摘 要： 本研究以人克隆結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞系為模型，旨在探究丁酸鈉（sodium butyrate， NaB）和吲哚-3-丙酸（indole-3-propionic acid，IPA）共處理對(duì)Caco-2細(xì)胞緊密連接和炎癥因子的影響。使用0.4 mmol·L-1 NaB和0.1 mmol·L-1 IPA分別和共處理Caco-2細(xì)胞24 h，檢測(cè)細(xì)胞跨膜電阻（TEER）值、細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)、炎癥因子的基因表達(dá)和細(xì)胞上清液中炎癥因子的分泌水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，NaB和IPA共處理組均顯著提高TEER值（Plt;0.01），而NaB和IPA單獨(dú)處理組TEER值無顯著變化（Pgt;0.05）。qPCR和蛋白免疫印跡結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，共處理組顯著下調(diào)了Claudin-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.01）；與NaB單獨(dú)處理組相比，共處理組顯著上調(diào)了Claudin-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.05），并且極顯著促進(jìn)了Claudin-1、ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)（Plt;0.001）；與IPA單獨(dú)處理組相比，共處理組顯著上調(diào)了ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.05），并極顯著提高了Claudin-1和ZO-1蛋白表達(dá)量（Plt;0.001）。在炎癥因子方面，與對(duì)照組相比，NaB和IPA共處理組顯著下調(diào)炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-8及TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.05）。ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，共處理極顯著降低了細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β、IL-8及TNF-α的分泌量（Plt;0.001）。本研究表明，相比于NaB或IPA單獨(dú)處理，NaB和IPA共處理可增加細(xì)胞跨膜電阻值，促進(jìn)細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)并且降低促炎因子的分泌，降低了腸道通透性。綜上，NaB和IPA共處理在增強(qiáng)上皮細(xì)胞屏障功能以及降低炎癥反應(yīng)方面具有更強(qiáng)的作用。

關(guān)鍵詞： 丁酸鈉；吲哚-3-丙酸；緊密連接；炎癥因子；Caco-2細(xì)胞

中圖分類號(hào)：S816

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-5124-11

收稿日期：2024-01-03

基金項(xiàng)目：浙江農(nóng)林大學(xué)科研發(fā)展基金項(xiàng)目（2023LFR006）；浙江大學(xué)動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放性課題（KLMAN202307）；浙江農(nóng)林大學(xué)國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（202310341010，張亞南）

作者簡(jiǎn)介：王軻信（2003-），女，甘肅慶陽人，本科生，主要從事動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)研究，E-mail： 2661895207@qq.com

*通信作者：張亞南，主要從事腸道微生物調(diào)控與腸道健康研究，E-mail： ynzhang1515@163.com

Effects of Co-Treatment of Sodium Butyrate and Indole-3-Propionic Acid on Tight

Junctions and Inflammatory Cytokines in Caco-2 Cells

WANG" Kexin1， WU" Xian1， GONG" Haizhou3， FANG" Qiaoyu1， LI" Xiangchen1， ZHANG" Yanan1，2*

（1.Zhejiang Provincial Engineering Laboratory for Animal Health Inspection amp; Internet

Technology， Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry

of Zhejiang Province，

College of Animal Science and Technology， College of Veterinary Medicine， Zhejiang Agricultural

and ForestryA amp; F University， Hangzhou 311300，" China;

2.The Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition， Ministry of Education，

College of Animal Science， Zhejiang University， Hangzhou 310058，" China;

