摘 要： 為了研究蛋雞就巢性的潛在調控機制，本研究選用300日齡體況良好、體重一致的城口山地雞12只，其中3只個體處于正常產蛋期，其余9只個體分別處于就巢期10、20和30天。采集各組蛋雞卵巢組織進行組織解剖學形態(tài)觀察，然后利用轉錄組（RNA-seq）和蛋白組（iTRAQ）測序技術分別對產蛋組正常卵巢（normal ovary，NO）和就巢組萎縮卵巢（atrophic ovary，AO）進行測序分析。篩選差異表達基因（DEGs）和差異表達蛋白（DEPs）并進行功能富集分析，鑒定與家禽就巢性相關的候選基因。結果表明：就巢導致蛋雞卵巢發(fā)生萎縮，卵泡大量閉鎖。在卵巢組織中鑒定出930個DEGs，其中430個基因上調，500個基因下調；同時鑒定出546個DEPs，其中178個蛋白上調，368個蛋白下調。通過功能注釋和富集分析發(fā)現，這些DEGs和DEPs顯著富集在細胞外基質（extracellular matrix，ECM）受體相互作用、黏著和PI3K-Akt等信號通路。最后通過轉錄組和蛋白組聯合分析，篩選出7個蛋雞就巢性的候選基因：COMP、FN1、ITGA8、THBS1、COL4A2、COL4A1和COL1A1。綜上所述，本研究通過分析轉錄組測序和蛋白組測序結果篩選了蛋雞就巢性關鍵候選基因，并構建了家禽就巢狀態(tài)下卵巢發(fā)育的調控網絡。本研究為深入解析就巢期卵巢萎縮的分子調控機制提供了理論參考，豐富了調控家禽就巢性狀的候選基因，為蛋雞的遺傳改良和分子育種研究提供理論依據。

關鍵詞： 就巢；卵巢；轉錄組學；蛋白組學；城口山地雞

中圖分類號：S831.2

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-4950-18

收稿日期：2024-05-13

基金項目：重慶市研究生科研創(chuàng)新項目（CYS21126）；重慶市技術創(chuàng)新與應用發(fā)展專項重點項目（CSTB2023TIAD-LUX0003）；西南大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（202310635032）

作者簡介：蔣 婷（1995-），女，甘肅通渭人，碩士生，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：jiangt019@163.com

*通信作者：劉凌斌，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：liulb515@163.com

Screening Candidate Genes for Ovarian Development and Constructing Regulatory Network

in Nesting Chickens by Transcriptome and Proteome

JIANG" Ting1， LI" Wendong1， LI" Xingqi1， HUANG" Yu1， WANG" Qigui2， WANG" Haiwei2， YANG" Chaowu3， LIU" Lingbin1*

（1.College of Animal Science and Technology， Southwest University， Chongqing 400715，" China;

2.Chongqing Academy of Animal Sciences， Chongqing 402460，" China;

3.Sichuan Animal Science

Academy， Chengdu 610066，" China）

Abstract：" The study aimed to investigate the potential regulatory mechanism of nesting ability of laying hens. The 12 300-day-old Chengkou mountain chickens with good body condition and the same body weight were used in this study. Among them， 3 individuals were in normal laying period， and the remaining 9 individuals were in nesting period for 10， 20 and 30 days， respectively.

The ovarian tissues of laying hens in each group were collected for anatomical observation.

Normal ovary （NO） and atrophic ovary （AO） of laying hens were analyzed by RNA-seq and iTRAQ sequencing technology. Differentially expressed genes （DEGs） and differentially expressed proteins （DEPs） were screened and functional enrichment analysis was performed to identify candidate genes related to nesting in poultry. The results showed that ovary atrophy and follicle atresia occurred in nesting hens. A total of 930 DEGs were identified in ovarian tissues， of which 430 genes were up-regulated and 500 genes were down-regulated. Meanwhile， 546 DEPs were identified， of which 178 proteins were up-regulated and 368 proteins were down-regulated. Through functional annotation and enrichment analysis， it was found that these DEGs and DEPs were significantly enriched in ECM receptor interaction， adhesion and PI3K-Akt signaling pathways. Finally， 7 candidate genes for nesting ability COMP， FN1， ITGA8， THBS1， COL4A2， COL4A1 and COL1A1 were selected by combined transcriptome and proteome analysis. In summary， key candidate genes for nesting ability were identified by transcriptome and proteome analysis， and a regulatory network for ovarian development in nesting poultry was constructed. This study provides a theoretical reference for further understanding the molecular regulation mechanism of ovarian atrophy at nesting stage， enriches the candidate genes regulating poultry nesting traits， and provides theoretical basis for genetic improvement and molecular breeding research of laying hens.

