摘 要： 旨在了解大尾寒羊基因組遺傳變異特征和群體結(jié)構(gòu)，可以為更好地保護(hù)和利用大尾寒羊提供指導(dǎo)。本研究對170只（66只公羊，104只母羊）大尾寒羊進(jìn)行了全基因組重測序，利用GATK、Manta、Plink等軟件對大尾寒羊基因組遺傳變異、群體結(jié)構(gòu)和連鎖不平衡等進(jìn)行了分析，以期了解大尾寒羊基因組變異特征和群體結(jié)構(gòu)。測序共獲得1 599.56 G高質(zhì)量數(shù)據(jù)（平均9.409 G·只-1）。大尾寒羊群體中共發(fā)現(xiàn)50 276 079個(gè)SNPs和7 240 540個(gè)InDel，它們多分布于基因間和內(nèi)含子區(qū)域。群體的基因組結(jié)構(gòu)性變異（SV）最多的類型為染色體間的易位（CTX），平均每只羊有415.82個(gè)CTX，主要分布在基因間區(qū)域；發(fā)生拷貝數(shù)變異（CNV）最多的區(qū)域在外顯子，平均每只羊有175個(gè)。主成分分析顯示，大尾寒羊個(gè)體較分散，聚集不集中。結(jié)合親緣關(guān)系、系統(tǒng)發(fā)育樹和群體結(jié)構(gòu)，將大尾寒羊分為6個(gè)家系，各家系含量差別較大，體型有差異。群體聚類分析中發(fā)現(xiàn)有些個(gè)體祖先成分較為單一。群體連鎖不平衡（LD）分析顯示LD衰減速度快，群體遺傳多樣性較高。馴化中受選擇的基因主要與脂質(zhì)代謝和產(chǎn)熱有關(guān)。綜上，大尾寒羊群體包含6個(gè)家系，遺傳多樣性較豐富，保種效果良好，建議對小家系進(jìn)行擴(kuò)繁，大家系注意減少近交，確保家系結(jié)構(gòu)平衡，同時(shí)注重大尾寒羊的開發(fā)和利用。

關(guān)鍵詞： 大尾寒羊；全基因組重測序；基因組變異；群體結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S826.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-4968-12

收稿日期：2024-03-26

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（ZR2021MC130）; 山東省農(nóng)業(yè)良種工程（2019LZGC019）

作者簡介：梁慧麗（2000-），女，山東菏澤人，碩士生，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail： 2210190109@stu.lcu.edu.cn

*通信作者：曹貴玲，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： cglling@126.com

Analysis on Genomic Variation and Population Structure of Large-tailed Han Sheep Based

on Whole Genome Resequencing

LIANG" Huili1， XIE" Yujing1， SI" Bowen1， WANG" Guiying1， JIANG" Yunliang2， CAO" Guiling1，2*

（1.Agricultural Science and Engineering School， Liaocheng University， Liaocheng 252000，" China;

2.Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Biotechnology and Disease Control and Prevention，

Shandong Agriculture University， Taian 201718，" China）

Abstract：" This study aimed to analyze the genomic variations and population structure of Large-tailed Han （LTH） sheep to provide guidance for scientific conservation and sustainable utilization. Whole-genomic sequencing data from 170 LTH sheep （66 rams， 104 ewes） was used to investigate the genomic variations， population structure and linkage disequilibrium by GATK， Manta， Plink and other softwares. The 1 599.56 G clean data was obtained and on average， 9.409 G clean data per sheep. In the LTH sheep population， 50 276 079 SNPs and 7 240 540 InDel were found， which were mostly distributed in intergenic and intronic region. The interchromosomal translocation （CTX） was the most common type of structural variation （SV） in the genome of LTH sheep， on average， 415.82 CTX per sheep， and also mainly distributed in the intergenic region. The copy number variation （CNV） was mostly distributed in exons， 175 CNV per sheep on average. The result of principal component analysis showed that individuals were relatively scattered and poorly clustered. According to the genetic relationship， phylogenetic tree and population structure， the 170 LTH sheep were clustered into 6 families， and there was a significant difference in family size and body size. The results of cluster analysis showed that ancestry component of some individuals was single. The linkage disequilibrium analysis showed that LTH sheep population had a relatively fast attenuation rate. The selected genes during domestication were mainly related with lipids metabolism and thermogenesis. In conclusion， LTH sheep population contains 6 families and has rich genetic diversity and remarkable conservation effect. It is suggested to expand the number of small families and to prevent inbreeding in the big families to keep a balanced population size and structure and focus on the utilization of LTH sheep.

