摘 要：當(dāng)進(jìn)行污水處理廠深度處理生物脫氮技術(shù)研究時(shí)，從不同的環(huán)境來(lái)源采集分離樣品，使用專(zhuān)業(yè)的試劑和方法，從采集的樣品中提取菌株的基因組DNA。提取出的DNA會(huì)經(jīng)過(guò)純化，然后利用PCR技術(shù)擴(kuò)增其中的16Sr DNA基因并進(jìn)行微生物的表型鑒定，即通過(guò)觀察微生物的形態(tài)，進(jìn)一步補(bǔ)充基因鑒定的結(jié)果。對(duì)處理后的污水進(jìn)行水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)，例如pH值、溶解氧、氨氮等。試驗(yàn)結(jié)果表明，污水處理廠深度處理生物脫氮技術(shù)影響因素有3種，碳源、碳氮比、溫度，當(dāng)丙酸鈉為唯一碳源時(shí)，氮去除率可達(dá)85.2%；當(dāng)最佳碳氮比C/N為7時(shí)，氮去除率為94.5%；當(dāng)溫度為20℃～32℃時(shí)，氮基本去除率均達(dá)到95%以上。

關(guān)鍵詞：污水；處理廠；生物脫氮；碳源；碳氮比

中圖分類(lèi)號(hào)：X 703" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

氮是水環(huán)境中重要的污染物，大量釋放可引起水體富營(yíng)養(yǎng)化，導(dǎo)致水藻爆發(fā)，使水里的溶氧減少，對(duì)水生動(dòng)物的生存造成破壞。因此，有效去除污水中的氮素，實(shí)現(xiàn)廢水的達(dá)標(biāo)排放，成為當(dāng)前環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。生物脫氮技術(shù)作為一種高效、環(huán)保的廢水處理方法，在污水處理廠深度處理中得到了廣泛應(yīng)用。這項(xiàng)技術(shù)是通過(guò)微生物的新陳代謝，把含氮化合物從污水中分離出來(lái)，然后釋放到大氣中，從而實(shí)現(xiàn)廢水的凈化[1]。然而，影響生物脫氮的許多因素，例如溫度、碳源、碳氮比等，這些因素會(huì)直接或間接影響微生物的活性，進(jìn)而影響生物脫氮的效率和穩(wěn)定性。因此，研究污水處理廠深度處理生物脫氮技術(shù)及其影響因素，對(duì)提高廢水處理效率、減少氮排放、保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

本文建立了一種生物脫氮濾池的深度處理方案，如圖1所示。試驗(yàn)設(shè)備被分成缺氧濾池和好氧濾池，兩者都是由有機(jī)玻璃制成的，每根柱子的直徑都為60mm，填充物的填充高度為600mm，高徑比為12。試驗(yàn)采用上行式進(jìn)水方式，污水從底層入池，上層溢流排放。在好氧濾池的底部設(shè)置通氣管，以確保足夠的溶解氧。在2個(gè)濾池的底部設(shè)置直徑為8mm～10mm的大顆粒級(jí)生物陶粒；小顆粒級(jí)配生物陶粒在上層均勻分布，顆粒尺寸為3mm～5mm。生物陶粒顆粒尺寸均勻，強(qiáng)度高，表面有許多微孔，內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)交錯(cuò)，不易結(jié)板，具有良好的生物掛膜條件，可以獲得高質(zhì)量的生物膜[2]。

試驗(yàn)主要儀器如下：上海菁海儀器有限公司生產(chǎn)的YP2002N型號(hào)電子天平，用于精確測(cè)量質(zhì)量；澳柯瑪股份公司的BC/BD-217HFA型號(hào)冰箱，用于儲(chǔ)存試驗(yàn)樣本；SANYO品牌的MDF-U53V型號(hào)超低溫冰箱，適用于長(zhǎng)期保存生物樣品；寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠提供的SPX-450型號(hào)生化培養(yǎng)箱，用于微生物培養(yǎng)；Thereto Scientific的4360型號(hào)恒溫?fù)u床，為試驗(yàn)提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DGG-9140B來(lái)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，用于樣品干燥處理；高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-50A由上海博迅實(shí)業(yè)有限公司制造，保障實(shí)驗(yàn)室的無(wú)菌環(huán)境；Eppendorf Research的移液器系列滿(mǎn)足不同體積的液體取用需求；超凈工作臺(tái)ZHJH-C1109B由上海智城分析儀器制造有限公司提供，為試驗(yàn)操作提供無(wú)塵環(huán)境；通風(fēng)櫥KD-1來(lái)自世安SHINE SCIENCE，保障實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)；水質(zhì)測(cè)定儀5B-1來(lái)自連華科技，用于水質(zhì)分析；離心機(jī)Centrifuge 5417C和紫外分光光度計(jì)UV-6000PC分別由Eppendorf Research和METASH上海元析儀器有限公司生產(chǎn)，為試驗(yàn)提供離心和光譜分析功能；連華科技的玻璃比色皿、日立的S-3400N型號(hào)電子顯微鏡、Biolog的GEN III OmniLog ID型號(hào)全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)以及HI 93703-11N型號(hào)濁度儀等。同時(shí)，OLYMPUS的CX21FS1型號(hào)光學(xué)顯微鏡和佳能的a6000型號(hào)相機(jī)為試驗(yàn)的觀察記錄工作提供了便利。Tanon天能的Tanon 1600型號(hào)凝膠成像系統(tǒng)為凝膠分析提供了高效工具。

