摘 要： 為構(gòu)建以雞柔嫩艾美耳球蟲EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等入侵相關(guān)蛋白分子為抗原基礎(chǔ)的多表位嵌合重組抗原ET seven真核表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)驗(yàn)證其在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)和通過(guò)不同輔助遞送方式在雞體內(nèi)的表達(dá)及其免疫功能。本研究利用生信分析獲得7個(gè)抗原表位，分別提取柔嫩艾美耳球蟲不同發(fā)育階段蟲體總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等7個(gè)抗原的表位區(qū)域編碼基因，構(gòu)建基因圖譜由公司合成以pcDNA3.1（+）為真核表達(dá)載體，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ET seven；將鑒定陽(yáng)性、測(cè)序正確的質(zhì)粒pcDNA3.1-ET seven轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞，利用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)ET seven重組基因片段在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)；以磷酸鈣納米顆粒作為輔助質(zhì)粒遞送佐劑檢測(cè)pcDNA3.1-ET seven在雞體內(nèi)引起的細(xì)胞因子水平變化，間接ELISA檢測(cè)特異性IgG抗體水平。結(jié)果顯示：成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ET seven，RT-PCR和Western blot檢測(cè)到ET seven的特異性表達(dá)，質(zhì)粒通過(guò)磷酸鈣納米佐劑免疫雞體后，檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40均在三次免疫后7 d高水平表達(dá)，其中CD-40與IL-6的表達(dá)水平最高。pcDNA3.1-ET seven重組質(zhì)粒結(jié)合磷酸鈣佐劑肌肉注射二次免疫后7 d間接ELISA檢測(cè)特異性IgG抗體呈陽(yáng)性。結(jié)果表明，pcDNA3.1-ET seven重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，在雞體內(nèi)有良好的免疫原性，為雞球蟲病的疫苗防控提供新的思路和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞： 柔嫩艾美耳球蟲；多表位重組質(zhì)粒；真核表達(dá)；DNA疫苗

中圖分類號(hào)：S855.9；S852.723

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-5159-14

收稿日期：2024-01-11

基金項(xiàng)目：“十四五”廣東省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新十大主攻方向“揭榜掛帥”項(xiàng)目（2023SDZG02）；廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目（2021B1515120006）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021B1212050021；2023B1212060040）；豬禽種業(yè)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2023QZ-NK05；2022GZ07）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2023B04J0137；2023A04J0789）；云浮市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022020202）；科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)資金（高水平農(nóng)科院建設(shè)）（202110TD；202122TD；R2020PY-JC001；R2019YJ-YB3010；R2020PY-JG013；R2020QD-048；R2021PY-QY007；R2023PY-JG018）；廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)（2022KJ119）；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（XTXM202202）

作者簡(jiǎn)介：倪君麗（1998-），女，浙江平湖人，碩士生，主要從事雞球蟲病綜合防控技術(shù)研究，E-mail：1565452246@qq.com；劉欣超（1987-），女，吉林省白山人，副教授，主要從事動(dòng)物寄生蟲病研究，E-mail：304368107@qq.com。倪君麗和劉欣超是同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：孫銘飛，主要從事寄生蟲入侵機(jī)制研究及靶向藥物研發(fā)，E-mail：smf7810@126.com；顧有方，主要從事動(dòng)物寄生蟲病研究，E-mail：youfanggu@163.com

Construction， Expression and Preliminary Functional Analysis of the Eukaryotic Plasmid

ET Seven， a 7-valent Multiepitope Chimeric Recombinant Antigen of Chicken Coccidia

NI" Junli1，2， LIU" Xinchao1， SUN" Dong1，2， FANG" Siyun3， WANG" Dingai3， SHEN" Hanqin3， YAN" Zhuanqiang3， QI" Nanshan2， SUN" Mingfei2*， GU" Youfang1*

（1.College of Animal Science and Technology， Anhui Science and Technology University，

Fengyang 233100， China;

2.Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong

Province， Key Laboratory

of Avian Influenza and Other Major Poultry Diseases Prevention and

Control of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Health，

Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， China;

3.Wens Foodstuff Group Co. LTD， Xinxing 527400， China）

Abstract：" The aim of this study was to construct multi-epitope recombinant plasmids of Eimeria tenella EtAMA1， EtAMA2， EtMIC3， EtMIC4， EtMIC13， EtROP5， and EtSAG1 antigens and verify their expression in DF-1 cells and chickens through various assisted delivery methods， we employed pcDNA3.1（+） as the eukaryotic expression vector. The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-ET Seven was constructed through bioinformatics analysis， obtaining seven epitopes and reverse transcriptional amplification of gene fragments of seven antigen epitope regions in E. tenella mRNA templates at different time points. The company synthesized pcDNA3.1（+） as the eukaryotic expression vector， and constructed the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-ET seven. Subsequently， the constructed positive plasmid， pcDNA3.1-ET Seven， was transfected into DF-1 cells. RT-PCR and Western blot analysis was employed to detect the expression of the ET Seven recombinant gene in DF-1 cells. The cytokine levels of pcDNA3.1-ET seven in chickens were detected by calcium phosphate nanoparticles as adjuvant plasmid delivery adjuvant， and specific IgG antibody levels were detected by indirect ELISA. The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-ET Seven was successfully constructed， and the specific expression of ET Seven was detected through Western blot analysis and RT-PCR. After the plasmid was immunized with calcium phosphate nano-adjuvant， the detected cytokines IL-2， IL-6， IL-10， IL-12， IFN-γ and CD-40 were all expressed at high levels seven days after three times of immunization， and the expression levels of CD-40 and IL-6 were the highest. The pcDNA3.1-ET Seven recombinant plasmid， when conjugated with calcium phosphate adjuvant， was administered intramuscularly， resulting in a positive detection of specific IgG antibodies through indirect ELISA. The results showed that the pcDNA3.1-ET seven recombinant plasmid was successfully constructed and had good immunogenicity in chickens. This finding provides novel insights and technical support for vaccine prevention and control of chicken coccidiosis.