Key words： Large-tailed Han sheep; whole genome resequencing; genomic variation; population structure

*Corresponding author：" CAO Guiling， E-mail： cglling@126.com

大尾寒羊（Large-tailed Han （LTH） sheep）屬肉脂兼用型地方綿羊品種，具有耐粗飼、抗病力強(qiáng)和肉脂性能好的特點(diǎn)。大尾寒羊是長脂尾品種，脂尾肥大，形似芭蕉扇，桃形尾尖上翻，緊貼于尾溝，下垂至飛節(jié)以下，有些個(gè)體尤其是公羊，尾接近或拖及地面［1］。綿羊的脂尾特征被認(rèn)為是對惡劣環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)，是綿羊在食物短缺時(shí)期的寶貴儲備［2］。近幾年，人們關(guān)注羊尾脂沉積的生理、生化和基因組調(diào)控，以揭示能量和脂質(zhì)代謝在綿羊尾型形成中的潛在作用機(jī)制。有不少研究利用RNA-seq、基因組測序等技術(shù)分析不同尾型羊的尾脂轉(zhuǎn)錄組［3-4］和脂質(zhì)成分［5］、腸道微生物差異［6］和基因組差異［7-8］等，發(fā)現(xiàn)了一些影響綿羊尾型的基因如PDGFD、POSTN、LGALS12、GGPS1和SETD4等。也有一些研究以大尾寒羊?yàn)檠芯坎牧蠈d羊脂尾形成、尾脂沉積機(jī)制等進(jìn)行了分析［9-13］。

在物質(zhì)匱乏的年代，大尾寒羊的尾脂作為食物給人類提供了能量，但隨著生活水平的不斷提高，人們對尾脂的需求越來越少。另外，在現(xiàn)代化養(yǎng)殖模式下，大尾寒羊的長脂尾帶來了諸多不便，如不利于配種，加上飼料轉(zhuǎn)化率低等諸多原因，導(dǎo)致人們飼養(yǎng)大尾寒羊的意愿降低，大尾寒羊數(shù)量減少，目前僅存數(shù)百只。為了保護(hù)這一獨(dú)特的優(yōu)良遺傳資源，我國已經(jīng)建立了國家級和山東省省級大尾寒羊保種場進(jìn)行活體保種，并進(jìn)行了基因組和精液保存［14］。但目前大尾寒羊群體系譜記錄不完整，親緣關(guān)系模糊等問題對大尾寒羊保種造成了一定困難。如何更好地保存、開發(fā)和利用大尾寒羊是目前函待解決的問題。全基因組重測序基于高通量測序技術(shù)，將目標(biāo)群體基因組序列與已發(fā)表的參考基因組進(jìn)行比對，可以了解目標(biāo)群體的基因組變異特征，并對群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進(jìn)行分析［15］。為了更好地了解大尾寒羊基因組變異特征和群體結(jié)構(gòu)，本研究對170只大尾寒羊進(jìn)行全基因組重測序，獲得大尾寒羊基因組SNP、Indel、SV等變異特征，并利用SNP數(shù)據(jù)對群體遺傳結(jié)構(gòu)和受選擇基因進(jìn)行了分析，研究結(jié)果可為大尾寒羊的保護(hù)、開發(fā)和利用提供參考，對羊遺傳資源與生物多樣性保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物和體尺測定