為了滿(mǎn)足試驗(yàn)需求，準(zhǔn)備特定的試劑和相應(yīng)的培養(yǎng)基，以下是所需材料。

氨氮校準(zhǔn)溶液：量取2.345g硫酸銨，溶解于1000mL去離子水中，制備成氨氮濃度為600mg/L的儲(chǔ)備液。試驗(yàn)時(shí)，取5mL儲(chǔ)備液，稀釋至500mL，即得氨氮濃度為6mg/L的工作溶液。

亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精準(zhǔn)稱(chēng)取0.85g亞硝酸鈉，充分溶解于200mL蒸餾水中，使其保持在1000mL，1mL該溶液含有大約0.25mg亞硝酸氮，放在一個(gè)褐色的瓶子里，加1mL的三氯甲烷，在2℃～5℃保存，保質(zhì)期可達(dá)1個(gè)月。

亞硝氮標(biāo)準(zhǔn)中間液：在50mL容量的亞硝氮標(biāo)樣中精確地定容到250mL，1mL該溶液含有50μg亞硝酸氮，裝在一個(gè)褐色的瓶子里，在2℃～5℃保存，可以維持一個(gè)星期。

亞硝酸鹽氮溶液：取15.00mL的基礎(chǔ)溶液，轉(zhuǎn)移至一個(gè)250mL的量瓶中，加入適量蒸餾水稀釋至刻度線，使溶液總體積達(dá)到250mL。這樣配制的溶液，亞硝酸鹽氮含量為1.50μg/mL。為確保其有效性，建議該溶液配制后立即使用。

氨基磺酸顯色液：在一個(gè)200mL的量筒中，先倒入80mL的蒸餾水，接著按照順序，先添加15mL的鹽酸，隨后是3g的鄰苯二甲酸氫鉀和0.3g的甲萘胺。操作完成后，將此混合液移至一個(gè)1000mL的量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，確保溶液均勻并達(dá)到所需濃度。

硝態(tài)氮儲(chǔ)備溶液：將高純度的NH4NO3精準(zhǔn)稱(chēng)量至0.524g，經(jīng)過(guò)100℃下的3h干燥處理，隨后溶解于蒸餾水中，并精確調(diào)整溶液體積至500mL的刻度線。為保持溶液的穩(wěn)定性，添加1.5mL甲醇作為保護(hù)劑。此溶液在妥善保存條件下可維持5個(gè)月，其硝酸根離子濃度為0.250mg/mL。

LB培養(yǎng)基配方：使用5g蛋白胨、3g酵母浸出物和5g氯化鈉[3]，溶于1L去離子水中，調(diào)整pH值至7.2，隨后在121℃下滅菌15min。如果需要制備固體培養(yǎng)基，就額外添加2%的瓊脂粉。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基配方：采用6g甘油作為碳源，并加入0.8g的NH4NO3、5g的NaCl、0.8g的K2HPO4、0.2g的MgSO4·7H2O和0.02g的MnSO4·H2O，溶解于1L蒸餾水中，調(diào)整pH值至6.8～7.0。滅菌后，如果需要制備固體培養(yǎng)基，就加入1.2%的瓊脂。當(dāng)進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，使用HCl和NaOH來(lái)精確調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。

好氧反硝化培養(yǎng)基配方：使用蔗糖6g作為碳源，添加0.8g NaNO3，總鹽類(lèi)12g，KHP（磷酸氫鉀）0.9g，Mg鹽0.2g，F(xiàn)e鹽0.02g。混合于1L蒸餾水中，調(diào)整pH值至7.2，并進(jìn)行20min的高溫滅菌處理。

