摘 要：本文設(shè)計了流式細胞儀和光學系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞的高效分析和檢測。首先，介紹流式細胞儀的原理和結(jié)構(gòu)，重點討論設(shè)計參數(shù)的選擇與優(yōu)化。其次，對鞘流系統(tǒng)進行仿真設(shè)計，以保證流體的穩(wěn)定流動和樣本的準確檢測。再次，設(shè)計激發(fā)光源和光束成形系統(tǒng)并進行驗證，保證光源的穩(wěn)定性和光束的精準成形。最后，對散射光探測光路進行設(shè)計和驗證，以準確捕獲和分析樣本散射光。本文研究可為流式細胞儀和光學系統(tǒng)設(shè)計提供參考。

關(guān)鍵詞：流式細胞儀；鞘流系統(tǒng)；光束成形系統(tǒng)

中圖分類號：TH 77 " " " " " " " 文獻標志碼：A

流式細胞儀是一種先進的生物醫(yī)學檢測設(shè)備，在細胞學研究和臨床診斷中具有廣泛應(yīng)用。光學系統(tǒng)是流式細胞儀的核心部件，會直接影響檢測結(jié)果的準確性和靈敏度。本文設(shè)計了流式細胞儀和光學系統(tǒng)，旨在為提高細胞分析精度和效率提供借鑒，并為生物醫(yī)學領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 流式細胞儀和鞘流系統(tǒng)設(shè)計

1.1 流式細胞儀原理和結(jié)構(gòu)

流式細胞儀是基于流式細胞術(shù)并對微粒進行多參數(shù)分析和分選的儀器。在細胞檢測過程中，將待檢測細胞懸浮液通過細管注入流式細胞儀中，形成單個細胞在流動液體中通過的狀態(tài)。細胞通過時，激光束照射到細胞上，激發(fā)細胞內(nèi)的熒光染料或細胞本身的固有熒光發(fā)射。通過檢測激光散射信號，可以獲取細胞大小、形狀和表面特性等信息。前向散射（FSC）信號與細胞的大小相關(guān)，側(cè)向散射（SSC）信號與細胞的復(fù)雜度和顆粒含量相關(guān)。熒光信號檢測模塊可以檢測細胞內(nèi)標記的熒光染料發(fā)射信號，用于分析細胞內(nèi)特定分子的表達水平或細胞類型等信息[1]。根據(jù)采集的散射和熒光信號數(shù)據(jù)，流式細胞儀可以生成細胞的散點圖、直方圖等圖像，并進行細胞計數(shù)、表型分析和蛋白質(zhì)表達分析等。流式細胞儀的結(jié)構(gòu)有以下5個單元。第一，流動室與液流驅(qū)動單元。該單元是流式細胞儀的核心部件，由鞘液、樣品和流動室組成，能夠保證每個細胞以相等時間通過激光照射區(qū)，進而得到精準的細胞熒光信息。第二，激發(fā)光源與光束整形單元。該單元主要應(yīng)用于臺式機流式細胞儀。為使待測微粒所受光照強度具有一致性，通常將樣本流與激光束進行正交。第三，光學單元。該單元主要是對熒光、散射光進行檢測，由激光激發(fā)系統(tǒng)、前向散射光、側(cè)向散射光以及熒光收集系統(tǒng)組成，能夠?qū)⒉煌ㄩL的光信號送到相應(yīng)的電子探測器中。第四，信號檢測、存儲與顯示分析單元。該單元能夠賦予細胞微粒物理參數(shù)或固有參數(shù)，經(jīng)信號處理后，將相關(guān)信息存儲在計算機硬盤中。第五，細胞分選單元。該單元可以通過偏轉(zhuǎn)板進入相應(yīng)的收集容器，進行細胞分選。分選過程中高頻壓電晶體的頻率較高，其振蕩頻率如公式（1）所示。

f=v/4.5d " " " " " " " " nbsp; " " " "（1）

式中：f為振蕩頻率；v為液流速度；d為液流直徑。

1.2 流式細胞儀設(shè)計參數(shù)

流式細胞儀設(shè)計參數(shù)主要包括熒光分辨率、線性度、分析速度、熒光靈敏度和熒光通道等，具體參數(shù)見表1。

1.3 鞘流系統(tǒng)仿真設(shè)計

流式細胞儀的鞘流系統(tǒng)采用流體聚焦原理，即在待測樣品中快速注入鞘液流，使樣品中的細胞微粒被聚焦成單一流線，并依次通過激光探測區(qū)域[2]。流體聚焦原理可使細胞微粒在流動過程中保持單一流線狀態(tài)，使激光能夠準確地照射到每一個細胞微粒，從而對細胞進行精確檢測和分析。