選擇位于山東省聊城市國家大尾寒羊保種場的大尾寒羊?yàn)檠芯繉ο螅膊杉?70只6月齡以上大尾寒羊的血液樣品，其中公羊66只，母羊104只。頸靜脈采血5 mL，EDTA抗凝，帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存。

依據(jù)NY/T 1236—2006《綿山羊生產(chǎn)性能測定技術(shù)規(guī)范》標(biāo)準(zhǔn)中的方法用羊用測杖和軟尺測量大尾寒羊的體高、體長、胸圍、管圍、臀高、腰高、尾長、尾寬等體尺數(shù)據(jù)。

1.2 大尾寒羊全血液基因組提取

利用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生物，DP348）對每只大尾寒羊血液進(jìn)行基因組DNA提取。利用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA完整性，利用微量紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度和純度。

1.3 大尾寒羊全基因組測序與數(shù)據(jù)過濾、比對

將合格的DNA樣品送至華大基因生物科技有限公司進(jìn)行全基因組重測序。簡要步驟如下：將合格的基因組DNA樣品用Covaris儀超聲波隨機(jī)打斷為小片段用來構(gòu)建文庫。之后用Agencourt AMPure XP-Medium kit進(jìn)行片段選擇，使樣品條帶集中在200～300 bp，并將樣品純化；進(jìn)行末端修復(fù)，加“A”后與接頭連接。對連接產(chǎn)物PCR擴(kuò)增后進(jìn)行片段篩選。將PCR產(chǎn)物變性為單鏈后進(jìn)行環(huán)化，完成文庫制備。通過BGISEQ平臺對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行測序。測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，即raw reads。用華大基因SOAPnuke （V1.5.6）軟件將原始序列的接頭序列、含N過多和少量低質(zhì)量序列過濾，得到clean data。應(yīng)用短序列比對軟件BWA （V0.7.17-r1188）［16］將clean data 比對到參考基因組（GCF_000298735.2_Oar_v4.0_genomic.fna）上，并選擇mapQ值大于30的reads進(jìn)行后續(xù)的變異檢測分析。

1.4 變異檢測

SNP和InDel檢測與注釋：使用GATK （V4.1.2.0）［17］檢測群體所有樣品的SNP和InDel，并對每個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)控標(biāo)記，對于SNP質(zhì)控條件為“QDlt;2.0FSgt;60.0MQlt;40.0MQRankSumlt;-12.5ReadPosRankSumlt;-8.0”；對于InDel質(zhì)控條件為“QDlt;2.0 FSgt;200.0 SORgt;10.0MQRankSumlt;-12.5 ReadPosRankSumlt;-8.0”。使用ANNOVAR軟件［18］對每個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋。結(jié)構(gòu)性變異（structural variation， SV）檢測和注釋：使用Manta （V1.6.0）軟件［19］檢測群體樣品的SV信息，包括插入（insertion， INS）、缺失（deletion， DEL）、染色體易位（translocation）和染色體倒位（inversion）等，使用 ANNOVAR軟件對SV位點(diǎn)進(jìn)行注釋。拷貝數(shù)變異（copy number variation， CNV）檢測與注釋：使用Control-FREEC （V11.6）軟件［20］檢測每個(gè)樣品的CNV。根據(jù)設(shè)定的物種染色體倍性ploidy=2，用Control-FREEC軟件以滑窗的形式自動計(jì)算固定長度區(qū)域的測序深度，并對其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，從而得到CNV區(qū)域的變異信息。如果連續(xù)窗口內(nèi)的測序深度比該物種染色體倍數(shù)大，則表示該區(qū)域CNV類型為“gain”，如果連續(xù)窗口內(nèi)的測序深度比該物種染色體倍數(shù)小，則該區(qū)域CNV類型為“l(fā)oss”。使用 ANNOVAR軟件對CNV位點(diǎn)進(jìn)行注釋。

