摘 要： 旨在探究SREBP1基因?qū)x南牛前體脂肪細(xì)胞分化的影響，并通過RNA-Seq技術(shù)探究該基因在晉南牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中的調(diào)控機(jī)制。本研究利用SREBP1基因的過表達(dá)載體和siRNA轉(zhuǎn)染晉南牛前體脂肪細(xì)胞，油酸誘導(dǎo)分化后采用油紅O染色觀察脂滴累積情況，檢測甘油三酯（triglyceride，TG）含量以探究SREBP1基因?qū)ζ浞只挠绊?。利用RT-qPCR和蛋白免疫印跡技術(shù)（Western blotting，WB）檢測過表達(dá)SREBP1基因的前體脂肪細(xì)胞中相關(guān)基因mRNA和蛋白水平變化。RNA-Seq檢測干擾SREBP1基因的脂肪細(xì)胞，篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）進(jìn)行KEGG通路富集分析，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，以探究SREBP1基因參與調(diào)控晉南牛前體脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的潛在靶基因。每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明：1）過表達(dá)SREBP1基因能夠促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的累積、極顯著提高細(xì)胞內(nèi)TG含量（Plt;0.01），干擾SREBP1基因則會(huì)抑制脂滴形成。2）過表達(dá)SREBP1基因后FABP4的mRNA表達(dá)量顯著升高（Plt;0.05），F(xiàn)ABP7、LPL的表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01），WB結(jié)果顯示FABP4蛋白表達(dá)水平明顯升高；3）RNA-Seq共篩選到227個(gè)DEGs，其中包括67個(gè)上調(diào)基因和160個(gè)下調(diào)基因。京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析結(jié)果表明差異基因富集到PPAR信號通路和不飽和脂肪酸生物合成等相關(guān)通路，干擾SREBP1基因后，差異表達(dá)基因FABP4、LPL和FABP7的mRNA表達(dá)量均極顯著降低（Plt;0.01），F(xiàn)ABP4的蛋白表達(dá)水平也明顯降低。由此可知，SREBP1基因?qū)τ跁x南牛前體脂肪細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用，過表達(dá)該基因可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)TG累積，并且極有可能是通過對與脂質(zhì)分化相關(guān)的PPAR信號通路和不飽和脂肪酸生物合成通路的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果為探究SREBP1基因在晉南牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中的調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

關(guān)鍵詞： 前體脂肪細(xì)胞；SREBP1；誘導(dǎo)分化；RNA-Seq；PPAR

中圖分類號：S823.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5003-15

收稿日期：2024-04-28

基金項(xiàng)目：山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（20210302123424）；肉牛邊雞地方特色畜禽種質(zhì)資源創(chuàng)新及品種選育（202201140601026）；山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛體系（2023CYJSTX13）

作者簡介：張唯玉（1999-），女，陜西寶雞人，碩士生，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究，E-mail：zwy18791703785@163.com

*通信作者：張?jiān)獞c，主要從事反芻動(dòng)物營養(yǎng)與飼料及肉牛育種研究，E-mail：yuanqing_zhang@163.com

Regulation of Preadipocyte Differentiation by SREBP1 Gene in Jinnan Cattle

ZHANG" Weiyu， CHENG" Jing， XU" Jiabao， WANG" Jing， TAO" Xinyan， LI" Bo， ZHANG" Yawei，

ZHANG" Dandan， ZHANG" Ning， HAO" Zhenkai， ZHOU" Chenbo， ZHANG" Yuanqing*

（College of Animal Science， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801，" China）

