摘 要： 錐蟲是一類由媒介傳播的血液原蟲，可感染人和動(dòng)物引起錐蟲病，危害巨大。錐蟲的體表為單一可變表面糖蛋白（variant surface glycoprotein，VSG）形成的致密“外套”，會(huì)在每個(gè)蟲血癥時(shí)期進(jìn)行周期性更換，以逃避宿主免疫殺傷作用。錐蟲基因組含有成百上千個(gè)VSG基因和假基因，而蟲體可通過精確的表達(dá)調(diào)控保證在特定感染階段只表達(dá)一種VSG。VSG具有良好的抗原性，這主要由位于其N端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）頂葉（top lobe）的免疫顯性表位、糖基化修飾和亞結(jié)構(gòu)域及其構(gòu)象共同決定。VSG特異的IgM反應(yīng)在清除錐蟲感染中發(fā)揮重要作用，但I(xiàn)gG介導(dǎo)的免疫裂解作用則十分有限。宿主特異IgG免疫反應(yīng)變得固化，只會(huì)針對(duì)每個(gè)VSG中有限的免疫顯性表位，降低了與不同VSG之間的交叉反應(yīng)。本文綜述了VSG在表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、免疫原性及免疫應(yīng)答等方面的最新研究進(jìn)展，為深入認(rèn)識(shí)錐蟲致病機(jī)理、研制有效錐蟲病防控手段提供理論參考。

關(guān)鍵詞： 錐蟲；可變表面糖蛋白；表達(dá)調(diào)控；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；免疫應(yīng)答

中圖分類號(hào)：S852.72

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-4829-11

收稿日期：2023-12-12

基金項(xiàng)目：海關(guān)總署科研計(jì)劃項(xiàng)目（2022HK040）；寧波中盛產(chǎn)品檢測(cè)有限公司技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目（2023ZS003）；浙江農(nóng)林大學(xué)人才啟動(dòng)項(xiàng)目（2021LFR038）；杭州西湖風(fēng)景名勝區(qū)管委會(huì)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2023-001）

作者簡(jiǎn)介：曾晴勤（1999-），女，四川三臺(tái)人，碩士，主要從事動(dòng)物蟲媒病防控研究，E-mail： 18065198536@163.com

*通信作者：楊永春，主要從事動(dòng)物流行病學(xué)及疫病防控研究，E-mail： yyc@zafu.edu.cn；鄭亞東，主要從事動(dòng)物寄生蟲致病及防治研究，E-mail： zhengyadong@zafu.edu.cn；宋厚輝，主要從事動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)研究，E-mail： songhh@zafu.edu.cn

Expression Regulation， Structure and Immune Responses of Variant Surface Glycoproteins

in Trypanosomes

ZENG" Qingqin1， LI" Rusong2， LI" Rui1， ZHU" Chunyin1， WANG" Xinle2， HE" Xuedong3， HUAN" Jialing1， YE" Ziyu1， WANG" Ying4， ZHANG" Jing4， XIA" Tianqi1， SONG" Houhui1*， ZHENG" Yadong1*， YANG" Yongchun1*

（1.Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province，

Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Animal Health Diagnostics amp; Advanced Technology，

Zhejiang International Science and Technology Cooperation

Base for Veterinary Medicine and Health Management， China-Australia

Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics， College of Animal Science and

Technology amp; College of Veterinary Medicine of Zhejiang Aamp;F University， Hangzhou 311300，

China;

2.Ningbo Customs Technical Center/Ningbo Key Laboratory of Port Biological and

Food Safety Testing， Ningbo 315000，" China;

3.College of Animal Sciences （College of

Bee Science）， Fujian

Agriculture and Forestry University， Fujian-Taiwan Key Laboratory of

Animal Pathogen Biology， Fuzhou 350002，" China;

4.National Institute of Parasitic Diseases，

Chinese Center for Disease Control and Prevention （Chinese Center for Tropical Diseases Research），

NHC Key Laboratory of Parasite and Vector Biology，

WHO Collaborating Centre for

Tropical Diseases，

National Center for International

Research on Tropical Diseases， Shanghai 200025，" China）

Abstract： Trypanosomes are a type of blood-borne protozoa transmitted by vectors， which can infect humans and animals and cause trypanosomiasis being responsible for huge disease burdens. The surface of trypanosomes is a dense \"coat\" formed by a single variable surface glycoprotein （VSG）， which regularly undergoes replacement at each stage of infection to evade host immune killing. The genomes of trypanosomes contain hundreds to thousands of VSG genes and pseudogenes， and parasites employ precise expression regulation mechanisms to exclusively express one type of VSG at each specific infection stage. VSGs have good antigenicity， which is mainly determined by the immunodominant epitopes， glycosylation modifications， subdomains and their conformation located in the top lobe of the N-terminal domain （NTD）. VSG-specific IgM responses play an important role in trypanosome clearance， but the functions of IgG-mediated immune lysis are very limited. Host specific IgG immune responses become stereotyped， targeting only a limited set of immunodominant epitopes in each VSG， thus leading to reduction of cross reactivity with different VSGs. This article reviews the updates of VSG in expression regulation， protein structure， immunogenicity and immune responses， providing a theoretical basis for a profound understanding of the pathogenic mechanisms of trypanosomes and the development of effective prevention and control measures against trypanosomiasis.