3.College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009，" China）

Abstract：" This study aims to investigate the effects of co-treatment of sodium butyrate and indole-3-propionic acid on the expression of tight junction-related proteins and inflammatory factors in Caco-2 cells. Caco-2 cells were administrated with 0.4 mmol·L-1 sodium butyrate and 0.1 mmol·L-1 indole-3-propionic acid each and together for 24 h; Then the transmembrane resistance （TEER） value， expression of tight junction related proteins， gene expression and secretion level of inflammatory cytokines were measured. The results showed that， compared with control group， the co-treatment of sodium butyrate and indole-3-propionic acid significantly increased the TEER value in Caco-2 cells （Plt;0.01）， while no significant changes were observed in sodium butyrate or indole-3-propionic group （Pgt;0.05）; In addition， the results by qPCR and Western blot showed that the relative expression of Claudin-2 mRNA was significantly down-regulated in the co-treatment group compared with the control group （Plt;0.01）; Compared with sodium butyrate group， the relative mRNA expression of Claudin-1 was significantly up-regulated in the co-treatment group （Plt;0.05）， and the protein expression of Claudin-1， ZO-1 and Occludin was highly significantly increased in the co-treatment group（Plt;0.001）; Compared with the indole-3-propionic acid group， the relative mRNA expression of ZO-1 was significantly up-regulated in the co-treatment group （Plt;0.05）， and the protein expression of Claudin-1 and ZO-1 was highly significantly increased （Plt;0.001）. For inflammatory cytokines， the relative mRNA expression levels of IL-6， IL-1β， IL-8 and TNF-α were significantly down-regulated in the co-treatment group （Plt;0.05）; Meanwhile， the results of ELISA showed that the co-treatment group highly significantly suppressed the secretion of IL-6， IL-1β， IL-8 and TNF-α in the cell supernatant compared with the control group （Plt;0.001）. In conclusion， compared with sodium butyrate or indole-3-propionic acid， the co-treatment of sodium butyrate and indole-3-propionic acid increased the TEER value， promoted the expression of tight junction proteins， suppressed the secretion of pro-inflammatory cytokines， and reduced intestinal permeability. Overall， these results suggested that the co-treatment of sodium butyrate and indole-3-propionic acid has a stronger role in enhancing intestinal epithelial cell barrier function and inhibiting inflammatory response.

Key words： sodium butyrate; indole-3-propionic acid; tight junction; inflammatory cytokines; Caco-2 cells

*Corresponding author：" ZHANG Yanan， E-mail： ynzhang1515@163.com

腸道上皮細(xì)胞作為腸道屏障在抵御病原入侵以及免疫等方面發(fā)揮著重要作用，其中緊密連接（tight junction，TJ）在維持腸道屏障完整性方面具有關(guān)鍵作用［1］?？缒さ鞍准易澹–laudins和Occludins）和膜周蛋白家族（Zonula Occuludens，ZOs）等緊密連接蛋白是緊密連接的重要組成部分。據(jù)報(bào)道，緊密連接蛋白受損與腸上皮通透性增加有關(guān)，導(dǎo)致病原體等有害物質(zhì)進(jìn)入腸道引發(fā)炎癥反應(yīng)［2］。因此，維持腸上皮細(xì)胞屏障完整性在保護(hù)動(dòng)物機(jī)體腸道健康方面至關(guān)重要。

大量研究表明，腸道菌群代謝產(chǎn)物可作為信號(hào)分子在改善腸道通透性、增強(qiáng)腸道屏障功能中發(fā)揮重要作用［3］。腸道菌群主要通過發(fā)酵日糧中未消化的碳水化合物和蛋白質(zhì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物。其中，短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）是菌群發(fā)酵未消化碳水化合物的主要代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，約占總SCFA的95%以上。近年來，丁酸被廣泛證明在維護(hù)機(jī)體腸道健康中具有積極作用，如促進(jìn)腸道發(fā)育，調(diào)節(jié)腸道屏障完整性以及減輕腸道炎癥等［4］。研究顯示，斷奶仔豬日糧添加丁酸鈉（sodium butyrate， NaB），提高了Occludin蛋白的表達(dá)并降低腸道通透性，從而改善了仔豬斷奶后的腹瀉癥狀［5］。在一項(xiàng)大鼠上的研究表明，口服丁酸鈉降低了小腸黏膜中二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）水平，增加了緊密連接蛋白表達(dá)，減輕了腸屏障損傷，并顯著降低了炎癥因子TNF-α水平進(jìn)而抑制了腸道炎癥［6］。體外研究表明，丁酸可通過調(diào)節(jié)大鼠小腸上皮細(xì)胞IEC-6中Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白水平來增強(qiáng)胃腸道屏障［7］，并且顯著減弱TNF-α/IFN-γ誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞中Claudin-2的上調(diào)［8］。另外，腸道微生物群通過發(fā)酵蛋白質(zhì)產(chǎn)生的多種含氮類小分子代謝產(chǎn)物，如吲哚衍生物等，在增強(qiáng)宿主腸道屏障功能，維護(hù)腸道健康中也發(fā)揮了重要作用［9］。其中，吲哚-3-丙酸（indole-3-propionatic acid， IPA）是菌群代謝色氨酸的主要產(chǎn)物之一，可通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)來增強(qiáng)腸道屏障功能，并且能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)從而發(fā)揮抗炎及抗氧化作用［10］。Jennis等［11］研究表明，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠口服IPA顯著降低血清中FITC-葡聚糖水平，改善了腸道通透性。另外，在體外，IPA增強(qiáng)了Caco-2/HT29共培養(yǎng)模型中的屏障完整性和上皮通透性，并且增加了緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1水平［12］。