Abstract：" This study aimed to investigate the effect of the SREBP1 gene on the differentiation of Jinnan cattle precursor adipocytes and to explore the regulatory mechanism of this gene in the differentiation of Jinnan cattle precursor adipocytes by RNA-Seq technology. We transfected Jinnan cattle preadipocytes with an overexpression plasmid of SREBP1 gene and siRNA， and after differentiation induced by oleic acid， oil red O staining was used to observe the accumulation of lipid droplets， and triglyceride （TG） content was tested to explore the influence of SREBP1 gene on their differentiation. RT-qPCR and Western blotting （WB） were used to detect changes at mRNA and protein levels of related genes in preadipocytes overexpressing the SREBP1 gene. RNA-Seq was used to detect adipocytes that interfered with the SREBP1 gene， screened differentially expressed genes （DEGs）， performed enrichment analysis of the KEGG pathway， and verified the differentially expressed genes. The potential target genes of the SREBP1 gene involved in regulating the differentiation of precursor adipocytes of Jinnan cattle were explored. Three replicates were set up for each treatment. The results showed as follows： 1） Compared with the control group， overexpression of SREBP1 gene could promote the accumulation of lipid droplets in precursor adipocytes and significantly increase the intracellular triglyceride content （Plt;0.01）， knockdown of SREBP1 gene could inhibit lipid droplet formation. 2） FABP4 mRNA expression significantly increased after overexpression of the SREBP1 gene （Plt;0.05）， the expression of FABP7 and LPL were significantly increased （Plt;0.01）， WB results showed that FABP4 protein expression level increased obviously; 3）A total of 227 DEGs were detected by RNA-Seq， including 67 up-regulated genes and 160 down-regulated genes. The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis showed that differentially expressed genes were enriched into PPAR signaling pathway and unsaturated fatty acid biosynthesis pathway， the mRNA expression of differentially expressed genes FABP4， LPL， and FABP7 decreased significantly after interfering with SREBP1 gene （Plt;0.01）， the protein expression level of FABP4 also decreased obviously. In conclusion， the SREBP1 gene can promote the differentiation of precursor adipocytes of Jinnan cattle， and overexpression of this gene can promote intracellular TG accumulation， which is most likely achieved through the regulation of the PPAR signaling pathway and unsaturated fatty acid biosynthesis pathway related to lipid differentiation. The results of this study provide a theoretical reference for exploring the regulatory mechanism of the SREBP1 gene in the differentiation of bovine precursor adipocytes.

Key words： precursor adipocytes;" SREBP1; induced differentiation; RNA-Seq; PPAR

*Corresponding author： ZHANG Yuanqing，E-mail：yuanqing_zhang@163.com

牛肉膽固醇含量低、富含蛋白質(zhì)和大量人體所需脂肪酸，越來越受到人們青睞［1］。隨著人們消費(fèi)水平的提高，高品質(zhì)牛肉需求量加大，牛肉市場出現(xiàn)供不應(yīng)求的狀況［2］。牛肉嫩度、風(fēng)味和大理石花紋評分是評定牛肉質(zhì)量的主要指標(biāo)，其與牛肉中脂肪含量密切相關(guān)［3］。在哺乳動(dòng)物中，脂肪組織主要存儲(chǔ)在皮下、內(nèi)臟、肌內(nèi)和肌間［4-5］。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element-binding proteins，SREBP1）可與固醇調(diào)節(jié)元件（sterol regulatory element，SRE）特異性結(jié)合，是固醇類和脂肪酸合成的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［6］。Deng等［7］通過抑制體外培養(yǎng)牛肝細(xì)胞中SREBP1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)量的降低可抑制牛肝細(xì)胞脂質(zhì)合成。付常振［8］通過在秦川牛前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá)SREBP1基因發(fā)現(xiàn)該基因能夠促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴累積。SREBP1基因在促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化方面有突出貢獻(xiàn)，而在進(jìn)一步研究SREBP1基因多態(tài)性后發(fā)現(xiàn)，雪龍黑牛SREBP1基因的第5內(nèi)含子84 bp缺失與脂肪酸組成和肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)［9］，在Hoashi等［10］的研究中也發(fā)現(xiàn)日本和牛SREBP1基因第5內(nèi)含子84 bp缺失也與肌內(nèi)脂肪組成顯著相關(guān)。張樂等［11］發(fā)現(xiàn)，SREBP1基因在雪龍黑牛肝臟、肌肉中的表達(dá)量高于在秦川牛中的肝臟、肌肉中的表達(dá)量。同樣有研究發(fā)現(xiàn)，在不同品種牛中SREBP1基因在皮下脂肪中表達(dá)量存在差異，在Pirenaice牛中比salers牛和黑白花-荷斯坦奶牛表達(dá)量更高，這兩項(xiàng)研究表明在不同牛種中SREBP1基因?qū)w脂沉積的調(diào)控具有差異性［12］。以上結(jié)果表明，SREBP1基因與脂肪細(xì)胞分化具有密切關(guān)聯(lián)且與牛品種的不同可能存在緊密聯(lián)系。