1.5 主成分分析（principal component analysis， PCA）

使用Plink （V1.90）［21］軟件利用SNP標(biāo)記構(gòu)建親緣關(guān)系G矩陣計(jì)算個(gè)體間的親緣系數(shù)，并計(jì)算前3個(gè)主成分（PC1、PC2、PC3），結(jié)果通過R studio進(jìn)行可視化。對于親緣關(guān)系分析，使用VanRaden算法進(jìn)行所有樣品之間的親緣關(guān)系矩陣計(jì)算。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建與群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

使用FastTree （V2.1.11）軟件［22］構(gòu)建所有樣品的系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用R包ggtreee對結(jié)果進(jìn)行畫圖。使用Admixture （v1.3）軟件［23］分別將2～8賦值于祖先數(shù)目（K值）進(jìn)行運(yùn)算，K值的迭代次數(shù)依次為10 000，使用R軟件pophelper程序計(jì)算K值并對多次重復(fù)的結(jié)果進(jìn)行合并，確定最優(yōu)K值，使用pophelper程序展示其群體結(jié)構(gòu)組成。

1.7 連鎖不平衡分析

使用PopLDdecay （v3.41）［24］軟件計(jì)算群體的連鎖不平衡（linkage disequilibrium， LD）衰減率，使用R語言腳本以及Perl語言腳本處理結(jié)果繪制LD衰減曲線圖。

1.8 選擇清除分析

使用vcftools （V0.1.16）［25］ 軟件，設(shè)定窗口大小為100 kb，劃窗距離為50 kb，計(jì)算群體內(nèi)部不同區(qū)域的堿基多樣性系數(shù)（pi）和偏離中性假說的D系數(shù)（Tajima’s D）來篩選受選擇的區(qū)域及相關(guān)基因。對于受選擇的基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 大尾寒羊基因組DNA提取質(zhì)量檢測

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性（圖1），由圖可見DNA條帶單一，表明提取的DNA完整性好，測定濃度和純度后質(zhì)量合格，可以用于后續(xù)分析。

2.2 大尾寒羊全基因組重測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

對170個(gè)DNA樣品進(jìn)行全基因組重測序，共產(chǎn)生1 615.53 G原始測序數(shù)據(jù)，每只大尾寒羊Raw data平均為9.503 G，Raw reads數(shù)量平均值為6.335×107。經(jīng)過SOAPnuke軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行接頭過濾、低質(zhì)量過濾和去N過濾后，最終得到1 599.56 G高質(zhì)量的可用數(shù)據(jù)，平均每只羊獲得的clead data平均值為9.409 G，clean reads平均為6.272×107條。過濾率平均值為99.01%，測序質(zhì)量較高，Q20%平均為96.35%，Q30%平均為92.23%。用BWA軟件將clean reads比對到參考基因組上，然后使用Qualimap軟件對比對結(jié)果進(jìn)"" 行統(tǒng)計(jì)。樣本比對率為98.61%～99.82%，平均測序深度為3.56×（3.01×～3.66×），平均覆蓋度為89.27%～92.14%。

2.3 大尾寒羊變異檢測與注釋

2.3.1 大尾寒羊SNP檢測與注釋

采用GATK3軟件群體call變異的方法，直接基于所有樣品的比對結(jié)果進(jìn)行變異檢測，得到所有樣品的基因型信息。對群體樣品的基因型信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1。