事實(shí)上，在動(dòng)物腸道中，日糧未消化碳水化合物和蛋白質(zhì)經(jīng)菌群發(fā)酵產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物共同參與了對(duì)腸道健康的調(diào)控。然而，先前的大量研究主要探究了NaB、IPA的單獨(dú)作用對(duì)腸道健康的調(diào)節(jié)，其共處理對(duì)腸道屏障及炎癥因子表達(dá)的影響還不清楚。因此，本研究以人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞）為模型，主要探究NaB和IPA共處理對(duì)Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白及炎癥因子的影響，旨在了解NaB和IPA共處理在改善細(xì)胞屏障以及抵抗細(xì)胞炎癥方面的作用，為從菌群代謝物角度調(diào)控腸道健康提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

Caco-2細(xì)胞株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物消化道國(guó)際聯(lián)合研究中心饋贈(zèng)。NaB（純度gt;99%）、IPA（純度gt;98%）均購自上海阿拉丁有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司，青霉素-鏈霉素雙抗購自武漢賽維爾生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自美國(guó)MCE公司，一抗ZO-1、Claudin-1、Occludin、β-Actin均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG-HRP二抗購自武漢亞科因生物技術(shù)有限公司，SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，人（Human）白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、人白細(xì)胞介素8（IL-8）、人白細(xì)胞介素6（IL-6）、人腫瘤壞死因子α（TNF-α）的ELISA檢測(cè)試劑盒購自杭州金恒諾生物科技有限公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國(guó)Thermo Fisher；倒置顯微鏡購自日本Olympus；高速冷凍離心機(jī)購自美國(guó)Beckman Coulter；酶標(biāo)儀、Western blot電泳儀均購自美國(guó)Bio-Rad公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀美國(guó)Applied Biosystems。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存Caco-2細(xì)胞于37℃水浴鍋中快速解凍，1 000 r·min-1離心4 min，棄上清。加入1 mL完全培養(yǎng)基（89%DMEM高糖培養(yǎng)基+10％胎牛血清FBS+1%雙抗）重懸后接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5％ CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％～90％時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

根據(jù)CCK-8試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞活力。以Caco-2細(xì)胞為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，根?jù)細(xì)胞密度計(jì)算，將Caco-2接種至96孔板置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。參照Qiu等［13］和Li等［12］的研究，分別設(shè)定NaB和IPA處理濃度梯度。使用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基將100 mmol·L-1 NaB和IPA貯存液分別稀釋成不同濃度，其中NaB為0、0.1、0.4、0.8、1 mmol·L-1，IPA為0、0.02、0.1、0.5 mmol·L-1。分別添加不同濃度NaB和IPA處理細(xì)胞24 h，之后更換新的DMEM培養(yǎng)基，并向每孔中添加10 μL CCK-8溶液， 培養(yǎng)箱孵育2 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)在波長(zhǎng)為450 nm處各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（試驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值）/（對(duì)照孔OD值-空白孔OD值）×100%。根據(jù)細(xì)胞活力篩選相應(yīng)的NaB和IPA濃度。

1.4 試驗(yàn)分組

將Caco-2細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、NaB組、IPA組、NaB+IPA組，每組6個(gè)重復(fù)。將NaB溶于滅菌雙蒸水，配制成100 mmol·L-1的貯存液保存于-20℃；將IPA溶于二甲基亞砜（DMSO），配制成100 mmol·L-1的貯存液，現(xiàn)配現(xiàn)用。根據(jù)細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果，設(shè)置NaB的處理濃度為0.4 mmol·L-1，IPA的處理濃度為0.1 mmol·L-1。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察