Key words： trypanosome; variable surface glycoprotein; expression regulation; protein structure; immune response

*Corresponding authors： YANG Yongchun， E-mail： yyc@zafu.edu.cn; ZHENG Yadong， E-mail： zhengyadong@zafu.edu.cn; SONG Houhui， E-mail： songhh@zafu.edu.cn

畜 牧 獸 醫(yī) 學(xué) 報(bào)55卷

11期

曾晴勤等：錐蟲可變表面糖蛋白的表達(dá)調(diào)控、結(jié)構(gòu)及免疫應(yīng)答

錐蟲是一類專性寄生原蟲，在分類上屬于錐體科（Trypanosomatidae）錐蟲屬（Trypanosoma）。在125種哺乳動(dòng)物錐蟲中，僅有約13種對(duì)人和/或動(dòng)物具有致病性，其中岡比亞布氏錐蟲（Trypanosoma brucei gambiense）、伊氏錐蟲（Trypanosoma evansi）、馬媾疫錐蟲（Trypanosoma equiperdum）、剛果錐蟲（Trypanosoma congolense）、活動(dòng)錐蟲（Trypanosoma vivax）等10種主要致病性蟲種/亞種/型均源自非洲，而克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi）則僅在美洲流行［1］。這些錐蟲寄生于宿主血液和淋巴，偶爾也寄生于腦脊液及其他組織中，主要通過蟲媒傳播，也可經(jīng)口、胎盤、性交等傳播。錐蟲感染可引起人錐蟲病和動(dòng)物錐蟲病，前者分布較為局限，主要在拉丁美洲和撒哈拉以南地區(qū)，而后者則分布廣泛，在南美洲、非洲、亞洲和大洋洲均有流行［1-2］。在我國，主要的動(dòng)物錐蟲病是伊氏錐蟲病，又稱蘇拉?。⊿urra），呈地方性流行，在江蘇、江西、安徽、廣東、云南、新疆等省/自治區(qū)均有報(bào)道。在一些流行區(qū)，馬的伊氏錐蟲感染率約為4.0%，駱駝的約為4.6%，病死率達(dá)18.3%～49.0%［3］。錐蟲病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害巨大。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）估計(jì)，僅由采采蠅傳播的動(dòng)物錐蟲病每年就導(dǎo)致近3百萬只牛的死亡，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)10～12億美元。

可變表面糖蛋白（variant surface glycoprotein，VSG）是一種主要的錐蟲細(xì)胞表面蛋白，在免疫逃避過程中發(fā)揮決定性作用（圖1）。據(jù)估計(jì)，錐蟲細(xì)胞表面約有107個(gè)VSG分子，它們通過糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定在細(xì)胞膜上，形成致密的、具有保護(hù)作用的“外套”，可防止補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解作用［4］。在臨床上，動(dòng)物通常在感染錐蟲后會(huì)出現(xiàn)波浪形蟲血癥，且每個(gè)蟲血癥波峰間隔約5～8 d。這種現(xiàn)象與蟲體表面覆蓋的VSG的周期性改變密切相關(guān)。一般情況下，感染早期出現(xiàn)的蟲血癥中絕大多數(shù)錐蟲的體表僅覆蓋一種VSG，而體表覆蓋其他VSG變異體的錐蟲不到1%。當(dāng)宿主機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體后，表達(dá)主要VSG的錐蟲被清除，而體表覆蓋其他VSG變異體的錐蟲則能夠逃避免疫應(yīng)答反應(yīng)，并且開始大量繁殖直到宿主機(jī)體產(chǎn)生新的特異性抗體，如此反復(fù)。在感染后期，由于宿主B細(xì)胞耗竭，抗體合成受阻，使得表達(dá)主要VSG的錐蟲沒有被完全清除，這種情況下的蟲血癥具備多種錐蟲變異體即體表覆蓋不同VSG的錐蟲共感染的特征［2，5］。因此，深入了解VSG的表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、免疫原性及其免疫應(yīng)答等對(duì)于認(rèn)識(shí)錐蟲致病機(jī)理、研制有效錐蟲病防控手段具有重要意義。

1 VSG基因的表達(dá)調(diào)控

1.1 染色體水平

不同錐蟲的核基因組在染色體數(shù)目、基因大小與密度等方面明顯不同［6-11］。近期研究表明，錐蟲基因組可分成兩大部分，其中中心區(qū)（core regions）主要編碼保守基因，而無序區(qū)（disruptive regions）則編碼種特異性基因，主要包括一些表面糖蛋白基因；在空間結(jié)構(gòu)上，錐蟲基因組可能會(huì)形成染色質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)域（chromatin-folding domains）及其他一些特殊結(jié)構(gòu)，由其附近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程［12-13］。由于缺少轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，這些特殊的基因組空間組織結(jié)構(gòu)確保了布氏錐蟲能夠在1個(gè)感染階段只表達(dá)1種VSG［14］。當(dāng)然，還有一些分子通過染色質(zhì)的重塑等方式影響VSG表達(dá)，如通用小環(huán)序列結(jié)合蛋白［15］、跨泡DNA聚合酶（translesion DNA ploymerase）等［16］（表1）。