Key words： nesting; ovary; transcriptome; proteome；Chengkou mountain chicken

*Corresponding author：LIU Lingbin， E-mail：liulb515@163.com

就巢是母禽具有的一種天然母性行為，主要表現為頻繁窩巢、被毛蓬松、食欲衰退、停止產蛋并進行孵化等行為［1］。同時，就巢的母禽會伴隨有體溫升高、體重顯著下降、免疫力降低、反應遲緩、活動減少、攻擊性變強等一系列生理狀況的變化。母禽在就巢狀態(tài)下，會出現卵泡閉鎖、卵巢萎縮、排卵停止、產蛋量下降甚至停止產蛋的現象。除了白來航雞及相關商品化品系雞不表現出就巢行為，大部分家禽都會表現出不同程度的就巢行為［2］。頑固的就巢性是中國大多數地方家禽品種產蛋性能低下的主要原因之一。開展就巢性分子調控機制的研究有助于找到控制就巢性狀的主效基因或關鍵性靶點分子，最終通過遺傳改良的方法培育出低就巢性或無就巢性的品種（系），進而提高蛋雞的產蛋性能。

家禽的就巢性是一種由多基因控制的復雜性狀，通常受到遺傳、內分泌、環(huán)境等因素的調控［3-4］。就巢性的遺傳力很低，常規(guī)育種方法很難徹底消除就巢性。下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸是調節(jié)家禽繁殖性能的關鍵調節(jié)軸，卵巢在其中發(fā)揮著重要作用［5］。卵巢分泌多種激素，如孕酮（progesterone，PROG）、雌二醇（estradiol，E2）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、促黃體素（luteinizing hormone，LH）和催乳素（prolactin，PRL）等，這些激素被認為是與就巢相關的關鍵激素，其中大部分是類固醇激素［6-7］。這些激素影響卵母細胞和卵泡的發(fā)育和成熟，最終促進或抑制排卵。先前的研究表明，雞的卵泡閉鎖受到顆粒細胞凋亡的調控［8］。顆粒細胞凋亡會導致哺乳動物和家禽卵泡閉鎖［9］。通常，當發(fā)育卵泡中凋亡的顆粒細胞比例超過10%時卵泡就會發(fā)生閉鎖［10］。影響家禽就巢的內分泌因子具有遺傳性，且受多種基因共同調控［11］。遺傳機制是導致家禽產生就巢性的根本原因，相關研究主要集中于PRL、LH、FSH等繁殖激素相關基因的表達和多態(tài)性的分析［12］，結果表明這些基因位點與就巢發(fā)生和產蛋性能密切相關。

隨著RNA-seq和iTRAQ測序廣泛應用于畜禽研究［13-15］，許多新的生殖相關基因和蛋白質被鑒定出來，RNA-seq和iTRAQ測序成為了探究分子機制的熱門工具。Huang等［16］對高產和低產蛋雞卵巢進行了轉錄組測序和代謝組測序，聯合分析后篩選出4個候選基因，3條關鍵通路，為解析蛋雞產蛋機制提供了理論基礎。Wang等［17］對脂肪沉積相對較高和較低的南川黑豬背最長肌的轉錄組和蛋白組進行分析，篩選了15個決定脂質沉積遺傳分歧的候選基因，為地方豬品種的育種工作提供了理論指導。在就巢期和產蛋期的鵝卵巢中差異表達的基因及其蛋白質主要富集于類固醇生物合成、類固醇激素生物合成、PI3K-Akt信號通路、孕激素介導的卵母細胞成熟和催產素信號通路，這些均是與生殖性能相關的關鍵信號通路［16-18］。同時，也有研究表明，蛋雞就巢期間一些基因富集到細胞周期、增殖、凋亡通路［7］，這與就巢期家禽卵巢的形態(tài)學觀測結果相符。研究表明，抑制類固醇生物合成中的類固醇合酶會導致卵巢功能退化并觸發(fā)就巢行為［19］。此外，家禽繁殖期間大量的卵泡閉鎖和卵泡變性也與顆粒細胞的自噬和凋亡有關［20-21］。與細胞周期、增殖、凋亡通路和類固醇激素合成、代謝和轉運相關的基因、蛋白質、代謝物、生長因子和信號通路仍是當前研究的熱點。然而，這些因素如何影響家禽的卵巢結構和功能，進而導致其就巢行為的確切調控機制目前仍不清楚。本研究對蛋雞產蛋期正常卵巢和就巢期萎縮卵巢進行了轉錄組和蛋白組測序，系統地分析了雞就巢期間轉錄水平和蛋白水平的變化，聯合分析轉錄組學和蛋白組學數據，為探明家禽就巢期卵巢萎縮的關鍵分子機制提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物試驗

試驗動物來源于重慶市城口山地雞遺傳研究所飼養(yǎng)的同一批次的1 700只城口山地雞。試驗雞飼養(yǎng)在采用機械通風的封閉式雞舍，三層階梯式單體籠養(yǎng)。按照NRC（1994）蛋雞飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)，飼喂324蛋雞產蛋期配合飼料，雞舍設有乳頭飲水器，雞可自由采食，飲水。每天記錄雞群產蛋量和就巢情況，在300日齡時期，選擇同一飼養(yǎng)條件下12只體況良好、體重一致，具有典型品種外觀特征的城口山地雞作為研究材料。其中，挑選處于正常產蛋期的3只個體作為正常組（NO）試驗材料，挑選進入就巢期10、20、30天的3個時間點各3只個體作為就巢10（AO-10）、20（AO-20）、30天（AO-30）的試驗材料。采集各組母雞的卵巢組織進行觀察。NO組和AO-30組的卵巢部分置入4%多聚甲醛，用于制作石蠟切片，剩余部分液氮速凍后-80 ℃冰箱保存，用于轉錄組測序和蛋白質提取。本研究所有試驗動物操作均嚴格符合國際動物福利合作委員會（ICCAW）和西南大學實驗室動物福利和倫理準則。