將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的Caco-2細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化、離心、重懸后制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。采用0.4 mmol·L-1 NaB和0.1 mmol·L-1 IPA處理Caco-2細(xì)胞24 h，使用光學(xué)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.6 細(xì)胞跨膜電阻值（TEER）測(cè)定

收集生長(zhǎng)良好的Caco-2細(xì)胞，接種于12孔Transwell板的小室中（膜孔徑0.4 μm，膜面積1.12 cm2），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d至形成緊密連接的單層細(xì)胞（每1 d換1次培養(yǎng)基），隨后將小室中完全培養(yǎng)基更換為含有0.4 mmol·L-1 NaB溶液、0.1 mmol·L-1 IPA溶液及其組合的培養(yǎng)基，每組3個(gè)重復(fù)。處理24 h后使用細(xì)胞電阻儀測(cè)定各組細(xì)胞的電阻值。每孔選擇3個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行電阻值測(cè)定，取其均值，并計(jì)算TEER值。TEER值（Ω·cm2）=（R1-R0）×A，其中R1為測(cè)定孔電阻均值（Ω），R0為空白孔電阻值（Ω），A代表膜面積（cm2）。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)炎癥因子及緊密連接相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA。使用TRIzol裂解細(xì)胞后，收集樣品至1.5 mL離心管，加入200 μL氯仿，渦旋振蕩15 s后室溫靜置3 min，12 000 r·min-1、4℃離心15 min；吸取上清液400 μL并加入等體積的異丙醇混勻，冰上靜置10 min后12 000 r·min-1、4℃離心10 min棄上清；加入1 mL 75%乙醇溶液緩慢顛倒，洗滌沉淀后再次12 000 r·min-1、4℃離心5 min，棄去上清乙醇溶液，自然晾干至白色沉淀變透明，加入20 μL DEPC水溶解沉淀并混勻。測(cè)定提取RNA的濃度和純度用于RNA反轉(zhuǎn)錄。使用反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA用于后續(xù)試驗(yàn)。

以cDNA為模板，檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)量并分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。引物序列見表1，由浙江杭州有康生物科技有限公司合成。

1.8 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子的分泌水平

收集細(xì)胞上清液至1.5 mL離心管，2 000 r·min-1、4℃離心20 min，吸取上清液用于后續(xù)ELISA試驗(yàn)。按照ELISA試劑盒檢測(cè)說明書的步驟進(jìn)行操作，測(cè)定細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-8和TNF-α分泌水平。

1.9 蛋白免疫印跡檢測(cè)緊密連接蛋白的表達(dá)水平

采用RIPA裂解細(xì)胞并收集蛋白，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，再以濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉溶液室溫條件下慢速封閉2 h，隨后棄掉封閉液，加入相應(yīng)一抗溶液（β-actin、Claudin-1、Occludin、ZO-1），4℃孵育過夜。TBST洗滌條帶5次，每次5 min，加入相應(yīng)的二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗滌條帶后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色觀察條帶。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，Image J軟件測(cè)定蛋白條帶灰度值并分析。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用2－ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件的ANOVA方法分析各組間的差異顯著性，所有數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Plt;0.01為顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Plt;0.001為有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。利用Graphpad 10.0軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 丁酸鈉和吲哚-3-丙酸對(duì)Caco-2細(xì)胞活力及跨膜電阻的影響

如圖1A所示，與對(duì)照組相比，當(dāng)NaB濃度為0.8和1 mmol·L-1時(shí)，Caco-2細(xì)胞活力均極顯著降低（Plt;0.001），表明該濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響，但使用低劑量0.4 mmol·L-1 NaB預(yù)處理后對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響（Pgt;0.05）。圖1B結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同處理濃度的IPA（0.02、0.1和0.5 mmol·L-1）均顯著提高了Caco-2細(xì)胞活力（Plt;0.05），而當(dāng)IPA濃度為0.1 mmol·L-1時(shí)細(xì)胞活力最高。因此，本研究選取NaB處理濃度為0.4 mmol·L-1及IPA處理濃度為0.1 mmol·L-1用于后續(xù)試驗(yàn)。