1.2 轉(zhuǎn)錄水平

VSG基因不均勻地分布在錐蟲的每個(gè)染色體上，且其拷貝數(shù)在不同種/株錐蟲間不盡相同?；蚪M分析表明，伊氏錐蟲共編碼399個(gè)VSG基因，且沒有一個(gè)VSG假基因，而布氏錐蟲則約有2 500個(gè)VSG基因和假基因，占全基因組的30%左右，且大多數(shù)為VSG假基因（90%～95%）［7，33］。VSG基因在染色體上位于亞端粒區(qū)，它通常從亞端粒座的表達(dá)位點(diǎn)（expression sites，ESs）開始由RNA聚合酶I進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。ESs結(jié)構(gòu)保守，長約60 kb，含有單個(gè)VSG在內(nèi)的數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，形成一個(gè)多順反子轉(zhuǎn)錄單元。對(duì)布氏錐蟲來說，已發(fā)現(xiàn)有15個(gè)ESs，且在任何時(shí)候僅有一個(gè)ES具有轉(zhuǎn)錄活性，而其余的則處于沉默狀態(tài)［4］。這種具有轉(zhuǎn)錄活性的ES、RNA聚合酶I等一起組合形成一個(gè)特定的核結(jié)構(gòu)，稱之為表達(dá)位點(diǎn)體（expression site body， ESB）。在ESB特異蛋白1（ESB-specific protein 1，ESB1）、含SAP結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白的作用下，ESB精準(zhǔn)表達(dá)特定VSG基因［18-19］。其中，ESB1是一種階段特異的轉(zhuǎn)錄因子，僅在ESB中分布。它可作用于具有轉(zhuǎn)錄活性VSG啟動(dòng)子附近的DNA，參與招募部分ESB組成成分，包括RNA聚合酶I。并且，在不改變ESB數(shù)量和形成的情況下，ESB1過

表達(dá)還可激活沉默的ES進(jìn)行轉(zhuǎn)錄［18］。以上研究結(jié)果表明，ESB1在錐蟲單個(gè)VSG等位基因的轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮不可或缺的功能。

錐蟲VSG轉(zhuǎn)錄本的含量很高，占總mRNA的7%～10%。為了確保VSG的高水平表達(dá)，卡哈爾體（Cajal bodies）、剪切引導(dǎo)序列陣列體（spliced leader array body）和NUFIP剪切因子體（NUFIP splicing factor body）等一些核體（nuclear bodies）也參與了VSG的轉(zhuǎn)錄、剪切過程，它們常常同時(shí)作用于具有轉(zhuǎn)錄活性的ES，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)VSG的高水平表達(dá)（表1）。在這個(gè)過程中，VSG剪切與ES轉(zhuǎn)錄間形成一個(gè)反饋環(huán)路，這樣使得高效剪切能進(jìn)一步促進(jìn)ES持續(xù)性轉(zhuǎn)錄，以便合成更多的VSG轉(zhuǎn)錄本［20］。

錐蟲在感染過程中可通過VSG切換（VSG switching）的方式，用一種VSG替代另一種VSG來更換“外套”，從而逃避抗體介導(dǎo)的免疫殺傷作用。VSG切換不依賴于宿主的免疫反應(yīng)，其主要是一種VSG基因重組過程，以此產(chǎn)生新的或嵌合VSG（含有部分VSG假基因序列）。盡管還存在爭(zhēng)議，但錐蟲細(xì)胞每次分裂時(shí)VSG切換的發(fā)生頻率似乎很低，約為10-6甚至更?。?］。VSG基因重組由具有轉(zhuǎn)錄活性的ES（其中含有單個(gè)VSG基因）和其他待轉(zhuǎn)錄VSG基因之間的同源序列驅(qū)動(dòng)發(fā)生。在同源重組過程中，VSG基因上游的長約70 bp的重復(fù)序列區(qū)是“重組熱點(diǎn)”，而那些位于VSG 3′端非編碼區(qū)的高度保守元件則發(fā)揮同源重組底物的作用。由于多數(shù)待轉(zhuǎn)錄VSG基因?yàn)榧倩颍视纱送ㄟ^重組新合成的VSG需要以基因內(nèi)部片段轉(zhuǎn)換（intragenic segmental conversions）等方式進(jìn)行進(jìn)一步加工，生成完整的VSG轉(zhuǎn)錄本，從而引起在錐蟲感染后期蟲血癥中一些帶有嵌合VSG亞群的形成，但目前仍不清楚那些因素能夠促進(jìn)這種VSG切換發(fā)生［4］。事實(shí)上，不是所有錐蟲都通過VSG切換的方式提高VSG抗原的多樣性。與布氏錐蟲和剛果錐蟲相比，活躍錐蟲的VSG基因因缺乏上述參與基因重組的結(jié)構(gòu)，使得VSG重組發(fā)生頻率顯著降低，且不會(huì)生成嵌合VSG。相反，在多種不同活躍錐蟲蟲株中，大部分表達(dá)的VSG（約為70%）都為同源基因，且無任何重組，明顯高于布氏錐蟲和剛果錐蟲的40%［34］。這一特征也能很好地解釋活躍錐蟲感染后宿主會(huì)有自愈的傾向。