去除缺失位點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)42 679 749種基因型，其中純合基因型占85.649%，雜合基因型占14.351%。對每個(gè)SNP位點(diǎn)的變異類型進(jìn)行匯總，如圖2a。在12種SNP變異類型中，Ggt;A、Cgt;T、Agt;G和Tgt;C突變?yōu)橹饕蛔冾愋停琓s/Tv值平均為2.4。同時(shí)統(tǒng)計(jì)了基因上下游區(qū)域、外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)域的SNPs數(shù)量，對位于外顯子區(qū)域的突變判斷是否會導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列改變，注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。大尾寒羊群體中共發(fā)現(xiàn)50 276 079個(gè)突變位點(diǎn)，基因間區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域的SNP位點(diǎn)數(shù)量最多，分別占63.407%和33.771%，其他區(qū)域的SNPs不足3%。位于基因內(nèi)的SNPs中，有2 487個(gè)SNPs使終止密碼子提前，編碼蛋白質(zhì)被截短，而有337個(gè)SNP使終止密碼子突變?yōu)槠渌被崦艽a子，使編碼的蛋白質(zhì)長度增加；同時(shí)有159 910個(gè)SNPs改變了氨基酸編碼；這些使編碼蛋白質(zhì)發(fā)生改變的SNPs是后續(xù)重點(diǎn)關(guān)注的位點(diǎn)。有447 017個(gè)SNPs位于UTR區(qū)域，這些SNPs可能對基因表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。

2.3.2 大尾寒羊InDel的檢測與注釋

采用GATK3軟件篩選大尾寒羊基因組中的InDel，基于過濾后的InDel信息，統(tǒng)計(jì)樣品的InDel總數(shù)、雜合InDel、純合InDel的數(shù)量。去除缺失位點(diǎn)后，平均有5 012 268個(gè)InDel基因型，其中純合型占82.672%，雜合型占17.328%。對InDel的位置信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見表2。同SNP類似，分布在基因間和內(nèi)含子中的InDel數(shù)量最多，占96.096%，其他區(qū)域的InDel接近4%。分別有365個(gè)和36個(gè)InDel使編碼的蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目縮短和增加。有13 014個(gè)缺失位點(diǎn)導(dǎo)致蛋白質(zhì)移碼突變，有17 228個(gè)插入位點(diǎn)引起移碼突變。有90 743個(gè)InDel位于UTR區(qū)域，可能對轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有影響。

2.3.3 大尾寒羊SV的檢測與注釋

應(yīng)用BreakDancer檢測結(jié)構(gòu)性變異，能夠檢測到的結(jié)構(gòu)變異類型主要有插入（INS）、缺失（DEL）、顛換（INV）、染色體內(nèi)的易位（ITX）、染色體間的易位（CTX）等。對各類型SV數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，大尾寒羊中CTX數(shù)量最多，平均每只羊基因組內(nèi)有415.82個(gè)，其次是DEL和ITX，平均70個(gè)。而INS的數(shù)量最少，最多的個(gè)體有5個(gè)INS，平均只有0.25個(gè)。與SNP和InDel類似，基因間和基因內(nèi)SV數(shù)量最多，平均有791和181個(gè)，外顯子區(qū)域平均有44個(gè)，而引起剪切位點(diǎn)發(fā)生變化的數(shù)量較少。分析上述SV長度，INV和ITX長度最大（圖2b）。

2.3.4 大尾寒羊CNV的檢測與注釋

使用control-FREEC軟件檢測每個(gè)樣品的CNV，劃窗長度為50 kb，分別對CNV偏高（gain）和偏低（loss）的區(qū)域數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，與其他類型變異不同，CNV數(shù)量最多的區(qū)域是外顯子（平均175個(gè)）和基因間（平均83個(gè)），而其他區(qū)域CNV數(shù)量都較少。統(tǒng)計(jì)發(fā)生拷貝數(shù)變異片段的長度，拷貝數(shù)異常減少的片段長度要明顯比異常增多的片段長度大，有些個(gè)體發(fā)生了大片段拷貝數(shù)減少（圖2c）。

2.4 大尾寒羊群體結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 群體主成分分析

對大尾寒羊170個(gè)個(gè)體進(jìn)行主成分分析，結(jié)果（圖3）表明，主成分1能解釋3.39%的變異，主成分2能解釋2.77%的變異，主成分3能解釋2.56%的變異。大尾寒羊群內(nèi)個(gè)體較為分散，有一些個(gè)體聚集，但聚集不集中且不明顯。