如圖1 C所示，在使用NaB、IPA單獨(dú)處理以及NaB和IPA共處理細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，NaB、IPA單獨(dú)處理組的TEER值均無顯著變化（Pgt;0.05），而共處理組的細(xì)胞TEER值極顯著提高（Plt;0.01）。

2.2 丁酸鈉和吲哚-3-丙酸共處理對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

通過觀察Caco-2細(xì)胞在NaB、IPA單獨(dú)處理及共處理后細(xì)胞形態(tài)的變化發(fā)現(xiàn)（圖2），與對(duì)照組相比，NaB單獨(dú)處理組、IPA單獨(dú)處理組以及共處理組細(xì)胞呈正常團(tuán)狀分布，細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好且細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。

2.3 丁酸鈉和吲哚-3-丙酸共處理對(duì)Caco-2細(xì)胞緊密連接相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，共處理組顯著上調(diào)了ZO-1、Occludin和Claudin-1等基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.01），并顯著下調(diào)了Claudin-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.01）。與NaB處理組相比，共處理組顯著上調(diào)了Claudin-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.05）；與IPA處理組相比，共處理組顯著上調(diào)了ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.05）。

蛋白免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示（圖4），與對(duì)照組相比，NaB和IPA共處理后ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白表達(dá)水平均極顯著升高（Plt;0.001）。與NaB處理組相比，NaB和IPA共處理極其顯著促進(jìn)了Claudin-1、ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)（Plt;0.001）；與IPA處理組相比，NaB和IPA共處理提高了Occludin蛋白的表達(dá)（Plt;0.05），并極顯著提高了Claudin-1和ZO-1蛋白表達(dá)量（Plt;0.001）。

2.4 丁酸鈉和吲哚-3-丙酸共處理對(duì)Caco-2細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)和分泌的影響

采用qPCR技術(shù)檢測(cè)NaB和IPA共處理細(xì)胞后炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照組相比，NaB和IPA共處理下調(diào)了炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.05），并極顯著下調(diào)了IL-6和IL-8的mRNA相對(duì)表達(dá)量（Plt;0.01）。

采用ELISA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞上清液中的炎癥因子分泌水平，如圖6所示，與對(duì)照組相比，NaB和IPA共處理極顯著降低了細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β、IL-8及TNF-α的分泌量（Plt;0.001）。與NaB組相比，NaB和IPA共處理組極顯著降低了細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-6的分泌量（Plt;0.01），并極其顯著降低了IL-6的分泌量（Plt;0.001）；而NaB和IPA共處理組與IPA組相比，共處理組細(xì)胞上清液中IL-6的分泌量極顯著減少（Plt;0.01），IL-1β和TNF-α顯著減少（Plt;0.05）。

3 討 論

腸道單層上皮細(xì)胞形成的選擇性滲透屏障，不僅支持營(yíng)養(yǎng)吸收和廢物分泌排出，同時(shí)防止外界有害物質(zhì)的進(jìn)入，而這種滲透屏障形成的關(guān)鍵是緊密連接［17］。宿主的腸道微生物通過發(fā)酵碳水化合物和氨基酸等產(chǎn)生各種有機(jī)小分子代謝產(chǎn)物，可以作為信號(hào)分子在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及腸道屏障方面發(fā)揮作用［18］。其中，菌群發(fā)酵日糧碳水化合物產(chǎn)生的丁酸以及色氨酸產(chǎn)生的IPA已被大量研究證明在改善宿主腸屏障以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中具有重要作用［19-20］。本研究主要以人結(jié)腸腺癌Caco-2細(xì)胞系為模型，探究NaB與IPA共處理對(duì)細(xì)胞緊密連接蛋白和炎癥細(xì)胞因子分泌的影響。結(jié)果顯示，相比于單獨(dú)處理，NaB和IPA共處理后，細(xì)胞TEER值顯著提高，且顯著增加了細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)，降低了促炎因子的分泌。這一結(jié)果暗示兩者共處理效果在維護(hù)腸道上皮屏障功能和抑制炎癥反應(yīng)方面優(yōu)于NaB或IPA的單獨(dú)作用，為合理利用腸道菌群代謝產(chǎn)物調(diào)控腸道健康提供了一定的參考價(jià)值。