1.2 蘇木精和伊紅（HE）染色

將卵巢組織在4%多聚甲醛固定液（#BL539A；Biosharp）中固定48 h，常規(guī)修剪成標準橫截面，并用石蠟處理。然后切成4 μm的切片，裝在涂有3-aminopropyltriethoxysilane的載玻片上，HE染色后觀察卵巢組織狀態(tài)。用Panoramic 250 Flash II幻燈片掃描儀掃描玻片，并用3DHISTECH全景玻片觀察儀以100倍和200倍的放大率拍照。

1.3 RNA提取、文庫構建和測序

使用TRIzolTM LS Reagent提取卵巢組織總RNA。采用Agilent 2100生物分析儀對RNA質量進行評估，采用RNase-free瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。采用RNA完整性編號（RNA integrity number， RIN）評價總RNA的完整性。RIN值越小表示降解越嚴重，10表示完整性最高。當RIN≥7且28S/18S≥0.7時，樣品質量滿足試驗要求。用QIA quick RT-qPCR提取試劑盒（Qiagen）純化cDNA片段，末端修復，poly（a）尾，連接Illumina測序適配器，由Gene Denovo生物技術公司使用Illumina Nova seq. 6000測序儀進行測序。

1.4 蛋白質提取和質量控制

稱取適當的樣品，加入1×Cocktail，在冰上放置5 min后，加入10 mmol·L-1 DTT。然后用研磨機研磨組織，離心后獲得上清液。再加入10 mmol·L-1 DTT，在56 ℃水浴中放置1 h。然后加入55 mmol·L-1 IAM，在暗室中放置45 min。之后向蛋白溶液中加入預冷丙酮（1∶5），在-20 ℃下保存30 min，離心15 min（4 ℃，25 000 g）后棄上清液，將沉淀風干后加入裂解緩沖液。第二次離心后得到蛋白質溶液（上清液）。采用Bradford定量和SDS-PAGE進行蛋白質質量控制。

1.5 數據處理和生物信息學分析

使用FASTP（version 0.18.0）軟件對測序獲得的reads進行篩選。過濾標準如下：1）刪除包含適配器的reads數據；2）去除包含超過10%未知核苷酸的序列；3）剔除含有50%以上低質量（Q值≤20）堿基的低質量reads。使用短讀長比對工具Bowtie225（版本2.2.8）將讀長映射到核糖體RNA（rRNA）數據庫，然后刪除映射的rRNA讀長。剩余的純序列進一步用于組裝和基因豐度計算。使用HISAT2將干凈的配對端序列映射到參考基因組。使用StringTie v1.3.127基于參考方法組裝每個樣本的映射reads。采用StringTie軟件計算每個基因的FPKM（fragment per kilobase of transcript per million mapped reads）值，以量化其表達豐度和變異。FPKM公式如下：

FPKM=106CNL/103

設FPKM（A）為轉錄本A的表達量，C為轉錄本A映射的片段數，N為映射到參考基因的片段總數，L為轉錄本A上的堿基數。根據每個基因的FPKM值，通過表達分布圖顯示不同樣本基因或轉錄本的表達分布。此外，使用R程序（http：//www.r-project.org/）進行主成分分析（PCA），并計算樣本之間的Pearson相關系數，了解樣本之間的可重復性，并幫助排除離群樣本。采用R軟件DESeq包以log2FCgt;1，P≤0.05為篩選標準，篩選就巢期萎縮卵巢與正常產蛋期卵巢之間的差異表達基因（DEGs）。使用熱圖和火山圖來顯示兩組之間的差異。

1.6 基因和蛋白功能富集分析

在GO（http：//www.geneontology.org/）和KEGG（https：//www.genome.jp/kegg/）數據庫中檢索所有的DEGs和DEPs，計算每個詞條注釋的基因數量。GSEA（gene set enrichment analysis）分析能夠有效彌補微效基因的有效信息挖據不足等問題，更為全面地對某一功能單位（KEGG pathway，GO term）的調節(jié)作用進行解釋。對GSEA富集分析的原理闡述見Powers等［22］的報道。

1.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證

采用Trizol法提取NO組和AO組卵巢組織總RNA。然后將提取的RNA按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser說明進行逆轉錄得到cDNA。根據測序分析結果，隨機選取FN1、COL1A1、SGK2、CASTOR1、ACTA1和MMP10，共6個差異表達基因，利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和測序數據尋找目標基因序列，利用生工生物、NCBI等網站在線設計引物（表1），引物設計完成后，利用NCBI primer blast功能進行引物特異性比對，比對合格的引物交由華大基因合成。以反轉錄合成的定量cDNA為模板，以β-actin為內參基因，按照TB Green premix Ex TaqTM Ⅱ定量試劑盒說明進行反應液配制。反應體系共20 μL：（2×）TB Green premix Ex Taq Ⅱ （Tli RNase H Plus） 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 1.6 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR擴增程序：預變性階段為95 ℃ 30 s；循環(huán)變性階段為95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s（40個循環(huán)）；熔解曲線為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣品進行3次生物學重復。