2.4.2 群體進(jìn)化樹與群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

用FastTree軟件構(gòu)建所有大尾寒羊樣品的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，可以將大尾寒羊分為6個(gè)家系，不同家系個(gè)體數(shù)量差別較大，家系3含36個(gè)個(gè)體，而家系4只含15個(gè)個(gè)體。另外有8只母羊（圖4中A組和B組）與公羊親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)家系將大尾寒羊6個(gè)家系和8只親緣關(guān)系較遠(yuǎn)母羊的體尺數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，見表3。不同家系間體尺數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)家系5和家系6的體高、體長、臀高和腰高小于其他4個(gè)家系，體型偏??；而家系4的尾長和尾寬小于其他5個(gè)家系。A組和B組各有4只母羊，雖然是母羊但它們的體高、體長和胸圍均較大。

應(yīng)用Admixture軟件對所有樣品進(jìn)行聚類，計(jì)算相應(yīng)的Q值（第i個(gè)樣品其基因組變異源于第k群體的概率），并繪制群體結(jié)構(gòu)圖，以確定每個(gè)樣品的遺傳組成。利用交叉驗(yàn)證誤差圖方法對K值分析，當(dāng)K=7時(shí)為假定的最佳分群數(shù)目（圖5）。

將進(jìn)化樹和群體結(jié)構(gòu)圖（K=7時(shí)）相結(jié)合，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹和群體遺傳結(jié)構(gòu)圖（圖6）。從圖中可以看出，有些個(gè)體具有較為單一的祖先成分，如母羊87幾乎只有祖先1成分，公羊61、母羊86、98和105幾乎只有祖先2成分，公羊80幾乎只有祖先3成分，母羊186、公羊49和51幾乎只有祖先4 成分，母羊159、212和187的祖先5成分占99.99%，公羊81祖先成分的99.99%是祖先6，公羊18和母羊199幾乎只有祖先7成分。

2.4.3 群體連鎖不平衡分析" 使用PopLDDecay軟件對群體進(jìn)行LD分析，利用LD衰減分析群體的連鎖不平衡狀態(tài)（圖7），大尾寒羊群體的SNP距離在0～50 kb范圍內(nèi)衰減速度從0.51下降至到0.04，LD衰減系數(shù)從0.51衰減到0.1的距離只有5.2 kb，衰減速度快，表明該大尾寒羊群體遺傳多樣性相對較高。

2.5 大尾寒羊基因組選擇清除分析

利用vcftools軟件分析確定了72個(gè)受選擇的基因，如ALOX12B、ALOX15B、AWAT1、SREBF1、GBA2、CERS5和CREB3等，對這些基因進(jìn)行GO和KEGG分析。其中顯著富集的GO條目主要有亞油酸代謝過程（linoleic acid metabolic process）、花生四烯酸代謝過程（arachidonic acid metabolic process ）、長鏈脂肪酸合成和代謝過程（long-chain fatty acid biosynthetic and metabolic process）、肝氧蛋白生物合成和代謝過程（hepoxilin "biosynthetic and metabolic process）和黏著斑蛋白結(jié)合（vinculin binding）等。顯著富集的KEGG信號通路有胰島素分泌（insulin secretion）、花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）、鞘脂代謝（sphingolipid metabolism）、胰高血糖素信號通路（glucagon signaling pathway）、產(chǎn)熱（thermogenesis）等信號通路。