本研究首先使用CCK-8篩選NaB和IPA的濃度范圍，以確定作用于Caco-2細(xì)胞的適應(yīng)濃度。CCK-8結(jié)果顯示，低濃度NaB對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響，而高濃度NaB對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生抑制作用，該結(jié)果與張秋玉等［21］研究結(jié)果一致；盡管在正常上皮細(xì)胞中，丁酸為細(xì)胞提供能量并刺激生長(zhǎng)［22］，但有研究顯示在結(jié)腸癌細(xì)胞系中NaB通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖［23］。

腸道屏障的完整性對(duì)機(jī)體健康至關(guān)重要，跨膜電阻值（TEER）是表示屏障完整性的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于NaB或IPA單獨(dú)使用，二者共處理顯著增加了細(xì)胞TEER值，這表明NaB和IPA" 的共處理效應(yīng)在增強(qiáng)細(xì)胞屏障功能上具有更強(qiáng)的作用。緊密連接蛋白在維持腸上皮屏障功能中發(fā)揮重要作用［24］。其中，ZO與Occludin、Claudin-1等相互作用形成強(qiáng)交聯(lián)，與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白共同激活相關(guān)通路以維持屏障完整性［25］。而Claudin-2作為一種細(xì)胞孔道形成蛋白，在屏障受損的腸上皮組織中高度表達(dá)，并且促進(jìn)炎癥反應(yīng)［26］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NaB和IPA共處理增加了Occludin、Claudin-1以及ZO-1蛋白表達(dá)水平，并下調(diào)了Claudin-2的mRNA表達(dá)水平。Claudin-2表達(dá)降低表明腸上皮細(xì)胞間通透性減弱，腸道炎癥反應(yīng)減輕［27］。進(jìn)一步說明了NaB和IPA的共處理可降低細(xì)胞間通透性，在改善腸上皮細(xì)胞屏障完整性方面具有更強(qiáng)的效果。研究顯示，NaB通過激活A(yù)MPK通路抑制MLCK表達(dá)，降低MLC2磷酸化水平，從而發(fā)揮促進(jìn)緊密連接重組的作用［28］。IPA作為腸道細(xì)胞中芳香烴受體（AHR）重要配體，可通過激活A(yù)HR信號(hào)通路在改善腸道通透性中發(fā)揮作用［10］。因此，NaB和IPA共處理對(duì)細(xì)胞緊密連接的增強(qiáng)可能是協(xié)同激活相關(guān)通路所引起的，但還有待進(jìn)一步的探究。

NaB可通過抑制NF-κB的激活，抑制炎癥反應(yīng)并減少促炎因子TNF-α、IL-6等產(chǎn)生［29］。色氨酸代謝物也已在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎或炎癥性腸病（IBD）患者中被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)活性［30］。研究發(fā)現(xiàn)，吲哚通過激活孕烷X受體（PXR），由TLR4/NF-κB通路調(diào)節(jié)腸屏障功能以及炎癥反應(yīng)［31］。本研究顯示，NaB、IPA單獨(dú)處理能夠下調(diào)IL-6、IL-1β、IL-8等促炎因子mRNA相對(duì)表達(dá)量，而二者共處理對(duì)于下調(diào)炎癥因子基因表達(dá)的效果與NaB或IPA單獨(dú)作用無顯著差異。ELISA結(jié)果表明，NaB和IPA共處理相較于二者單獨(dú)處理，能顯著減少IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的分泌量。這可能是由于NaB和IPA共處理對(duì)細(xì)胞間緊密連接的增強(qiáng)作用降低了細(xì)胞旁通透性。TNF-α、IFN-γ和白細(xì)胞介素能夠?qū)е录?xì)胞間緊密連接受損［32］。一項(xiàng)在Caco-2/PBMC共培養(yǎng)模型的研究表明，NaB直接抑制活化免疫細(xì)胞PBMC的炎癥反應(yīng)，降低局部炎癥來減少屏障破壞，并對(duì)TNF-α、IFN-γ和IL-1β等細(xì)胞因子介導(dǎo)的屏障破壞具有直接保護(hù)作用［33］。因此，NaB和IPA共處理可能通過改善細(xì)胞間的通透性，顯著降低炎癥因子的分泌量，并且效果優(yōu)于NaB或IPA單獨(dú)作用。

4 結(jié) 論

綜上，NaB和IPA共處理可增加腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)并抑制促炎因子的分泌，有助于改善腸道屏障功能，且相比于NaB或IPA單獨(dú)作用，共處理效果更優(yōu)。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ PETERSON L W，ARTIS D.Intestinal epithelial cells：regulators of barrier function and immune homeostasis［J］.Nat Rev Immunol，2014，14（3）：141-153.