1.8 數據統計分析

采用2-△△CT法計算基因相對表達量，以β-actin作為內參基因，所有試驗數據均以“Mean±SEM”表示，使用SPSS 27.0單因素方差分析（One-way ANOVA）和獨立樣本t檢驗分析數據的顯著性，Plt;0.05（在圖中用*表示）為顯著相關，Plt;0.01（在圖中用**表示）為極顯著相關。采用GraphPad Prism 8（version8.2.1）、R語言（version4.2.0）、Cytoscape（Version3.8.2）和AI（Adobe illustrator 2021）進行可視化統計學分析。

2 結 果

2.1 城口山地雞持續(xù)產蛋期與就巢期狀態(tài)和卵巢組織解剖學形態(tài)觀察

在養(yǎng)殖過程中發(fā)現，持續(xù)產蛋期的城口山地雞表現出站立有神、翅收縮有力且緊貼體軀、動作敏捷、聽覺敏銳、食欲旺盛等特征（圖1A）。而處于就巢期的城口山地雞會發(fā)生窩巢、被毛蓬松、停止產蛋、食欲不振、攻擊性變強、活動減少、反應遲緩等一系列生理狀況的變化（圖1B）。為了進一步探究就巢期城口山地雞卵巢的變化，解剖并觀察了持續(xù)產蛋期和進入就巢期10、20、30天的城口山地雞的卵巢組織。從產蛋期到就巢期并伴隨著就巢時間的延長，卵巢體積逐漸變小。在產蛋期的卵巢中可以看見等級卵泡生長發(fā)育活躍、層次分明，而進入就巢期后等級卵泡停止發(fā)育，甚至發(fā)生閉鎖。產蛋期的卵巢包含了從原始卵泡到排卵前卵泡的各個發(fā)育階段的卵泡結構。產蛋期的卵巢中有6個大的排卵前卵泡（F1-F6），大量的包括原始卵泡、初級卵泡、白色卵泡（LWF、SWF）和黃色卵泡（SYF）的等級前卵泡，以及處于退化階段的排卵后卵泡（POF）。而就巢期卵巢體積較小，呈現萎縮狀，出現大量閉鎖卵泡，卵泡的數量也越來越少，僅含有一些小卵泡，無突出大卵泡（圖1C-F）。在光學顯微鏡下觀察卵巢石蠟切片，在NO組的卵巢中，可以看到在正常的卵巢中顆粒層致密緊湊，卵泡內膜層與外膜層結構清晰。卵巢中有許多被單層扁平或立方狀的顆粒細胞包圍的原始卵泡，以及多個被一層立方體顆粒細胞包圍的初級卵泡（圖1G）。與NO組相比，AO組卵巢中也有許多被單層扁平或立方狀的顆粒細胞包圍的原始卵泡，但是卵泡數目較少，初級卵泡顆粒層和膜層之間界限不清，與周圍細胞分離脫落，胞漿濃縮，顆粒細胞增生，顆粒層變厚，細胞密度變稀疏。膜層中，內膜層和外膜層從形態(tài)上無法辨認（圖1H）。上述研究結果表明，就巢導致蛋雞卵巢萎縮，卵泡大量閉鎖。

2.2 城口山地雞持續(xù)產蛋期與就巢期卵巢的轉錄組分析

為了進一步探究就巢導致卵巢萎縮的關鍵分子和分子機制，收集了正常產蛋期的卵巢和就巢30天的萎縮卵巢作為樣本，進行了基于RNA-seq的轉錄組學分析和基于iTRAQ的蛋白質組學分析。通過轉錄組測序產生了6個cDNA文庫，每個樣本平均獲得93 064 205（超過99%）個clean reads，Q30堿基百分比都在92%以上。Pearson相關性分析表明，就巢組與正常組樣本之間的相關系數平方（R2）gt;0.9。以上結果符合后續(xù)生物信息學分析的要求。共鑒定出了16 183個mRNAs，包括已知的15 817個mRNAs和預測的新的366個mRNAs。AO組中共鑒定出了12 634個基因，其中有284個在AO組中特異表達（圖2A）。AO組與NO組相比，共有930個顯著差異表達的mRNAs（log2FCgt;1，P≤0.05），其中430個表達上調和500個表達下調（圖2B-C）。表2和表3分別展示了log2FC最高的20個上調和下調差異表達基因。雷達圖展示了log2FC值最大的前20個DGEs，以log2FCgt;5，P≤0.05為閾值選擇了23個差異表達的mRNAs進行聚類分析，熱圖進一步揭示了不同組間差異表達模式（圖2D-E）。