目前，SREBP1基因?qū)τ谇绑w脂肪細(xì)胞分化的影響在其他牛種上有被關(guān)注到，但有關(guān)該基因在晉南牛前體脂肪細(xì)胞分化中詳細(xì)的調(diào)控作用研究仍較少，且關(guān)于其影響機(jī)制以及在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用研究也近乎空白。晉南牛肉質(zhì)鮮美且大理石花紋明顯，可作為生產(chǎn)高品質(zhì)牛肉的優(yōu)勢牛種［13］，本試驗(yàn)以晉南牛前體脂肪細(xì)胞為研究材料，通過基因功能研究方法（過表達(dá)、干擾、RNA-Seq）探究SREBP1基因?qū)ζ浞只淖饔靡约癝REBP1基因調(diào)控前體脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制，以期為SREBP1基因調(diào)控牛前體脂肪細(xì)胞分化分子機(jī)理的研究提供一定的理論基礎(chǔ)，也為今后的牛肉品質(zhì)改良提供參考思路和方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

晉南牛前體脂肪細(xì)胞由課題組前期分離培養(yǎng)，分離培養(yǎng)步驟參照楊夢麗的方法［14］。過表達(dá)載體SREBP1-GFP-NEO由本課題組構(gòu)建，siRNA由上海吉瑪生物技術(shù)公司合成。

DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胰酶購自Gibco公司；胎牛血清購自D-CELL公司，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、地塞米松購自Sigma公司；青鏈霉素、胰島素、油酸、油紅O試劑盒購自索萊寶公司；轉(zhuǎn)染試劑JET Prime購自PloyPlus公司；RNA提取試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞購自全式金公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTM reagent Kit with g-DNA Eraser購自TaKaRa公司；GP-Transfermate購自上海吉瑪生物公司；TRNzol Universal總RNA提取試劑購自天根生物；Protein Quantification Kit購自Abbkine公司；TG定量試劑盒購自北京普利萊生物公司；SREBP1一抗購自Santa公司；FABP4、β-actin一抗購自Abcam公司；山羊抗鼠和山羊抗兔二抗分別購自Thermo Scientific和上海生工公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank公布的牛SREBP1、β-actin、LPL、FABP4和FABP7基因序列在NCBI上設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，由北京擎科生物合成，序列見表1。

1.3 晉南牛前體脂肪細(xì)胞復(fù)蘇及誘導(dǎo)分化

將從液氮中拿出的前體脂肪細(xì)胞立刻置于37℃水浴中溶解，隨后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1 500 r·min-1離心5 min，棄去上清液，用完全培養(yǎng)液（DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液）重懸細(xì)胞并將懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，“+”字型混勻后置于含有5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后每2～3 d換液一次，同時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)。待前體脂肪細(xì)胞生長融合至80%～90%，將完全培養(yǎng)基替換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（在完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1 μmoL·L-1地塞米松、10 μg·mL-1牛胰島素、200 μmoL·L-1吲哚美辛、0.5 mmoL·L-1" IBMX、100 μmol·L-1油酸）。更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基當(dāng)天記為分化第0天，分化3 d后將誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基替換為維持分化培養(yǎng)基（在完全培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加10 μg·mL-1牛胰島素）維持分化10 d。

1.4 油紅O染色

分化第10天進(jìn)行油紅O染色，具體操作參考索萊寶公司油紅O試劑盒（G1262）說明書進(jìn)行。

1.5 TG含量測定

分化第10天進(jìn)行TG含量檢測，具體操作參考普利萊TG酶法測定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 過表達(dá)載體SREBP1-GFP-NEO轉(zhuǎn)染及檢測

接種1×106個(gè)前體脂肪細(xì)胞于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后分別轉(zhuǎn)染SREBP1-GFP-NEO和空載NEO，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染具體操作參考PloyPlus公司Jet Prime試劑說明書，轉(zhuǎn)染后48 h在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況并檢測SREBP1基因表達(dá)效率。

1.7 siRNA轉(zhuǎn)染及檢測

根據(jù)課題組前期克隆得到的晉南牛SREBP1序列，由上海吉瑪生物公司設(shè)計(jì)并合成3條靶向SREBP1基因的siRNA（si-365、1051、3142）以及一條陰性對照siRNA（si-con）和一條帶有熒光的陰性對照siRNA（si-con-FAM），具體序列見表2。接種1×106個(gè)前體脂肪細(xì)胞于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染具體操作參考上海吉瑪公司GP-transfermate試劑說明書，轉(zhuǎn)染后4～6 h在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染后第3天利用RT-qPCR檢測SREBP1基因表達(dá)效率。