VSG切換并不是隨機(jī)發(fā)生的。小鼠感染試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，布氏錐蟲在感染初期的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均合成28種VSG變異體；在4只感染小鼠中，約80%的主要VSG變異體出現(xiàn)在多只小鼠感染過程中，而近50%的則同時(shí)出現(xiàn)在所有小鼠感染過程中，這提示，一種VSG會(huì)以高頻率方式作為主要VSG出現(xiàn)在不同感染中［35］。這種VSG的選擇性可能與錐蟲蟲種有關(guān)［36］，同時(shí)還與蟲體的小型染色體（minichromosome）有一定的聯(lián)系（表1）。在最初感染的前幾周，蟲體通常以那些處于沉默的ES或含有VSG基因的小型染色體末端為模板合成新的VSG，但這兩類VSG成為主要VSG的幾率卻不盡相同。盡管以前者為模板激活VSG合成的頻率相對(duì)較高，但以后者為模板合成的VSG則更易于成為主要VSG。換言之，那些以含有VSG基因的小型染色體末端為模板合成新VSG的弱勢(shì)蟲種亞群很大程度會(huì)在感染過程中變成優(yōu)勢(shì)亞群。并且，這種傾向還與VSG的長度成正相關(guān)［17］。

VSG切換是由發(fā)生在具有轉(zhuǎn)錄活性ES中的DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break，DSB）誘發(fā)的［37］。VSG基因間存在長約70 bp的重復(fù)序列，它可作為DNA重組的底物，利用其他那些位于亞端粒區(qū)的未表達(dá)的VSG基因，通過基因轉(zhuǎn)換的方式對(duì)基因組進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)VSG切換。這一過程與DSB發(fā)生的位置有很大關(guān)系。在布氏錐蟲中，如果DSB出現(xiàn)在70 bp的重復(fù)序列中時(shí)不會(huì)誘發(fā)VSG切換，同時(shí)發(fā)生在不同位點(diǎn)的DSB也會(huì)引起蟲體基因表達(dá)譜的改變，進(jìn)而影響VSG切換［38］。此外，還有許多分子參與精準(zhǔn)調(diào)控VSG切換，包括DNA聚合酶IE［21］、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張和Rad3相關(guān)激酶［22］、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1B及其互作蛋白R(shí)NA酶H2［23］、阻遏物激活蛋白1（repressor activator protein 1）［24］、同源重組酶RAD51［25］與RAD50［26］及經(jīng)小類泛素樣修飾物（small ubiquitin-like modifier，SUMO）修飾的轉(zhuǎn)錄激活子［27］等（表1）。其中，DNA聚合酶IE是端粒的固有成分，通過維持端粒的完整性來抑制VSG切換。在敲低DNA聚合酶IE時(shí)，VSG切換的發(fā)生率能提高3倍左右，并且處于沉默狀態(tài)的不同VSG也會(huì)進(jìn)行共表達(dá)［21］。同樣，共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張和Rad3相關(guān)激酶也具有抑制VSG切換的功能。布氏錐蟲缺失該酶后會(huì)出現(xiàn)生長停滯，且對(duì)UV、離子輻射等異常敏感，提示該酶的缺失會(huì)促進(jìn)核基因組DNA損傷。同時(shí)，缺失該酶還會(huì)導(dǎo)致布氏錐蟲同時(shí)表達(dá)多種VSG，形成含有兩種及以上VSG的馬賽克“外套”，表明VSG切換發(fā)生率明顯升高［22］。與這些抑制劑不同，布氏錐蟲阻遏物激活蛋白1可直接與端粒DNA結(jié)合，也可與端粒結(jié)合蛋白TTAGGG重復(fù)結(jié)合因子（TTAGGG repeat-binding factor）互作，共定位于端粒。該蛋白對(duì)布氏錐蟲VSG的表達(dá)非常關(guān)鍵，在敲低的情況下，幾乎所有VSG基因和假基因都同時(shí)表達(dá)［39］。除與DNA非特異性結(jié)合外，阻遏物激活蛋白1還具有一個(gè)RNA識(shí)別基序，位于MybLike結(jié)構(gòu)域，能與VSG轉(zhuǎn)錄本的3′端非編碼區(qū)結(jié)合。阻遏物激活蛋白1的這種RNA結(jié)合能力主要依賴于RNA識(shí)別基序中的兩個(gè)保守的苯丙氨酸（F655和F694）及DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，RNA識(shí)別基序的突變會(huì)導(dǎo)致RNA結(jié)合能力喪失，并顯著降低VSG的表達(dá)水平?？梢?，阻遏物激活蛋白1的DNA結(jié)合與RNA結(jié)合間存在競(jìng)爭(zhēng)性，以確保錐蟲在特定感染時(shí)期能夠讓單個(gè)VSG基因進(jìn)行高表達(dá)［40］。然而，目前還不清楚這些分子是如何協(xié)調(diào)發(fā)揮作用并精準(zhǔn)調(diào)控VSG切換的。