［2］ SLIFER Z M，BLIKSLAGER A T.The integral role of tight junction proteins in the repair of injured intestinal epithelium［J］.Int J Mol Sci，2020，21（3）：972.

［3］ GASALY N，DE VOS P，HERMOSO M A.Impact of bacterial metabolites on gut barrier function and host immunity：a focus on bacterial metabolism and its relevance for intestinal inflammation［J］.Front Immunol，2021，12：658354.

［4］ KAZ＇MIERCZAK-SIEDLECKA K，MARANO L，MEROLA E，et al.Sodium butyrate in both prevention and supportive treatment of colorectal cancer［J］.Front Cell Infect Microbiol，2022，12：1023806.

［5］ HUANG C，SONG P X，F(xiàn)AN P X，et al.Dietary sodium butyrate decreases postweaning diarrhea by modulating intestinal permeability and changing the bacterial communities in weaned piglets［J］.J Nutr，2015，145（12）：2774-2780.

［6］ ZHAO H B，JIA L，YAN Q Q，et al.Effect of Clostridium butyricum and butyrate on intestinal barrier functions：study of a rat model of severe acute pancreatitis with intra-abdominal hypertension［J］.Front Physiol，2020，11：561061.

［7］ WANG H B，WANG P Y，WANG X，et al.Butyrate enhances intestinal epithelial barrier function via up-regulation of tight junction protein Claudin-1 transcription［J］.Dig Dis Sci，2012，57（12）：3126-3135.

［8］ HUANG X Y，OSHIMA T，TOMITA T，et al.Butyrate alleviates cytokine-induced barrier dysfunction by modifying Claudin-2 levels［J］.Biology （Basel），2021，10（3）：205.

［9］ MA N，MA X.Dietary amino acids and the gut-microbiome-immune axis：physiological metabolism and therapeutic prospects［J］.Compr Rev Food Sci Food Saf，2019，18（1）：221-242.

［10］ JIANG H，CHEN C Y，GAO J.Extensive summary of the important roles of indole propionic acid，a gut microbial metabolite in host health and disease［J］.Nutrients，2022，15（1）：151.

［11］ JENNIS M，CAVANAUGH C R，LEO G C，et al.Microbiota-derived tryptophan indoles increase after gastric bypass surgery and reduce intestinal permeability in vitro and in vivo［J］.Neurogastroenterol Motil，2018，30（2）：e13178.

［12］ LI J J，ZHANG L，WU T，et al.Indole-3-propionic acid improved the intestinal barrier by enhancing epithelial barrier and mucus barrier［J］.J Agric Food Chem，2021，69（5）：1487-1495.

［13］ QIU Y Q，MA X Y，YANG X F，et al.Effect of sodium butyrate on cell proliferation and cell cycle in porcine intestinal epithelial （IPEC-J2） cells［J］.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2017，53（4）：304-311.

［14］ LAN H，ZHANG L Y，HE W，et al.Sinapic acid alleviated inflammation-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in lipopolysaccharide-（LPS-） treated Caco-2 cells［J］.Mediators Inflamm，2021，2021：5514075.

［15］ MA Y H，WANG Q M，YU K，et al.6-Formylindolo（3，2-b）carbazole induced aryl hydrocarbon receptor activation prevents intestinal barrier dysfunction through regulation of Claudin-2 expression［J］.Chem Biol Interact，2018，288：83-90.

［16］ HE S S，GUO Y H，ZHAO J X，et al.Ferulic acid ameliorates lipopolysaccharide-induced barrier dysfunction via MicroRNA-200c-3p-mediated activation of PI3K/AKT pathway in caco-2 cells［J］.Front Pharmacol，2020，11：376.

［17］ KUO W T，ODENWALD M A，TURNER J R，et al.Tight junction proteins occludin and ZO-1 as regulators of epithelial proliferation and survival［J］.Ann N Y Acad Sci，2022，1514（1）：21-33.