1.8 轉(zhuǎn)錄組測序

基于“1.7”中RT-qPCR結(jié)果，選擇干擾效率最高的一條siRNA作為處理組，si-con作為對照組轉(zhuǎn)染前體脂肪細(xì)胞，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)染后第3天開始誘導(dǎo)分化，分化后第4天收集細(xì)胞加入1 mL Trizol破碎細(xì)胞并收集于無菌無酶EP管中，干冰運(yùn)輸將樣品送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序。使用DESeq2軟件鑒別差異基因，將Fold Change≥1.5且Plt;0.01 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用ClusterProfiler對篩選出的基因進(jìn)行KEGG分析。

1.9 過表達(dá)和干擾SREBP1基因?qū)χ竞铣上嚓P(guān)基因的影響

轉(zhuǎn)染后第3天開始誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化后第4天收集細(xì)胞，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。按照全式金RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測脂肪細(xì)胞成脂相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量變化，以β-actin作為內(nèi)參基因。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，按照2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，cDNA 2 μL，RNase free water 7.2 μL，總體系為20 μL進(jìn)行反應(yīng)液配制（冰上進(jìn)行），按照以下條件進(jìn)行：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 10 s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)；最后55℃～90℃，每5 s升高1℃。

1.10 過表達(dá)和干擾SREBP1基因?qū)χ竞铣上嚓P(guān)蛋白的影響

轉(zhuǎn)染后第3天開始誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化后第6天收集細(xì)胞總蛋白、測定蛋白濃度并檢測相關(guān)蛋白表達(dá)量變化，具體操作如下：用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2～3遍后，加入裂解工作液（RIPA：cocktail=100∶1）在冰上裂解30 min，4℃，12 000 r·min-1離心30 min，使用Abbkine公司的Protein Quantification Kit進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，具體操作詳見說明書，將蛋白稀釋至同樣濃度后加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸變性10 min。隨后每孔加入40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，浸泡PVDF膜于10% 脫脂奶粉中室溫封閉1 h，隨后用TBST緩沖液在搖床上清洗3次，每次10 min。一抗按照一定比例稀釋后將膜置于其中4℃過夜孵育。次日用TBST緩沖液再清洗3次，每次10 min，再用相應(yīng)二抗室溫孵育1 h后進(jìn)行顯影。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析及繪圖

相對mRNA表達(dá)量的測定以β-actin為內(nèi)參基因，RT-qPCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算和分析。使用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性水平檢驗(yàn)，用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異顯著性分析，試驗(yàn)結(jié)果均以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差（MEAN±SD）”表示，“*”代表差異顯著（Plt;0.05），“**”代表差異極顯著（Plt;0.01），以GraphPad Prism 8.0軟件作為可視化工具繪制圖形。

2 結(jié) 果

2.1 前體脂肪細(xì)胞復(fù)蘇后形態(tài)及油紅O染色鑒定

復(fù)蘇P2代前體脂肪細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)長梭形、三角形及星形等不規(guī)則形狀（圖1A），油紅O染色結(jié)果顯示在分化第10天細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了較大且數(shù)量較多的脂滴（圖1B），以上表明分離出的原代細(xì)胞分化潛能較好。

2.2 SREBP1-GFP-NEO 轉(zhuǎn)染效率檢測和siRNA干擾效率檢測

顯微鏡下轉(zhuǎn)染SREBP1-GFP-NEO的細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，而空載組則幾乎觀察不到熒光（圖2A），RT-qPCR結(jié)果顯示，SREBP1-GFP-NEO組SREBP1基因表達(dá)量顯著高于NEO組（Plt;0.05）（圖2B）。

轉(zhuǎn)染siRNA后6 h，顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)明顯的綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染操作無誤（圖2C）。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，3條siRNA的處理都極顯著降低了SREBP1基因的表達(dá)量，其中，si-1051干擾效率最高，達(dá)到81%左右，其次是si-3142，干擾效率為79%，干擾效率最低的si-365為69%（圖2D）。

2.3 過表達(dá)和干擾SREBP1基因?qū)x南牛前體脂肪細(xì)胞分化的影響

油紅O染色結(jié)果顯示：相較于對照組，過表達(dá)SREBP1后分化第10天，脂肪細(xì)胞中脂滴數(shù)目明顯增多，密度增大，脂滴體積明顯增加（圖3A），干擾SREBP1基因后分化第10天脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴含量減少（圖4）。為進(jìn)一步確認(rèn)SREBP1基因?qū)χ卫鄯e情況的影響，在分化第10天對過表達(dá)SREBP1基因的脂肪細(xì)胞進(jìn)行TG含量檢測，結(jié)果表明相較于對照組，過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)TG含量極顯著升高（Plt;0.01），達(dá)到對照組的3倍以上（圖3B）。