50倍TAE緩沖液：含Tris 20g，冰乙酸6mL，EDTA溶液（0.5mol/L）8mL，加水至總量100mL。電泳前須稀釋至1倍濃度使用。

BUG平板：BUG培養(yǎng)基50g，配合1L去離子水，經(jīng)微波處理溶解，再于120℃下滅菌10min，隨后冷卻至約50℃使用。

2%戊二醛溶液：取20%戊二醛2mL，加蒸餾水4mL，再加入0.1mol/L磷酸緩沖液（pH值7.2）4mL，定容至10mL。

PBS緩沖液制備：在1L水中加入1mol/L磷酸氫二鈉80mL和1mol/L磷酸二氫鈉20mL，pH值調(diào)至7.4。

1.2 污水處理廠深度處理生物脫氮方法

1.2.1 分離來(lái)源樣品采集

首先，選取某污水處理廠，稱(chēng)量污水10mL，將200mL的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基滅菌后，置于25℃環(huán)境中，并在120rad/min的搖床上培養(yǎng)4d。期間，每隔24h，以5%的比例進(jìn)行連續(xù)3次的接種傳代。其次，用0.5%的NaCl溶液對(duì)所得菌懸液進(jìn)行梯度稀釋。再次，利用無(wú)菌刮刀在異養(yǎng)硝化固體培養(yǎng)基上均勻涂布稀釋液，并在25℃條件下培養(yǎng)4d。從次，挑選出形態(tài)和顏色各異的單個(gè)菌落，并在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基上進(jìn)行三次劃線純化。在嚴(yán)格的無(wú)菌操作下，選擇純化的菌落轉(zhuǎn)移至異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7天。最后，通過(guò)測(cè)定氮濃度，篩選氮去除率超過(guò)40%的菌株，認(rèn)定為異養(yǎng)硝化細(xì)菌，并進(jìn)行甘油管保存。

1.2.2 提取目標(biāo)菌株的基因組DNA

使用細(xì)菌DNA提取試劑盒，從2mL培養(yǎng)液中提取出基因組DNA，取5μL作為樣本，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)驗(yàn)證提取的DNA質(zhì)量。

1.2.3 16SrDNA基因擴(kuò)增

使用細(xì)菌通用的341f和806r引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲取16SrDNA基因片段。PCR反應(yīng)體系包含2μL的341f引物，2μL的806r引物，30μL的2×PCR Master Mix，14μL的ddH2O，2μL的模板DNA。PCR擴(kuò)增條件設(shè)置如下：首先，在95℃下預(yù)變性5min。其次，再完成35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在95℃下變性30s，在58℃退火30s，72℃下延伸45s。在72℃下延長(zhǎng)10min。為了驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)GelRed染料進(jìn)行染色[4]，然后進(jìn)行凝膠成像分析。最后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，以鑒定16SrDNA基因所對(duì)應(yīng)的物種。

1.2.4 微生物形態(tài)特征識(shí)別

本文菌株的形態(tài)特征鑒定選用了Biolog公司GENⅣ鑒定板，這款鑒定板集成了75種不同碳源、25種化學(xué)敏感性物質(zhì)以及標(biāo)準(zhǔn)的正、負(fù)控制孔。試驗(yàn)遵循Protocol B流程，在專(zhuān)用BUG平板上進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，并將溫度設(shè)定為30℃。接種過(guò)程中，使用BIOLOG公司提供的IF-B接種液，并嚴(yán)格控制菌液懸濁度在92%～96%的透光率范圍內(nèi)。接著，借助精確的移液裝置，將120μL的菌液接種至GENⅣ鑒定板上，然后將鑒定板放入先進(jìn)的微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)。經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)周期，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析解讀。

1.2.5 水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)

水樣通過(guò)0.22μm尼龍材質(zhì)的過(guò)濾器凈化后，運(yùn)用5B-4型號(hào)水質(zhì)分析儀，根據(jù)規(guī)范步驟檢測(cè)氮的含量。在濃度檢測(cè)環(huán)節(jié)，采用可見(jiàn)光光度法，借助UV-7000型分光光度計(jì)[5]進(jìn)行精確測(cè)量。同時(shí)，由pH-100型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)細(xì)致測(cè)定pH值。

2 不同影響因素分析

選用Biolog公司GENⅣ鑒定板，這款鑒定板集成了75種不同碳源、25種化學(xué)敏感性物質(zhì)，結(jié)果顯示該微生物為N81菌株。N81菌株氧化能力最強(qiáng)，氮通過(guò)硝化作用會(huì)轉(zhuǎn)化亞硝氮、硝態(tài)氮等其他氮形態(tài)，因此選取N81菌株為污水處理廠深度處理的異養(yǎng)硝化強(qiáng)化菌株。