［18］ RUSSO E，GIUDICI F，F(xiàn)IORINDI C，et al.Immunomodulating activity and therapeutic effects of short chain fatty acids and tryptophan post-biotics in inflammatory bowel disease［J］.Front Immunol，2019，10：2754.

［19］ FU Y F，LYU J，WANG S S.The role of intestinal microbes on intestinal barrier function and host immunity from a metabolite perspective［J］.Front Immunol，2023，14：1277102.

［20］ PARADA VENEGAS D，DE LA FUENTE M K，LANDSKRON G，et al.Short chain fatty acids （SCFAs）-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases［J］.Front Immunol，2019，10：277.

［21］ 張秋玉，卞中博，孫小蝶，等.丁酸鈉通過自噬途徑降解HIF-1α抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2022，30（5）：762-767.

ZHANG Q Y，BIAN Z B，SUN X D，et al.Sodium butyrate inhibits the growth of colorectal cancer cells by promoting autophagic degradation of HIF-1α［J］.Journal of Modern Oncology，2022，30（5）：762-767.（in Chinese）

［22］ MARTIN-GALLAUSIAUX C，MARINELLI L，BLOTTIRE H M，et al.SCFA：mechanisms and functional importance in the gut［J］.Proc Nutr Soc，2021，80（1）：37-49.

［23］ 張笑添，車昌燕，姚步月，等.miR-92a/Dickkopf相關(guān)蛋白1介導(dǎo)丁酸鈉調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2023，39（12）：1743-1752.

ZHANG X T，CHE C Y，YAO B Y，et al.Sodium butyrate inhibits colon cancer proliferation through miR-92a/DKK1-mediated inhibition of the Wnt/β-catenin pathway［J］.Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2023，39（12）：1743-1752.（in Chinese）

［24］ PARADIS T，BGUE H，BASMACIYAN L，et al.Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells［J］.Int J Mol Sci，2021，22（5）：2506.

［25］ CHELAKKOT C，GHIM J，RYU S H.Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications［J］.Exp Mol Med，2018，50（8）：1-9.

［26］ GANAPATHY A S，SAHA K，SUCHANEC E，et al.AP2M1 mediates autophagy-induced CLDN2 （Claudin 2） degradation through endocytosis and interaction with LC3 and reduces intestinal epithelial tight junction permeability［J］.Autophagy，2022，18（9）：2086-2103.

［27］ 馮燕海.緊密連接蛋白Claudin-2研究進(jìn)展［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2018，47（5）：697-699.

FENG Y H.Research progress of tight junction protein Claudin-2［J］.Chongqing Medicine Journal，2018，47（5）：697-699.（in Chinese）

［28］ MIAO W，WU X J，WANG K，et al.Sodium butyrate promotes reassembly of tight junctions in Caco-2 monolayers involving inhibition of MLCK/MLC2 pathway and phosphorylation of PKCβ2［J］.Int J Mol Sci，2016，17（10）：1696.

［29］ SEGAIN J P，RAINGEARD DE LA BLETIERE D，BOURREILLE A，et al.Butyrate inhibits inflammatory responses through NFκB inhibition：implications for Crohn’s disease［J］.Gut，2000，47（3）：397-403.

［30］ GAO J，XU K，LIU H N，et al.Impact of the gut microbiota on intestinal immunity mediated by tryptophan metabolism［J］.Front Cell Infect Microbiol，2018，8：13.

［31］ VENKATESH M，MUKHERJEE S，WANG H W，et al.Symbiotic bacterial metabolites regulate gastrointestinal barrier function via the xenobiotic sensor PXR and Toll-like receptor 4［J］.Immunity，2014，41（2）：296-310.

［32］ CAPALDO C T，NUSRAT A.Cytokine regulation of tight junctions［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1788（4）：864-871.

［33］ KORSTEN S G P J，VROMANS H，GARSSEN J，et al.Butyrate protects barrier integrity and suppresses immune activation in a Caco-2/PBMC Co-culture model while HDAC inhibition mimics butyrate in restoring cytokine-induced barrier disruption［J］.Nutrients，2023，15（12）：2760.

（編輯 范子娟）