3 討 論

大尾寒羊是長脂尾綿羊品種，是我國非常寶貴的羊遺傳資源。近幾十年來，與蘭州大尾羊［26］、廣靈大尾羊［27］等長脂尾羊一樣，由于雜交等多種原因大尾寒羊數(shù)量銳減。為了防止這一優(yōu)良品種和基因流失，國家和山東省均已建立了保種場，并進(jìn)行了多種形式的保種，取得了一定的成果。但與其他肉用綿羊品種相比，大尾寒羊產(chǎn)肉性能競爭力較弱，其重要產(chǎn)品尾脂目前利用價(jià)值較低，加上對大尾寒羊的開發(fā)和利用進(jìn)展較為緩慢，使大尾寒羊保種仍面臨諸多困難和挑戰(zhàn)。為了全面了解大尾寒羊現(xiàn)存群體結(jié)構(gòu)特征，本研究利用全基因組重測序?qū)Υ笪埠蚧蚪M變異包括SNP、InDel、SV和CNV進(jìn)行了分析，并依據(jù)SNP信息對大尾寒羊親緣關(guān)系、群體結(jié)構(gòu)、連鎖不平衡衰減特征進(jìn)行了分析，為大尾寒羊保種工作提供依據(jù)。

基于全基因組重測序數(shù)據(jù)分析群體遺傳結(jié)構(gòu)是評估地方品種群體情況的有效手段［28］。目前已有不少研究對不同綿羊品種如皮山紅羊［29］、永登七山羊［30］、新疆細(xì)毛羊［31］、祁連白藏羊［32］、蒙古羊和巴盟肉羊［33］等進(jìn)行了全基因組重測序和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，為這些品種的開發(fā)和利用提供了有效信息。本研究采集了保種場內(nèi)6月齡及以上全部大尾寒羊個(gè)體樣品，去除有明確系譜記錄的羊，剩余170只進(jìn)行了全基因組重測序。對測序數(shù)據(jù)質(zhì)控后，進(jìn)行了遺傳變異分析。在12種SNPs變異類型中，Ggt;A和Cgt;T突變數(shù)量最多，且遠(yuǎn)多于其他突變類型，Ts與Tv比例平均為2.4，與其他綿羊群體接近［34-35］。大尾寒羊中發(fā)現(xiàn)了50 276 079個(gè)SNPs，比其他綿羊品種如涼山半細(xì)毛羊［36］、東北細(xì)毛羊［37］和一些國外品種［38］數(shù)量多。大尾寒羊中發(fā)現(xiàn)了7 240 540個(gè)InDel，也比涼山半細(xì)毛羊［36］多。大尾寒羊群體內(nèi)遺傳變異較豐富，是重要的遺傳資源，建議加大對大尾寒羊的保護(hù)力度。在大尾寒羊群體中SNPs突變主要位于基因間區(qū)域（63.41%），其次是內(nèi)含子區(qū)域（33.77%），與東北細(xì)毛羊類似［28］，與涼山半細(xì)毛羊［36］差別較大，而Sun等［36］在涼山半細(xì)毛羊中發(fā)現(xiàn)的SNPs主要位于內(nèi)含子區(qū)域（62.94%），其次是基因間區(qū)域（25.12%）。大尾寒羊基因組結(jié)構(gòu)性變異中染色體間的易位（CTX）數(shù)量最多，INS數(shù)量最少，而其他4個(gè)綿羊品種（南丘綿羊、高山美利奴綿羊、祁連白藏羊和歐拉羊）中DEL和INS最多，但該研究中未分析CTX變異［37］。這些結(jié)果表明，大尾寒羊基因組變異較為豐富，另外群體連鎖不平衡分析也表明大尾寒羊群體遺傳多樣性較高，與劉澤民等［39］用微衛(wèi)星和線粒體D-loop區(qū)聯(lián)合分析得出的結(jié)論一致。近十幾年來，隨著人們消費(fèi)習(xí)慣和羊飼養(yǎng)模式的改變，大尾寒羊的長脂尾不再受人們喜愛，數(shù)量銳減，處于保種狀態(tài)，目前大尾寒羊的育種工作開展較少，也可能是其群體遺傳多樣性相對豐富的原因之一。但目前大尾寒羊群體數(shù)量少，盡管含有較高的遺傳多樣性，保種過程中應(yīng)盡可能避免遺傳距離較近的個(gè)體間的交配。