根據(jù)質(zhì)量守恒定律可知，通過樣品管的流體質(zhì)量與聚焦流中的流體質(zhì)量相等，如公式（2）所示。

V1D1=Vad " " " " " " " " " " " （2）

式中：D1為樣品流入口的直徑；d為聚焦后樣品流的直徑；V1為樣品流的流速；Va為聚焦后樣品流流速。

聚焦后樣品流的直徑d如公式（3）所示。

（3）

式中：ρ出為出口D的平均密度；D為出口；ρ1為樣品密度；ρ2為鞘液密度；V1為進樣口樣品流速；V2為鞘流液入口的流速；D1為樣品流入口直徑；D2為鞘流液和樣品流入直徑。

本文系統(tǒng)設(shè)計應(yīng)用的仿真軟件為Solidworks Flow Simulation流體仿真軟件，以實現(xiàn)鞘流系統(tǒng)設(shè)計目標。模型尺寸如下：進樣口寬度為100μm，鞘流液通道總寬度為140μm，右端廢液出口寬度為160μm，樣品進樣通道長260μm，廢液通道長510μm。仿真條件如下：流體動力黏度為0.000 719 17 Pa·s，

密度為1 000 kg/m3；樣品密度為1 100 kg/m3；氣壓為101 325 Pa；

溫度為293.2 K；把鞘流流速為6 m/s，樣品流速度為4 m/s、7 m/s和10 m/s。仿真結(jié)果顯示，在樣品流速度為4 m/s的情況下，可形成較完美的聚焦流，聚焦效果良好。鞘流系統(tǒng)模型如圖1所示。

2 激發(fā)光源和光束成形系統(tǒng)設(shè)計與驗證

2.1 激發(fā)光源和光束成形系統(tǒng)設(shè)計

激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)由2個激光器、1個雙色性反射鏡、1個柱面鏡以及1個圓透鏡組成。為提升流式細胞儀分辨率，應(yīng)將光斑的縱軸寬度設(shè)定為10μm，橫軸約75μm。在激發(fā)光源選擇中，根據(jù)熒光標記物的吸收光譜，選擇激光器1，波長為640 nm；激光器2，波長為488 nm[3]。同時設(shè)定激光器輸出功率為20 mW。

在光束成形系統(tǒng)設(shè)計中，應(yīng)用zemax光學設(shè)計軟件進行。本文系統(tǒng)利用二向色反射鏡反射640nm波長的激光，并透射488nm的激光，以形成2束激光的合束。在此過程中，2個不同波長的激光器被垂直放置，而二向色反射鏡與640nm紅光激光器、488nm藍光激光器的光軸方向呈45°角。當這2束激光照射到二向色反射鏡時，640nm紅光激光器的光軸發(fā)生90°偏轉(zhuǎn)，488nm藍光激光器則不受影響。經(jīng)過偏轉(zhuǎn)的紅光激光器光軸與藍光激光器光軸會重合，形成了2束不同波長激光器的合束。因為zemax光學設(shè)計軟件可以自動對設(shè)計的系統(tǒng)進行優(yōu)化，所以在優(yōu)化界面中設(shè)定加權(quán)指標為3，拉格朗日指標為0，變量為5，初始MF與當前MF均設(shè)定為0.000，狀態(tài)為Idle，處理器個數(shù)為4個。經(jīng)過優(yōu)化后，目標平面的光斑尺寸為（10×75）μm。

2.2 激發(fā)光源和光束成形系統(tǒng)驗證

為對上述設(shè)計的激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)進行有效驗證，本文應(yīng)用Optisworks軟件進行驗證。聚焦光斑能量分布如圖2所示。圖2的驗證結(jié)果顯示，光斑尺寸約為（10×74.56）μm，與軟件設(shè)計結(jié)果基本一致，可滿足探測需求。

3 散射光探測光路設(shè)計和驗證

3.1 散射光探測光路設(shè)計

激光散射法在諸多領(lǐng)域均有較廣泛的應(yīng)用，能夠測定粒徑和粒徑分布、熒光粉粒徑分布、超細顆粒粒度分布以及物體表面粗糙度，因此本文應(yīng)用激光散射法進行設(shè)計[4]。在該方法下，粒徑與粒徑分布的測定滿足愛因斯坦關(guān)系，如公式（4）所示。

d=k0T/（3πηD） " " " " " " " " " " "（4）

式中：k0為玻爾茲曼常數(shù)；T為溫度；η為溶劑黏度。

流式細胞儀的散射光主要包括前向散射光和側(cè)向散射光。前向散射光是指激光穿過細胞時被細胞前向散射的光線。前向散射光的強度與細胞大小直接相關(guān)，較大的細胞會產(chǎn)生更強的前向散射信號。因此，通過測量前向散射光的強度，可以推斷細胞的尺寸，這對區(qū)分不同類型的細胞并評估其形態(tài)特征非常重要。側(cè)向散射光是指激光在穿過細胞后被細胞側(cè)向散射的光線。側(cè)向散射光的強度與細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度相關(guān)，細胞內(nèi)的顆粒越復(fù)雜，側(cè)向散射光的強度就越高[5]。通過分析側(cè)向散射光信號，可以了解細胞內(nèi)部的顆粒分布情況和結(jié)構(gòu)復(fù)雜度，有助于研究細胞的功能和狀態(tài)。

