意的是，灰樹花雖然不像菌根真菌一樣與植物根形成共生體，但和特定植物類群關(guān)系密切，其常與殼斗科植物相伴生，相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，我們認(rèn)為不同培養(yǎng)時(shí)期的灰樹花菌絲體代謝產(chǎn)物具有明顯的差異，菌絲體中部分成分含量與培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)，同時(shí)反映了不同代謝物在灰樹花菌絲體中的表達(dá)趨勢，解析了灰樹花菌絲體不同培養(yǎng)時(shí)期的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制。這不僅豐富了我們對(duì)灰樹花菌絲體不同生長期的代謝物質(zhì)組成和差異的認(rèn)知，還可通過選擇灰樹花菌絲體的最佳收獲時(shí)間對(duì)其進(jìn)行開發(fā)利用，也為根據(jù)代謝物種類和含量差異進(jìn)行深入地開發(fā)灰樹花提供了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯李莉周翠鳴）