2.3 差異表達基因功能富集分析

為了進一步探究DEGs的功能和相關通路，對DEGs進行了GO注釋和KEGG功能富集分析，以了解發(fā)育卵巢和萎縮卵巢的整體轉錄效應。GO功能富集分析結果顯示，DEGs在GO功能富集分析中包含了3個主題，生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞成分（CC）。22.8%的基因與多細胞有機體過程、動物器官發(fā)育、離子結合以及發(fā)育過程等相關（圖3A）。而且，參與這些功能調節(jié)的基因61.8%是表達下調的。

在表達上調的DEGs中，與就巢相關的高度活化的生物過程包括細胞-細胞識別、減數分裂I、體液免疫反應的正調節(jié)、動物器官發(fā)育、調節(jié)食欲和卵母細胞發(fā)育；在分子功能方面，RNA聚合酶II轉錄因子活性、序列特異性DNA結合、核酸結合轉錄因子活性、Netrin受體結合、有機環(huán)狀化合物結合與卵巢萎縮的關聯度最高；在細胞組分中，上調的DEGs主要富集在外部封裝結構、質膜的內在成分等方面（圖3B）。在表達下調的DEGs中，與就巢相關的高度活化的生物過程主要富集在細胞外基質組織、組織發(fā)育、細胞黏附、動物器官發(fā)育和細胞分化；在分子功能方面，就巢產生的變化與金屬離子結合、生長因子結合、胰島素樣生長因子結合最相關；在細胞組分中，下調的DEGs主要富集在細胞外區(qū)域、質膜、抑制素復合物等方面（圖3C）。

KEGG功能富集分析結果顯示，與就巢相關的通路包括ECM受體反應、黏著斑、蛋白質消化吸收、血管平滑肌收縮等（圖3D）。其中，表達上調的DEGs顯著富集到了神經活性配體-受體相互作用、細胞凋亡-多個物種、細胞因子-細胞因子受體相互作用和卵巢類固醇生成等通路（圖3E）。表達下調的DEGs顯著富集到了ECM受體相互作用、黏著、蛋白質消化和吸收、松弛素信號通路、TGF-β 信號通路和雌激素信號通路等信號通路（圖3F）。GSEA分析顯示，細胞周期、卵母細胞減數分裂、黃體酮介導的卵母細胞成熟、雌激素信號通路、Notch信號通路、胰島素分泌、催產素信號通路在卵巢組織中顯著上調。值得注意的是，PI3K-Akt信號通路、Notch信號通路、p53信號通路等與細胞增殖、分化和轉移，細胞生存與死亡，調控細胞命運，參與炎癥反應的重要信號轉導途徑相關的類別也顯著富集。上述結果為從mRNA水平探討就巢導致卵巢萎縮的關鍵調控機制提供了重要的背景信息。

圖4A簡要展示了篩選就巢期卵巢萎縮相關的23個關鍵PI3K-Akt信號通路調節(jié)因子的試驗方案。GSEA結果顯示，在AO組的卵巢組織中，細胞生長和死亡相關通路都被激活（圖4B）。進一步，重點評估了參與PI3K-Akt信號通路（圖4C）的基因，其中包括了6個在AO組中上調的DEGs：FGFR4、LPAR5、CCNE1、NGFR、SGK2、EIF4E1B和17個在AO組下調的DEGs：OSMR、COMP、ITGA8、VTN、COL6A2、COL6A1、PDGFD、THBS2、ITGA10、CHAD、TNC、COL1A2、FN1、COL1A1、THBS1、COL4A2、COL4A1。在熱圖中顯示了這23個基因的FPKM水平（圖4D）。蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPI）顯示，這23個PI3K-Akt信號通路中的調節(jié)因子可以通過7種方式相互作用，包括來自精選數據庫和試驗確定的已知相互作用，基因鄰里、基因融合和基因共生的預測的交互，以及文本挖掘、共表達和蛋白質同源性（圖4E）。繼續(xù)分析了參與的BPs和富集通路。結果顯示細胞通訊、細胞黏附、細胞表面受體信號通路、細胞增殖、細胞遷移和細胞過程的正向調節(jié)是富集最多的BPs（圖4F）。并且，這23個基因顯著富集于肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、Rap1信號通路和Ras信號通路等與細胞黏附和細胞連接的信息與調控，細胞遷移、極化，細胞增殖和存活相關顯著的通路中（圖4G）。

2.4 城口山地雞持續(xù)產蛋期卵巢與就巢期卵巢的蛋白組分析

以NO組為對照組，使用iTRAO對AO組進行蛋白質測序，然后進行LC-MS/MS分析。總共鑒定出91 569個光譜，80 267個肽段、6 703個蛋白質組和6 785個蛋白質。鑒定的蛋白質大部分含有11個以上的肽段。Pearson相關性分析顯示，AO組與NO組樣本之間的相關系數平方（R2）gt;0.9。以上結果符合后續(xù)生物信息學分析的要求。與NO組相比，AO組共鑒定出了6 777個蛋白質，其中有11個在就巢組中特異性表達（圖5A）。AO組與NO組相比，共鑒定出546個顯著差異表達的蛋白質（Fold Changegt;1.5，P≤0.05），其中表達上調的有178個，表達下調的有368個（圖5B）。繪制了火山圖來展示DEPs的詳細情況（圖5C）。雷達圖展示了log2FC值最大的前20個DEPs（圖5D），熱圖選擇了30個DEPs進行聚類分析，進一步揭示了不同組間差異表達模式（圖5E）。