2.4 過表達(dá)SREBP1基因?qū)x南牛前體脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，前體脂肪細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)SREBP1基因后，導(dǎo)致成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）mRNA的表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.05），脂蛋白脂肪酶（LPL）、脂肪酸結(jié)合蛋白7（FABP7）表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01）（圖5）。WB結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染SREBP1-GFP-NEO后細(xì)胞內(nèi)FABP4蛋白表達(dá)水平高于對照組（圖6）。

2.5 差異表達(dá)基因分析

使用DESeq2軟件進(jìn)行差異基因分析，將Fold Change≥1.5且Plt;0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)差異基因227個(gè)，其中包括67個(gè)上調(diào)基因和160個(gè)下調(diào)基因（圖7A），其中與脂質(zhì)分化密切相關(guān)的基因在表3中進(jìn)行展示。差異基因的表達(dá)量聚類情況如熱圖（圖7B）所示，表達(dá)量上調(diào)和下調(diào)的基因組間具有顯著差異，而組內(nèi)一致性較高，表明差異分析結(jié)果較可靠。

2.6 差異基因KEGG富集分析

為深入探究SREBP1基因在晉南牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中作用的分子機(jī)制，通過對DEGs所參與的主要生化代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行KEGG富集分析，并將篩選出富集前10的通路展示（圖8A）。差異基因富集到了PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）和不飽和脂肪酸生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids）等相關(guān)通路，挑出該通路中主要差異基因FABP4、FABP7和LPL（圖8B），進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.7 RT-qPCR和WB驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序

對轉(zhuǎn)錄組測序所得到的部分差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，RT-qPCR結(jié)果顯示，干擾SREBP1基因后，導(dǎo)致FABP4、FABP7、LPL的表達(dá)量極顯著降低（Plt;0.01）（圖9），WB結(jié)果顯示，干擾SREBP1基因后，F(xiàn)ABP4蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖10）。

3 討 論

在前體脂肪細(xì)胞分化成為成熟脂肪細(xì)胞及成熟脂肪細(xì)胞維持分化的過程中，TG在脂肪細(xì)胞內(nèi)不斷積聚形成脂滴，脂滴體積逐漸增加占據(jù)細(xì)胞大部分體積，并將細(xì)胞核擠至邊緣［15］。因此，脂肪的沉積實(shí)質(zhì)為TG分解與合成的動(dòng)態(tài)平衡過程［16］。TG的沉積受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，SREBP1就是脂肪沉積調(diào)控因子之一，SREBP1是調(diào)節(jié)脂肪相關(guān)代謝酶的核轉(zhuǎn)錄因子，參與脂肪合成的生物學(xué)過程［17］。

3.1 SREBP1基因?qū)x南牛前體脂肪細(xì)胞分化的作用

本研究將SREBP1基因過表達(dá)載體和靶向SREBP1基因的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染晉南牛前體脂肪細(xì)胞，為確認(rèn)SREBP1基因?qū)τ跁x南牛前體脂肪細(xì)胞分化的影響，對過表達(dá)以及干擾SREBP1基因并分化10 d的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，并對過表達(dá)SREBP1基因的細(xì)胞進(jìn)行TG含量檢測，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SREBP1基因可以提高細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量，增大脂滴體積，并且極顯著提高細(xì)胞內(nèi)TG含量，干擾SREBP1基因的表達(dá)會(huì)抑制晉南牛脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴累積，這與付常振［8］的研究結(jié)果一致。徐麗［9］利用SREBP1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛胎兒骨骼肌成纖維細(xì)胞，隨后的油紅O染色結(jié)果顯示SREBP1基因具有促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞中脂滴累積的作用，這與本研究結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，SREBP1基因?qū)x南牛前體脂肪細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用。