1.3 轉(zhuǎn)錄后水平

RNA轉(zhuǎn)錄后加工修飾在VSG表達(dá)調(diào)控中也發(fā)揮重要作用。與其他mRNA相比，VSG轉(zhuǎn)錄本更穩(wěn)定，半衰期長達(dá)90～120 min，推測(cè)可能與其3′端非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)有關(guān)［29］。VSG的3′端非編碼區(qū)含有兩個(gè)保守基序，即9-mer基序和16-mer基序，緊接在ploy（A）尾巴的上游。其中，16-mer基序（5′-TGATATATTTTAACAC-3′）對(duì)VSG轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性至關(guān)重要。16-mer基序可作為順式作用元件，促進(jìn)ploy（A）中個(gè)別腺苷發(fā)生甲基化，形成N6-甲基化腺苷（N6-methyladenosine，m6A），能夠抑制ploy（A）發(fā)生去腺苷化，從而增強(qiáng)VSG轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性（表1）［28］。但人們?nèi)圆磺宄@種甲基化是如何發(fā)生的。

除甲基化修飾外，16-mer基序還影響細(xì)胞周期蛋白F盒蛋白2與VSG3′端非編碼區(qū)之間的結(jié)合［29］。細(xì)胞周期蛋白F盒蛋白2是一種RNA結(jié)合蛋白，能與多聚腺苷酸結(jié)合蛋白等一些互作蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，結(jié)合在VSG3′端非編碼區(qū)，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性［29-32］。

2 VSG蛋白及其結(jié)構(gòu)特征

VSG蛋白是錐蟲體表最為豐富的蛋白質(zhì)，占總蛋白的90%以上，且非常穩(wěn)定，其半衰期長達(dá)26 h［41］。依據(jù)半胱氨酸分布與序列同源性，VSG分為兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，即N端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain， NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain， CTD）。前者由300～350氨基酸組成，位于錐蟲“外套”的外面，而后者僅由40～80個(gè)氨基酸組成，帶有GPI錨定區(qū)，位于錐蟲“外套”的里面［5］。不同種錐蟲的VSG蛋白在分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)方面存在差異，布氏錐蟲、伊氏錐蟲和馬媾疫錐蟲的VSG大小為45～55 ku，具有1個(gè)NTD和1～2個(gè)CTD，剛果錐蟲和活動(dòng)錐蟲的VSG則略小，為45～50 ku，通常只有1個(gè)NTD［42］。同時(shí)，NTD和CTD按照半胱氨酸分布特征還可進(jìn)一步分為不同的類型，如NTD分為A、B和C型，CTD分為c1～6型。對(duì)布氏錐蟲VSG來說，A型和B型的占比相當(dāng)，C型的占比則相對(duì)較少；c1型最為常見，其次是c2型和c3型，c4～6型則較為少見。并且，不同類型的NTD和CTD之間的組合似乎沒有明顯的偏好性，同一種類型的NTD可以和不同類型的CTD進(jìn)行組合。然而據(jù)估計(jì)，布氏錐蟲僅編碼約36%（281/771）的完整NTD和13%（85/651）的完整CTD［43］。二者在比例上的差異在一定程度上也反映出與NTD相比，CTD在序列上更為保守［44］。

對(duì)于多數(shù)VSG來說，盡管不同VSG的NTD序列同源性很低，通常為10%～30%，但它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上卻較為保守［42，44］。而且，不管是A型NTD還是B型NTD，它們似乎都具有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)［45］。通常，NTD會(huì)形成以三螺旋束支架為中心的結(jié)構(gòu)，但因螺旋之間或支架末端序列的不同也會(huì)形成不同的結(jié)構(gòu)元件，加之構(gòu)象多變，從而導(dǎo)致不同VSG“外套”的分子表面大相徑庭［44］。與NTD明顯不同，CTD是一個(gè)緊密的結(jié)構(gòu)域，其中心的結(jié)構(gòu)在不同VSG中均很保守，還含有保守的半胱氨酸和疏水氨基酸殘基。CTD的N端具有一個(gè)短的α螺旋，C端則有一個(gè)較長的α螺旋，且后者隨著VSG的不同而長短不一，其結(jié)構(gòu)主要依賴于帶點(diǎn)氨基酸的作用［42］。雖然不同類型CTD在結(jié)構(gòu)上存在細(xì)微差別，但它們的總體結(jié)構(gòu)還是非常相似［42］。遺憾的是，一種VSG蛋白可能因NTD和CTD之間的連接區(qū)比較靈活，難以形成單一構(gòu)象，故時(shí)至今日還沒有完整的VSG的晶體結(jié)構(gòu)［46］。