為了進一步分析DEPs的生物學功能，對DEPs進行了GO注釋和KEGG通路富集分析。GO富集分析結果顯示（圖6A），在GO二級分類條目中的生物過程類別中，22.6%的DEPs主要涉及細胞過程、代謝過程、生物過程調控、信號及生物調控功能，且這些DEPs中69.4%是表達下調的。值得注意的是，有幾個DEPs參與了免疫系統過程、生物黏附、繁殖過程、生長和細胞殺傷；在細胞成分類別中，大量的DEPs涉及細胞、細胞部分、細胞器、細胞外區(qū)域、大分子復合物和膜。值得注意的是，少數DEPs涉及細胞外基質、細胞連接和超分子纖維；在分子功能方面，DEPs主要涉及到結合和催化活性。此外還觀察到，下調表達的DEPs數量顯著多于上調表達的DEPs，尤其是富集在與蛋白質結合、催化活性、分子功能調節(jié)劑、結構分子和轉錄因子活性相關的GO條目。這說明通過雞的就巢行為可能通過抑制細胞與大分子物質結合來降低卵巢的代謝過程，從而導致了卵巢的萎縮。然而，在轉運蛋白條目中，上調的DEPs的數量顯著高于下調DEPs的數量，這表明依靠特異轉運蛋白的活性在生物膜內外的化學物質以及信號交換過程中，抑制細胞代謝、信號轉導等廣泛的細胞活動。上述結果與轉錄組分析的結果一致。

KEGG富集分析結果顯示（圖6B），上調的DEPs主要與代謝通路密切相關，如代謝途徑、甘油代謝、糖酵解/糖異生和PPAR信號通路。其中，一些信號通路與機體的能量來源密切相關，特別是甘油代謝和糖酵解/糖異生信號通路。此外，幾個DEPs與谷胱甘肽代謝和PPAR信號通路有關，這些通路主要參與細胞保護、細胞增殖和調節(jié)脂質氧化，促進脂肪細胞分化以增強血糖攝取，維持代謝穩(wěn)態(tài)和炎癥基因的表達（圖6B）。下調的DEPs主要與黏著、肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、PI3K-Akt信號通路、吞噬體和松弛素信號通路有關。其中，黏著和肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)信號通路在細胞與外部基質之間對于細胞凋亡、增殖、運動（分裂、遷移、收縮和黏附）、分化等過程都具有重要作用，特別是PI3K-Akt信號通路對許多細胞基本進程的調控，包括細胞生長、轉錄、翻譯、細胞增殖、細胞運動及糖原代謝中調控關鍵細胞反應。此外，一些DEPs與血管平滑肌收縮、ECM與受體的相互作用和核糖體有關，同樣在細胞遷移、增殖、分化和信號轉導等細胞活動中發(fā)揮重要作用（圖6C）。這些數據為在蛋白質水平上闡明就巢與卵巢萎縮之間的調控機制提供了重要的背景信息。

2.5 轉錄組學和蛋白質組學聯合分析

為了挖掘轉錄組和蛋白組的互補性和整合性，分析了DEGs和DEPs之間的相關性。大量轉錄本編碼的蛋白質覆蓋率很高，其中，顯示了930個DEGs和546個DEPs，共包括153個在mRNAs和蛋白質水平均有差異表達的基因（圖7A）。此外，為了研究蛋白質水平的變化是否與相應轉錄本的變化相關，繪制了四象限圖分析了相應mRNAs與蛋白質比率的分布。大多數mRNAs與蛋白質的比值集中在圖的中心位置，只有部分基因和蛋白質的表達水平不一致，大多數表達差異顯著基因的mRNAs與蛋白質的比值集中在圖的第二、三象限，表達水平是一致的（圖7B）。對表現出相同表達趨勢的mRNAs和蛋白質進行GO注釋和KEGG通路富集分析，GO分析表明，這些基因主要富集于細胞、細胞器、信號、代謝、結合、生物調控和催化活性（圖7C）。通過KEGG通路富集分析，它們主要參與黏著斑、ECM受體反應、PI3K-Akt信號通路（圖7D）。值得注意的是，這3個通路都是典型的與細胞遷移、增殖、分化和信號轉導等廣泛的細胞活動顯著相關的通路。進一步分析了這3個通路調控網絡中富集到的基因，表4中顯示了富集到3個候選通路中的基因和蛋白質，其中COMP、FN1、ITGA8、THBS1、COL4A2、COL4A1、COL1A1為3個通路中共有的基因，推測它們可能在蛋雞就巢期間卵巢結構和功能的變化中起著重要的作用，可以作為家禽就巢性的候選基因。利用STRING數據庫（https：//cn.string-db.org/）進一步分析，闡明蛋白-蛋白相互作用（PPI）結果（圖7E）。

2.6 測序結果驗證

隨機選擇在AO組上調或下調的6個基因，FN1、COL1A1、SGK2、CASTOR1、ACTA1和MMP10在NO組和AO組進行qRT-PCR驗證。結果顯示RT-qPCR和RNA-seq結果一致，6個差異表達基因的相對表達量均有顯著差異（Plt;0.05或Plt;0.01）（圖8），結果驗證了測序數據的可靠性。