3.2 轉(zhuǎn)錄組測序探究SREBP1基因?qū)x南牛前體脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探究SREBP1基因在晉南牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中的分子機(jī)制，本研究以晉南牛前體脂肪細(xì)胞為試驗(yàn)對象，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對干擾和未干擾SREBP1基因的脂肪細(xì)胞進(jìn)行測序并篩選DEGs。在本研究中，差異表達(dá)分析共發(fā)現(xiàn)227個(gè)DEGs，其中包括FABP4、FABP7、LPL和FADS2等脂質(zhì)代謝相關(guān)基因。KEGG富集結(jié)果顯示，DEGs富集于PPAR信號通路和不飽和脂肪酸生物合成通路中，PPAR信號通路處于脂肪代謝信號傳遞的中心位置，參與脂肪代謝的許多關(guān)鍵基因都受到該信號通路的調(diào)控［18］，而不飽和脂肪酸的生物合成通路與脂肪酸合成密切相關(guān)。以上結(jié)果表明，SREBP1基因在晉南牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中具有重要作用。

1983年Spiegelman等［19］在脂肪細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了FABP4，F(xiàn)ABP4在骨骼肌和心肌中具有高表達(dá)，主要作用是轉(zhuǎn)運(yùn)長烴鏈羧酸，運(yùn)送其至脂肪酸合成位點(diǎn)［20-23］。周靈芝和秦立紅等［24-25］分別在研究中證實(shí)了FABP4基因具有參與脂肪代謝和脂肪沉積的功能。Liu等［26］利用微陣列分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4基因在快速生長型肉雞中表達(dá)量高于緩慢生長型肉雞，證實(shí)了FABP4基因具有促進(jìn)雞胸肌IMF沉積的功能，這與本研究結(jié)果一致。敲除小鼠FABP4基因能有效降低其血漿中TG水平，并且會(huì)降低小鼠基礎(chǔ)脂肪代謝，增加非酯化脂肪酸含量［27-28］。在肉牛方面，已有研究鑒定出FABP4基因是山東黑牛以及魯西黃牛脂肪沉積的候選基因［29］。另外，多項(xiàng)有關(guān)FABP4基因多態(tài)性與肉產(chǎn)品性狀的研究表明FABP4基因是影響牛肉嫩度和品質(zhì)的候選基因之一［30-33］，是改善牛肉品質(zhì)過程中應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注的基因。FABP7在此前也被報(bào)道位于PPAR信號通路中，通過調(diào)節(jié)脂肪代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在脂肪細(xì)胞分化及增殖過程中發(fā)揮作用，與脂代謝密切相關(guān)［34-37］。王璟等［38］對去勢豬和非去勢豬的PPARγ信號通路中差異基因表達(dá)量進(jìn)行進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)FABP7在去勢豬組中表達(dá)量上調(diào)明顯，并且與去勢豬脂肪沉積量升高的表型效果相對應(yīng)，這與本試驗(yàn)RNA-Seq結(jié)果一致。LPL基因主要表達(dá)于骨骼肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中，在脂肪分解過程中不可或缺，LPL將乳糜微粒和極低密度脂蛋白分解成為游離脂肪酸后被細(xì)胞吸收并存儲(chǔ)或利用，因此在清除血漿TG過程中貢獻(xiàn)突出。蘇艷芳等［39］發(fā)現(xiàn)，北京黑豬群體中LPL基因的突變位點(diǎn)與IMF含量顯著關(guān)聯(lián)。Wang等［40］發(fā)現(xiàn)，LPL基因的mRNA表達(dá)水平與雞肌內(nèi)脂肪沉積呈顯著正相關(guān)。隨后對DEGs在mRNA和蛋白水平進(jìn)行了表達(dá)量檢測，結(jié)果均與RNA-Seq結(jié)果一致。以上諸多研究表明，F(xiàn)ABP4、FABP7和LPL三個(gè)基因確與脂肪細(xì)胞分化過程具有密切聯(lián)系，根據(jù)RNA-Seq結(jié)果推測SREBP1是通過影響FABP4等脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)量，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控。

本研究發(fā)現(xiàn)，干擾晉南牛前體脂肪細(xì)胞內(nèi)SREBP1基因后，脂肪細(xì)胞分化過程中脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá)量都下調(diào)，由此推測SREBP1基因?qū)PAR信號通路和不飽和脂肪酸生物合成通路在晉南牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中存在著重要影響。

4 結(jié) 論

4.1 SREBP1基因具有促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化、脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴和TG累積的作用。

4.2 SREBP1基因可能通過影響PPAR信號通路、不飽和脂肪酸生物合成通路以及FABP4等脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)量來調(diào)控脂肪酸的沉積。

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（編輯 郭云雁）