CTD含有GPI錨，通過與蛋白質(zhì)C末端共價(jià)結(jié)合在錐蟲細(xì)胞膜上，將VSG固定于蟲體表面［47］。通常，新合成的VSG在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)修飾加上GPI錨，之后會(huì)在15 min內(nèi)運(yùn)送至細(xì)胞表面［41］。錐蟲在更換“外套”時(shí)，GPI錨會(huì)發(fā)生脫落和水解，同時(shí)水解后的GPI錨的多糖部分仍然連接在VSG的C末端［41，48］。然而，VSG的這種正常更替似乎與VSG蛋白的豐度沒有直接關(guān)系［49］。

早期研究表明，所有的VSG為同源二聚體，分子量約100～120 ku，半衰期長達(dá)30多個(gè)小時(shí)，且具有高度相似的高級(jí)結(jié)構(gòu)。事實(shí)上，VSG的存在形式可能更為復(fù)雜。除同源二聚體外，還存在穩(wěn)定的單體和三聚體形式，這主要取決于VSG蛋白的濃度。雖然每一個(gè)VSG單體的自我聚合能力可能不同，但在錐蟲表面集聚并達(dá)到一定濃度時(shí)，多數(shù)VSG更易發(fā)生聚合，形成由VSG多聚體組成的“外套”［44，46］。

同其他許多蛋白質(zhì)一樣，VSG蛋白也進(jìn)行糖基化。在布氏錐蟲VSGMITat1.3中，糖基化修飾分別位于NTD三螺旋束支架頂部的頂葉（top lobe）和底部的下葉（bottom lobe），前者是O-連糖基化修飾，后者則是N-連糖基化修飾。O-連糖基化修飾發(fā)生在第317位的絲氨酸殘基上，位于VSG頂部的表面。有趣的是，每個(gè)O-連糖基化修飾中的多糖數(shù)量不盡一致，少則為1，多則為3。據(jù)估計(jì)，含有1、2和3個(gè)己糖殘基修飾的比例分別為33%、37%和22%［50］。并且，這些糖基化修飾也廣泛地存在于其他VSG蛋白［44，50］。然而，人們對(duì)于O-連糖基化修飾中己糖數(shù)量多樣性的意義仍不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。

除糖基化修飾外，天然VSG還結(jié)合有Ca離子。Ca離子通過與4個(gè)氨基酸殘基形成的氧鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)合在頂葉附近，其中3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基位于一條鏈上，剩余的一個(gè)氨基酸殘基則位于另外一個(gè)環(huán)上，由此形成Ca離子結(jié)合口袋。比較發(fā)現(xiàn)，有無Ca離子的NTD的構(gòu)象之間沒有明顯差別，說明Ca離子的結(jié)合與否并不影響VSG空間構(gòu)象［51］。

3 VSG的免疫原性及其免疫應(yīng)答特點(diǎn)

VSG具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。在VSG中，CTD的免疫原性差，并且由于CTD錨定在“外套”里面，使得機(jī)體免疫系統(tǒng)難以識(shí)別。相反，NTD的免疫原性良好，且NTD位于錐蟲“外套”的表面，充分暴露于機(jī)體免疫系統(tǒng)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度抗體［4，44］。特別是位于NTD頂葉的一些亞結(jié)構(gòu)域，包括位于VSG表面的環(huán)和Ca離子結(jié)合口袋。在布氏錐蟲中，該環(huán)由8～12個(gè)氨基酸殘基組成，兩個(gè)末端各有1個(gè)半胱氨酸殘，形成1個(gè)二硫鍵。通常，環(huán)中的絲氨酸或蘇氨酸會(huì)進(jìn)行O-連糖基化修飾，降低VSG的免疫原性。小鼠感染試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)O-連糖基化修飾的VSG免疫保護(hù)率僅為25%，而無糖基化修飾的VSG免疫保護(hù)率則達(dá)83%以上［50］，這可能是由于糖基化修飾使VSG具有多種構(gòu)象狀態(tài)，從而形成多樣的抗原表位構(gòu)象所致。同樣，Ca離子結(jié)合口袋也與VSG的免疫顯性表位有關(guān)。Ca離子結(jié)合口袋突變體（氧鍵網(wǎng)絡(luò)中的三個(gè)連續(xù)氨基酸殘基均突變?yōu)楸彼幔┡c野生型相比，盡管它們的結(jié)構(gòu)高度相似，但野生型錐蟲感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體并不能結(jié)合Ca離子結(jié)合口袋突變蟲體，提示免疫顯性表位位于由三個(gè)連續(xù)氨基酸殘基決定的區(qū)域內(nèi)［51］。但是，對(duì)于“絕大多數(shù)免疫顯性表位分布于NTD頂葉”的推論［50］，至今還沒得到抗體-VSG晶體結(jié)構(gòu)證據(jù)的支持。