利用PCA分析可以了解群體遺傳結(jié)構(gòu)，個(gè)體遺傳關(guān)系越近，PCA圖上顯示的直線距離就越近，反之，直線距離就越遠(yuǎn)。對大尾寒羊群體進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)群體內(nèi)整體較為分散，有一些個(gè)體聚集，表明大尾寒羊群體可能并未受到某種強(qiáng)烈選擇，也可能因?yàn)槭峭粋€(gè)品種樣本較多。對大尾寒羊群體構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可以將大尾寒羊分為6個(gè)家系，但每個(gè)群體數(shù)量差異較大，在后續(xù)保護(hù)過程中，要注意對小家系進(jìn)行擴(kuò)繁。根據(jù)各家系體尺數(shù)據(jù)分析結(jié)果（表3），家系5和家系6的體型比其他4個(gè)家系偏小，家系4的尾比其他家系小。根據(jù)這些特點(diǎn)，可以按照大體型、小體型、小型尾等方向進(jìn)行定向選育。另外，可以從河南省引進(jìn)大尾寒羊進(jìn)行雜交，但要制定科學(xué)合理的雜交計(jì)劃，在保證山東大尾寒羊純度的基礎(chǔ)上，豐富大尾寒羊的遺傳多樣性。利用新技術(shù)建立大尾寒羊胚胎和體細(xì)胞保存技術(shù)流程，對各個(gè)家系進(jìn)行胚胎保存，對已經(jīng)保存的精液定期檢測，及時(shí)更新和補(bǔ)充。另外有8只母羊與這6個(gè)家系親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可以引入外源公羊，充分利用這8只母羊增加家系數(shù)量。對群體進(jìn)行祖先成分分析，K=7時(shí)為最佳分群數(shù)目。對個(gè)體的祖先成分分析，有不少個(gè)體幾乎只含有一個(gè)祖先成分，對于這些個(gè)體尤其是公羊，在后期保護(hù)和利用過程中要重點(diǎn)關(guān)注。

對大尾寒羊基因組進(jìn)行選擇清除分析，受選擇基因富集的GO條目和KEGG信號通路主要是一些與脂質(zhì)代謝相關(guān)的信號通路。一些對脂尾羊和瘦尾羊的尾脂轉(zhuǎn)錄組、脂質(zhì)組學(xué)等研究中都有富集到與脂質(zhì)代謝相關(guān)的信號通路［4-5，7，40-41］。本研究中也富集到了與胰高血糖素、胰島素相關(guān)的信號通路。胰高血糖素和胰島素是調(diào)控能量代謝的重要激素，不同尾型的綿羊脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組分析中也富集到相關(guān)信號通路［5，42］。大尾寒羊?qū)匍L脂尾羊，其尾部脂肪在冬季寒冷時(shí)產(chǎn)熱以維持體溫，在秋季又開始沉積脂肪，在脂肪沉積與分解的動態(tài)過程中這些與脂肪代謝相關(guān)的基因起著重要作用。在長期循環(huán)過程中，這些與脂肪代謝、產(chǎn)熱等相關(guān)基因受到強(qiáng)烈選擇，它們特異的時(shí)空表達(dá)賦予長脂尾綿羊獨(dú)特的脂肪代謝特征，利于它們能夠在惡劣的環(huán)境中生存。

4 結(jié) 論

本研究基于全基因組重測序分析了170只大尾寒羊的基因組變異特征和群體結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示大尾寒羊群體內(nèi)具有較為豐富的遺傳變異，群體遺傳多樣性較為豐富。根據(jù)親緣關(guān)系將群體劃分為6個(gè)家系，群體遺傳多樣性較豐富，但家系數(shù)量較少，需要制定合理的配種計(jì)劃，同時(shí)應(yīng)注重大尾寒羊的開發(fā)和利用。

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（編輯 郭云雁）