2.1 碳源影響

碳源不僅是構(gòu)建微生物細(xì)胞的基本元素，還通過(guò)其代謝途徑為微生物的生長(zhǎng)提供動(dòng)力。鑒于碳源在化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量上的多樣性，菌株在利用不同碳源時(shí)具有不同的效率。為了深入探究碳源如何影響異養(yǎng)硝化過(guò)程的效果，選用了果糖、麥芽糖、乳酸鈉、丙酸鈉和酒石酸鉀鈉作為試驗(yàn)碳源。對(duì)比這些碳源在異養(yǎng)硝化試驗(yàn)中的表現(xiàn)，如圖2所示。

由圖2數(shù)據(jù)分析，當(dāng)使用乳酸鈉和丙酸鈉作為碳源時(shí)，N81菌株的異養(yǎng)硝化性能顯著優(yōu)于使用果糖和麥芽糖的情況。這主要是因?yàn)槿樗徕c和丙酸鈉的分子結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，使微生物更容易攝取和代謝這些物質(zhì)，從而提高了能量生成的效率。特別是當(dāng)丙酸鈉作為唯一碳源時(shí)，經(jīng)過(guò)48h的試驗(yàn)，氮去除率高達(dá)85.2%，這一數(shù)據(jù)遠(yuǎn)超過(guò)其他碳源所達(dá)到的效果。綜上所述，N81菌株在異養(yǎng)反硝化過(guò)程中，對(duì)乳酸鈉和丙酸鈉的利用能力表現(xiàn)出色。因此，當(dāng)處理含氮廢水時(shí)，添加乳酸鈉和丙酸鈉這樣的小分子有機(jī)酸，將能有效提升異養(yǎng)硝化細(xì)菌的硝化或反硝化能力，進(jìn)而加速水體中氮的去除過(guò)程。

2.2 碳氮比影響

研究指出，碳氮比（C/N）對(duì)異養(yǎng)硝化細(xì)菌N81的活性具有顯著影響，過(guò)高或過(guò)低的C/N比均可能削弱其氨氧化能力。因此，本文設(shè)計(jì)了C/N比為0.5、1.5、3、5、7、9的6個(gè)梯度，以探究N81異養(yǎng)硝化的最佳C/N比條件。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，N81菌株的氮去除率在培養(yǎng)初期隨著C/N比增加而逐步提升。當(dāng)C/N比達(dá)到7時(shí)，氮去除效果尤為顯著，經(jīng)過(guò)60h的培養(yǎng)，氮去除率高達(dá)95.3%。當(dāng)C/N比進(jìn)一步增至9時(shí)，N81菌株的氮去除率與C/N=7時(shí)相近，這表明過(guò)量的碳源對(duì)氮去除的促進(jìn)效果并不顯著。當(dāng)碳源不足時(shí)，菌體生長(zhǎng)受限，氨氧化效率隨之降低；而碳源充足時(shí)，菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定，代謝活動(dòng)旺盛，氨氧化效率也達(dá)到穩(wěn)定水平。因此，在以丙酸鈉為碳源的情況下，N81菌株的異養(yǎng)硝化最佳C/N比為7，其在24h的氮去除率可達(dá)94.5%。

2.3 培養(yǎng)溫度影響

異養(yǎng)硝化細(xì)菌N81菌株的生長(zhǎng)顯著受溫度影響，其適宜生長(zhǎng)的溫度區(qū)間為10℃～40℃，這與多數(shù)中溫異養(yǎng)硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)溫度范圍吻合。因此，在探究溫度對(duì)異養(yǎng)硝化作用影響的試驗(yàn)中，選擇12℃、20℃、28℃、32℃和38℃5個(gè)溫度梯度進(jìn)行測(cè)試，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4中的數(shù)據(jù)顯示，溫度對(duì)N81菌株的異養(yǎng)硝化效果有顯著的調(diào)控作用。在12℃的低溫條件下，氮的去除速度明顯放緩，經(jīng)過(guò)24h后去除率僅維持在23%左右，導(dǎo)致殘留氮濃度高達(dá)165mg/L。相反，在38℃的高溫環(huán)境中，氮的濃度幾乎未見(jiàn)下降，去除率極低，僅為5%。然而，在20℃～32℃內(nèi)，N81菌株的硝化效率達(dá)到最佳狀態(tài)，3個(gè)溫度點(diǎn)下的24h去除率均超過(guò)95%，且氮濃度均低于20mg/L。

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)污水處理廠深度處理生物脫氮技術(shù)及其影響因素的深入研究可以發(fā)現(xiàn)，生物脫氮技術(shù)在去除污水中氮素方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。然而，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，多種因素，例如溫度、碳源和碳氮比等，均會(huì)對(duì)生物脫氮的效率和穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響。未來(lái)，隨著環(huán)境保護(hù)要求不斷提高和污水處理技術(shù)持續(xù)創(chuàng)新，生物脫氮技術(shù)將在污水處理廠深度處理中發(fā)揮更重要的作用。

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