在錐蟲感染中，宿主難以產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)反應(yīng)：先天性免疫反應(yīng)能降低早期的蟲血癥，適應(yīng)性免疫反應(yīng)與補(bǔ)體途徑則能定期地清除感染，但二者均不能完全殺滅蟲體［2，52］。宿主在感染錐蟲5～6 d后，會(huì)迅速合成免疫球蛋白M（immunoglobulin M， IgM），它能高效識(shí)別蟲體VSG“外套”上的高甘露糖殘基并與之結(jié)合，啟動(dòng)免疫殺傷作用。并且，相比IgG來說，IgM更能有效激活補(bǔ)體系統(tǒng)，協(xié)同增強(qiáng)免疫清除能力。在這些作用下，那些沒有更換VSG“外套”的錐蟲被完全清除［53］。在人、猴子等一些靈長類動(dòng)物的血液中，還存在結(jié)合IgM的錐蟲裂解因子2（trypanosome lytic factor 2， TLF2），參與抗錐蟲的先天性免疫應(yīng)答。TLF2-IgM為一種種系抗體（germline antibody），在正常人血液中的水平相對(duì)較低，但一旦有錐蟲感染，便進(jìn)行大量合成。TLF2-IgM能與VSG等一些錐蟲表面蛋白以低親和力的方式結(jié)合，介導(dǎo)抗錐蟲免疫，在急性感染階段的先天性免疫應(yīng)答過程中起著重要作用［54］。然而魔高一丈，錐蟲利用C端驅(qū)動(dòng)蛋白（C-terminal kinesin，KIFC1）能在2 min內(nèi)有效清除蟲體表面的IgM-VSG復(fù)合物［54］。KIFC1是布氏錐蟲在血液感染時(shí)期高表達(dá)的一種蛋白質(zhì)，其N末端含有一個(gè)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，由8個(gè)螺旋組成，其中第7個(gè)螺旋介導(dǎo)KIFC1與含磷脂酰絲氨酸和膽固醇的細(xì)胞膜的結(jié)合。在敲低KIFC1的情況下，蟲體雖然生長良好，但不能感染正常小鼠，卻能感染B細(xì)胞缺陷小鼠。并且，這種低表達(dá)KIFC1的錐蟲清除體表抗體-VSG復(fù)合物的速度明顯降低，易于被巨噬細(xì)胞捕獲。這是因?yàn)镵IFC1低表達(dá)會(huì)引起錐蟲細(xì)胞膜中膽固醇的含量升高，膜的流動(dòng)性變低，使得抗體-VSG復(fù)合物滑動(dòng)至鞭毛袋進(jìn)行內(nèi)吞并降解的過程受阻［55］。除此之外，IgM介導(dǎo)的免疫殺傷作用對(duì)那些更換“外套”的錐蟲來說十分有限。雖然錐蟲完全更換“外套”需數(shù)天（約4.5 d），但對(duì)IgM介導(dǎo)的免疫殺傷作用敏感的“窗口期”卻較短，只有起初的大約29 h。再者，IgM與蟲體“外套”的結(jié)合能力還與表面VSG的密度有莫大的關(guān)系［53］。這樣，一部分帶有新“外套”的錐蟲便能成功逃避IgM介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)持續(xù)感染。

在抗錐蟲先天性免疫反應(yīng)中，VSG還參與γ干擾素（interferon γ，IFNγ）介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。這種炎性反應(yīng)依賴于IFNγ激活的巨噬細(xì)胞首先識(shí)別VSG蛋白GPI錨中的多聚甘露糖碳水化合物核心［2］。在錐蟲感染過程中，IFNγ最初源于自然殺傷細(xì)胞和自然殺傷性T細(xì)胞，爾后主要由CD4+輔助性T細(xì)胞合成。一方面，由于肝中的Kupffer細(xì)胞在清除循環(huán)錐蟲（circulating trypanosome）方面發(fā)揮重要功能，IFNγ可能通過激活Kupffer細(xì)胞提高其吞噬能力來實(shí)現(xiàn)抗錐蟲感染作用［56］。另一方面，IFNγ介導(dǎo)的炎性反應(yīng)會(huì)造成腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、一氧化氮的大量合成，引起錐蟲發(fā)生裂解［2，56］。需要注意的是，IFNγ對(duì)錐蟲感染而言是一把雙刃劍，過量則會(huì)導(dǎo)致宿主發(fā)生嚴(yán)重的免疫損傷，反而不能有效清除錐蟲感染［56］。