3 討 論

本研究探討了就巢導致卵巢萎縮的關鍵調控機制，特別是就巢如何調控卵巢萎縮導致卵泡閉鎖。首先，觀察了就巢組萎縮卵巢的HE染色切片，與產蛋組正常卵巢相比，可以看出卵泡中顆粒層和膜細胞有明顯的減少，卵巢發(fā)生萎縮，卵泡大量閉鎖，這與He等［23］的研究結果是一致的。然后，收集了正常卵巢和萎縮卵巢樣本，進行了基于RNA-seq的轉錄組學分析和基于iTRAO的蛋白質組學分析，篩選出大量的DEGs和DEPs，并進一步進行了關聯分析，不僅代表了mRNAs表達水平，也有展現翻譯后的特征。轉錄組和蛋白組的聯合分析將為探究就巢與卵巢萎縮之間的內在調控機制提供一個全面的視角。

禽類有超過95%的卵泡會發(fā)生內源性的閉鎖，當卵泡發(fā)育到排卵前卵泡階段時，一般不會發(fā)生內源性的閉鎖，而其他階段的卵泡都會發(fā)生不同程度的閉鎖。Tilly等［24］發(fā)現，雞卵泡閉鎖存在顆粒細胞凋亡現象。也有報道提出，家鵝就巢導致卵泡閉鎖，且與顆粒細胞凋亡相關［25-26］。細胞凋亡是維持生物體穩(wěn)定的基本生理機制。在家禽中，卵泡閉鎖發(fā)生在卵泡發(fā)育的各個階段。在正常生長的卵泡中，顆粒細胞的分裂、增殖和凋亡也是并存的［27］，其中顆粒細胞的凋亡會直接導致卵泡發(fā)生閉鎖［28］。在本研究中觀察到與細胞凋亡通路相關的基因，抗凋亡基因MAPK10、NGFR、BIRC7和BIRC均表達上調，而SEPTIN4表達下調。SEPTIN4是一種定位于線粒體的蛋白，主要通過與X連鎖凋亡抑制因子（x-linked inhibitors of apoptosis，XIAP）結合促進細胞凋亡［29］。分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通過轉錄和轉錄后機制調節(jié)細胞凋亡。MAPK可將細胞外信息傳遞至細胞核中，在生理及病理過程中發(fā)揮重要的作用。MAPK在細胞死亡（促凋亡和抗凋亡）中起哪種作用取決于不同刺激激活靶點的多樣性，或特定刺激作用的分子環(huán)境。然而，即使在受到特定刺激的某一細胞類型中，MAPK的激活也可能是促凋亡和/或抗凋亡［30］。因此，推測在就巢期間MAPK與促進卵泡閉鎖的細胞凋亡和促進卵泡發(fā)育的抗凋亡的不同膜受體結合的現象同時存在。不過，這還需要進一步的試驗驗證。

然而，細胞凋亡并不是導致卵泡閉鎖的唯一因素。HPG軸的協調活動通過幾種生殖內分泌激素和卵巢內生長因子的啟動在維持卵泡生長和排卵中發(fā)揮著至關重要的作用。對雞的分級前、排卵前和排卵后卵泡進行轉錄組學分析時，也篩選出了差異表達的凋亡和類固醇生物合成相關的基因［31］。同樣，在本研究中也篩選出了一些與卵巢類固醇生成信號通路相關的基因，如CYP1A1、CYP2J2、HSD17B7和BMP15表達顯著上調，而HSD3B1表達下調。細胞色素P450（CYP）超家族包含的基因編碼的酶反應可以在多種方面發(fā)揮作用，包括膽固醇代謝和膽汁酸生物合成、類固醇合成與代謝、維生素D3的合成與代謝等，也包括無數涉及酶反應的重要生命過程。許多CYP酶對內源性和外源性底物的代謝會導致活性氧代謝物（ROM）介導的氧化應激，而氧化應激是誘發(fā)細胞凋亡的一個主要信號［32］。而CYP2J2（CYP家族2亞家族J成員2）或其代謝物會通過增加MAPK和PI3K/Akt通路的活性，以及增強表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）的磷酸化，促進癌細胞明顯增殖。此外，CYP2J2還通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL以及下調促凋亡蛋白Bax來抑制癌細胞凋亡［33］。而且，許多CYP基因的突變導致先天性代謝缺陷，并導致許多臨床相關疾病。但在就巢過程中類固醇生成信號通路相關的基因促進或抑制細胞凋亡并可能進一步導致卵泡閉鎖的作用機制目前仍不清楚，這些都為今后的研究提供了方向。