前向散射探測光路由聚焦透鏡、濾光片華為硅光電池組成。濾光片可以對混合在640 nm散射光信號中的488 nm前向散射光信號進行分離；探測的實現(xiàn)需要通過硅光電池完成。

3.1.1 硅光電池

入射光照射在硅光電池上時，可以獲得的實際電流I如公式（5）所示。

（5）

式中：Iph為反向光電流；ID為正向電流；I0為反向飽和電流；q為電荷數(shù)；v為結(jié)電壓；n為硅光電池PN結(jié)特性參數(shù)的理想系數(shù)，取值為1＜n＜2；kB為玻爾茲曼常數(shù)；T為絕對溫度。

硅光電池的短路電流、開路電壓與光照間的關(guān)系如圖3所示。

斷開硅光電池的輸出端后，開路電壓Voc如公式（6）所示。

（6）

式中：lsc為短路電流；l0為反向飽和電流。

另外，在本文設(shè)計中，硅光電池的光譜響應(yīng)范圍被設(shè)定為450 nm～1 100 nm，其中峰值響應(yīng)波長被設(shè)定為900 nm，即硅光電池對450 nm～1 100 nm的光譜具有響應(yīng)能力，但在波長900 nm處的響應(yīng)最大。該設(shè)定可以確保在特定波長范圍內(nèi)硅光電池的光電轉(zhuǎn)換效率最佳，從而提高太陽能轉(zhuǎn)換效率和性能穩(wěn)定性。

3.1.2 濾光片

設(shè)計濾光片時，本文考慮了硅光電池的光譜響應(yīng)范圍和峰值響應(yīng)波長。根據(jù)是上述硅光電池的光譜響應(yīng)范圍和峰值響應(yīng)波長，可以設(shè)計一個透過450 nm～1 100 nm的光且在900 nm處具有最大透過率的濾光片。因此本文采用多層膜堆疊技術(shù)，通過控制不同層的厚度和材料來實現(xiàn)對特定波長的透過或反射，以最大程度地匹配硅光電池的光譜響應(yīng)特性[6]。此外，還需要增加對其他波長的阻擋，以進一步提高硅光電池的光電轉(zhuǎn)換效率。經(jīng)過精心設(shè)計的濾光片可以優(yōu)化光的利用率，提高硅光電池的性能和穩(wěn)定性，從而高效地進行光電轉(zhuǎn)換。

3.2 散射光探測光路驗證

本文應(yīng)用Optisworks光學仿真設(shè)計軟件對散射光探測光路進行驗證。結(jié)果顯示，聚焦透鏡能夠收集與聚焦前向散射角內(nèi)的光信號，有效過濾掉熒光信號、640 nm波長的激光信號，并能探測前向散射光信號的。仿真結(jié)果如圖4所示。

另外，根據(jù)軟件參數(shù)分析可知，能量分布于1 mm直徑內(nèi)的圓形區(qū)域內(nèi)，能夠滿足硅光電池的探測需求。

4 結(jié)語

本文通過對流式細胞儀和光學系統(tǒng)進行設(shè)計，實現(xiàn)了對細胞的高效分析和檢測，深入理解了流式細胞儀的原理和結(jié)構(gòu)，設(shè)計參數(shù)的選擇與優(yōu)化為提升系統(tǒng)性能奠定了基礎(chǔ)。激發(fā)光源和光束成形系統(tǒng)的設(shè)計和驗證確保了光學系統(tǒng)的穩(wěn)定性和精準性。散射光探測光路的設(shè)計和驗證為準確捕獲和分析樣本散射光提供了重要支持。未來還將進一步改進流式細胞儀和光學系統(tǒng)設(shè)計，并拓展其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用，為科學研究和臨床診斷提供更多可能性。

參考文獻

[1]欒永勝，劉佳琳，劉萍，等.流式細胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng)的設(shè)計與實現(xiàn)[J].分析測試技術(shù)與儀器，2024，30（1）：23-27.

[2]張富麗，田華琴，李宏良，等.光學活體流式細胞儀在腫瘤轉(zhuǎn)移研究中的應(yīng)用（特邀）[J].激光與光電子學進展，2024，61（2）：38-45.

[3]邵雪花，李桂蘭，肖維強，等.基于流式細胞儀鑒定番石榴倍性方法的建立及應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報，2024，40（2）：48-54.

[4]呂英楷，劉文麗，胡志雄.熒光流式細胞儀的標準化研究進展[J].激光與光電子學進展，2023，60（4）：38-50.

[5]張穎.優(yōu)化流式細胞儀濾光片配置的探索[J].中國設(shè)備工程，2022（1）：149-150.

[6]曾希.流式細胞儀在線監(jiān)測系統(tǒng)的設(shè)計[J].醫(yī)療衛(wèi)生裝備，2020，41（12）：44-47.