盡管VSG可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的獲得性免疫反應(yīng)，但人們至今對(duì)IgG-“外套”VSG之間免疫反應(yīng)的認(rèn)識(shí)仍非常有限［50-51］。但有一點(diǎn)很清楚，那就是在蟲血癥形成過程中，錐蟲“外套”中的VSG在不斷地發(fā)生著變異，新抗體的合成始終趕不上“外套”的變化，從而使蟲體能夠逃避依賴IgG的蟲體裂解作用?，F(xiàn)有的數(shù)據(jù)表明，這些抗體的特異性主要由位于VSG表面的免疫顯性表位和亞結(jié)構(gòu)域，以及糖基化修飾決定［50-51］。同時(shí)，VSG特異IgG抗體可作用于VSG表面的不同抗原表位；如果這些表面抗原表位發(fā)生微小的變化，也會(huì)導(dǎo)致它們免疫原性的改變，誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的抗體。這可能是由錐蟲“外套”的VSG組成模式和重復(fù)性特征造成的，使得宿主獲得性免疫反應(yīng)變得固化，只會(huì)針對(duì)每個(gè)VSG中有限的免疫顯性表位，這樣便可盡量減小一種VSG抗體與不同VSG抗原之間的交叉反應(yīng)［51］。由此可見，IgG在抗錐蟲感染中的作用似乎較小。相反，抑制小鼠產(chǎn)生IgG卻能提高其對(duì)伊氏錐蟲感染的抵抗力，提示感染早期的IgM與IgG之間的快速轉(zhuǎn)換可能會(huì)影響IgM免疫反應(yīng)，幫助錐蟲逃避免疫清除［2］。再者，在錐蟲感染過程中，可能由于一種VSG存在的時(shí)間短，很難誘導(dǎo)機(jī)體生成經(jīng)典的記憶性B細(xì)胞［57］。

4 結(jié)語及展望

錐蟲能夠有效逃避宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)，完全得益于覆蓋其全身的致密的VSG“外套”。蟲血癥的發(fā)生周期與完全替換VSG“外套”所需時(shí)間基本相仿，也從另外一個(gè)角度支持了上述觀點(diǎn)。錐蟲在特定的感染時(shí)期只表達(dá)一種VSG蛋白，形成含單一VSG的“外套”。要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，錐蟲已進(jìn)化形成了多種機(jī)制，在染色體水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行精確的時(shí)空調(diào)控，既要保證僅有單個(gè)的VSG表達(dá)，又要確保VSG的高水平表達(dá)但又不能過量表達(dá)。

VSG在天然狀態(tài)下以多種形式存在，其中多數(shù)為二聚體，少數(shù)為單體和三聚體。VSG通常具有2個(gè)保守的NTD和CTD結(jié)構(gòu)域。對(duì)于不同VSG來說，盡管NTD的序列同源性很低，但它們的高級(jí)結(jié)構(gòu)卻非常保守，具有一個(gè)由3個(gè)α螺旋形成的骨架及骨架頂部的頂葉與底部的低葉。不管是頂葉還是低葉均有糖基化修飾，并且頂葉還存在多個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。但目前還缺乏完整的VSG的晶體結(jié)構(gòu)。

VSG具有良好的免疫原性，這主要取決于位于“外套”表面的免疫顯性表位、糖基化修飾和亞結(jié)構(gòu)域及其構(gòu)象。在感染過程中，VSG特異的IgM先天免疫應(yīng)答能夠清除絕大多數(shù)錐蟲，但VSG特異IgG介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答的免疫保護(hù)作用卻十分有限，主要是因?yàn)樗拗餍驴贵w的合成始終晚于錐蟲“外套”的更換、抗體與不同VSG之間的交叉反應(yīng)很小，以及缺乏記憶性B細(xì)胞等。

盡管如此，人們對(duì)于VSG表達(dá)、VSG“外套”形成及其與特異抗體間的免疫反應(yīng)仍有許多未解之謎，如在切換過程中單個(gè)VSG基因表達(dá)是如何在兩個(gè)ES間進(jìn)行的又是何時(shí)進(jìn)行的、不同分子之間是如何協(xié)作調(diào)控VSG表達(dá)、致密“外套”的形成機(jī)制是什么、IgM/IgG是如何結(jié)合“外套”上的VSG等等。對(duì)于單個(gè)VSG基因表達(dá)是如何在兩個(gè)ES間進(jìn)行切換，一種可能是DNA斷裂或復(fù)制會(huì)引起結(jié)合在ESB上的ESB 1和VSG排除蛋白2（VSG-exclusion protein 1， VEX2）發(fā)生解離，使得已激活的ES失活，同時(shí)其他VSG競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合游離的ESB1和VEX1，激活另外一個(gè)ES。ESB1作為一種轉(zhuǎn)錄激活因子，參與招募RNA聚合酶I等一些組成ESB的分子［18］。要保持RNA聚合酶I的轉(zhuǎn)錄活性，還需招募VEX蛋白，其中VEX2參與調(diào)節(jié)特異VSG的轉(zhuǎn)錄，在其低表達(dá)的情況下，錐蟲會(huì)同時(shí)表達(dá)多個(gè)處于沉默狀態(tài)的不同VSG［58］。可見，ESB1和VEX1可能協(xié)同發(fā)揮作用，確保只有一個(gè)ES具有轉(zhuǎn)錄活性。還有一種可能是錐蟲在組織中遷移時(shí)會(huì)造成機(jī)械性壓迫，破壞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，同樣引起ESB1和VEX1從ESB上的解離［59］。但這些假設(shè)還需進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。相信，對(duì)這些問題的深入研究將有助于人們了解錐蟲致病機(jī)理，為有效控制錐蟲病提供新思路、新手段。

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（編輯 范子娟）