此外，在本研究中觀察到有多個基因及其編碼的蛋白質顯著富集到了ECM受體反應信號通路，包括COMP、FN1、ITGA8、THBS1、SDC1、COL4A2、COL4A1、TNC和COL1A1，但這些基因均表達下調。ECM作為一種細胞分泌組裝的蛋白質和多糖的復雜網絡結構，不僅能為細胞提供附著位點和結構支持，還可以為調節(jié)細胞活性和器官、組織功能提供重要的生物信息［34］。禽類卵巢中卵泡的生長、發(fā)育、排卵和閉鎖不僅伴隨著細胞生理學的變化，而且還伴隨ECM的廣泛重組。研究表明，ECM成分提供了組織特異性的支架，影響基本的細胞過程，如增殖、分化和凋亡等。卵泡發(fā)育過程中ECM的全面變化需要一系列的蛋白水解過程，對于正常的卵泡發(fā)育、功能、閉鎖和退化至關重要［35］。有研究指出，卵泡發(fā)育或者閉鎖期間的ECM周轉在很大程度上由基質蛋白控制，除了特異性降解ECM成分和激活其他基質金屬蛋白酶外，它們還可以通過釋放大量信號蛋白影響多種信號通路，在正常的生理和病理過程中調節(jié)細胞生物學，其中包括生長因子、細胞因子、鈣黏蛋白E、Fas配體和腫瘤壞死因子等［36］。肌腱蛋白C（tenascin C，TNC）是ECM分泌的具有中介和整合子功能的基質細胞蛋白，可以正向或負向地影響信號通路［37］。TNC在發(fā)育過程中高度表達于ECM中，參與了發(fā)育和組織重塑過程中的形態(tài)變化，以及細胞遷移、增殖分化、凋亡與細胞間的黏附和信號傳遞［38］。血小板源生長因子（plateletderived growth factor，PDGF）可以通過PI3K-AKT信號通路調節(jié)TNC的表達，導致轉錄因子SP、ETS1和ETS2與特異性啟動子結合［39］，參與細胞增殖、分化和死亡的調控。FN1基因編碼纖維連接蛋白也是ECM的主要成分，在細胞表面和細胞外基質中以二聚體或多聚體形式存在，參與了多個生物過程，主要作用是支持細胞黏附，也參與細胞骨架組織、細胞遷移和重要的生理過程［40］。綜上所述，推測就巢可能會導致多種轉錄因子活化降低或者存在細胞因子介導的蛋白質水解，降低ECM蛋白的表達，從而進一步抑制了細胞內信號通路在卵泡發(fā)育過程中調控細胞遷移、增殖分化的信號轉導。

由生長因子調控的PI3K-Akt信號網絡無處不在，它通過直接調控營養(yǎng)物質轉運體和代謝酶，或調控轉錄因子來調控代謝途徑關鍵組分的表達，從而對細胞代謝產生多種下游影響。如Cui等［41］的研究表明，蛋雞就巢期萎縮卵巢高表達miR-204通過PI3K/Akt信號通路促進顆粒細胞凋亡。在本研究中，許多富集于PI3K-Akt信號通路的基因及其對應編碼的蛋白質被上調，包括FGFR4、LPAR5、CCNE1、NGFR、SGK2和EIF4E1B。其中，成纖維細胞生長因子受體4（fibroblast growth factor receptor 4，FGFR4）是細胞膜上高度保守的酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinases，RTKs）家族的成員，通過與配體結合并激活下游信號通路參與調節(jié)細胞增殖、分化和生存等多種生物學過程［42］。FGFR4在妊娠小鼠的卵巢中有表達，并且在卵泡發(fā)育不同階段的卵巢卵泡中均有表達［43］，可能介導從卵泡發(fā)生的最早階段開始的卵母細胞和顆粒細胞之間的旁分泌相互作用。溶血磷脂酸受體5（lysophosphatidic acid receptor 5，LPAR5）是介導細胞內對溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）反應的G蛋白偶聯跨膜溶血磷脂酸（LPA）受體之一，具有多種生物學功能，與細胞增殖、形態(tài)發(fā)生、分化和防止細胞凋亡有關，并參與蛋白質水解和介導細胞內對LPA的反應［44］。神經生長因子受體（nerve growth factor receptor，NGFR）不具有內在的酶活性，它的信號傳遞依賴于細胞內結合蛋白的募集，從而激活不同的信號通路，通過MAPK、PI3K/AKT典型信號途徑傳遞細胞內信號，介導細胞存活［45］。綜上所述，蛋雞就巢可激活多種細胞因子受體，與配體結合激活PI3K-Akt信號轉導通路，維持卵泡顆粒細胞的生存或者死亡狀態(tài)，然而，具體的機制還需要進一步的試驗驗證。

4 結 論

本研究獲得了就巢導致卵巢萎縮的基于RNA-seq的轉錄組學圖譜和基于iTRAQ的蛋白組學圖譜，篩選出了重要的DEGs和DEPs。通過對這些DEGs和DEPs進行功能富集分析，發(fā)現就巢期卵巢組織中多種細胞因子受體與配體介導部分功能蛋白的水解，從而影響信號轉導的細胞環(huán)境，進一步影響下游細胞活動。同時，篩選出了7個蛋雞就巢性的候選基因COMP、FN1、ITGA8、THBS1、COL4A2、COL4A1、COL1A1。本研究為深入了解蛋雞就巢期卵巢萎縮的調控機制提供了理論基礎，為家禽就巢性遺傳改良和分子育種提供有效參考。

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（編輯 郭云雁）