Key words： Eimeria tenella; multi-epitope recombinant plasmids; eukaryotic expression; DNA vaccine

*Corresponding authors：" SUN Mingfei， E-mail： smf7810@126.com; GU Youfang， E-mail： youfanggu@163.com

雞球蟲病在世界家禽養(yǎng)殖業(yè)中的危害一直是個(gè)亟待解決的嚴(yán)重問(wèn)題，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其中柔嫩艾美耳球蟲是危害最嚴(yán)重的蟲種之一［1］。藥物防治以及活卵囊疫苗防控是目前采取的常用手段，但由于長(zhǎng)期使用藥物導(dǎo)致大量耐藥蟲株的出現(xiàn)，以及活卵囊疫苗存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)，目前急需尋求高效、安全的新型疫苗［2］。多表位重組嵌合疫苗是利用基因重組等手段構(gòu)建的靶向多個(gè)不同抗原表位的重組疫苗，是一種防治疾病的新興策略［3-5］。有效的多表位疫苗構(gòu)建體在每個(gè)抗原肽序列中具有重疊的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位，從而誘導(dǎo)針對(duì)目標(biāo)抗原感染的細(xì)胞免疫或體液免疫反應(yīng)，理論上具有更安全和更高效的免疫保護(hù)效果［3］。

篩選具有較好免疫原性的抗原是構(gòu)建新型表位嵌合分子疫苗的關(guān)鍵。目前研究表明雞球蟲頂端復(fù)合體中微線體、棒狀體和致密顆粒在蟲體入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中起重要作用［6］，在入侵雞體的三個(gè)階段中（滑行運(yùn)動(dòng)階段、形成運(yùn)動(dòng)結(jié)合體階段、納蟲空泡階段），由滑動(dòng)體（moving junction，MJ）介導(dǎo)的滑行運(yùn)動(dòng)是建立蟲體與宿主入侵關(guān)系的關(guān)鍵［7］。蟲體與宿主細(xì)胞形成聯(lián)系依靠受體和配體的結(jié)合，驅(qū)動(dòng)主動(dòng)侵襲［8］，其中頂膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1）與其受體棒狀體頸部蛋白2（rhoptry neck protein 2，RON2）形成復(fù)合物AMA1-RON2，在侵襲過(guò)程中分泌到宿主細(xì)胞中并整合到宿主細(xì)胞膜中［9］。研究表明，當(dāng)用作重組蛋白疫苗時(shí)，子孢子特異性的EtAMA1可有效誘導(dǎo)部分保護(hù)，防止雞體受E. tenella同源攻擊［10］。頂膜抗原2（apical membrane antigen 2，AMA2）與其受體棒狀體頸部蛋白5（rhoptry neck protein 5，RON5）形成的復(fù)合體AMA2-RON5在子孢子入侵時(shí)期，有助于MJ的形成［11］。寄生蟲入侵宿主細(xì)胞的早期階段，微線體蛋白家族（microneme proteins，MICs）參與附著宿主細(xì)胞，隨后形成樞紐，輸送蟲體入侵所需能量［12］。其中關(guān)于MIC3（microneme protein 3，MIC3）的研究發(fā)現(xiàn)，抗EtMIC3的血清能夠阻斷子孢子的侵襲，表現(xiàn)出高度的位點(diǎn)特異性［13］，且更早就有研究發(fā)現(xiàn)以EtMIC3表達(dá)的DNA疫苗表現(xiàn)出對(duì)柔嫩艾美耳球蟲的抗感染能力［14］。MIC4（microneme protein 4，MIC4）可以通過(guò)EtMIC4 EGF樣激活EGFR通路，調(diào)控AKT和ERK信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡［15］。MIC13（microneme protein 13，MIC13）在弓形蟲中的研究表明，TgMIC13與胚胎細(xì)胞上報(bào)道的α2-9-連接的二唾液酸（sialic acid，Sia）序列的強(qiáng)烈結(jié)合，以及與腸道上皮中發(fā)現(xiàn)的4-O-乙?；?Sia的相對(duì)強(qiáng)結(jié)合，而微粒黏附重復(fù)序列（microneme adhere repeat sequence，MAR）結(jié)構(gòu)域可識(shí)別唾液酸，唾液酸是宿主細(xì)胞表面被該病原體入侵的關(guān)鍵決定因素，因此證明TgMIC13是侵襲過(guò)程中的一個(gè)重要參與者［16］。棒狀體基部蛋白5（rhoptry bulb protein 5，ROP5）可以通過(guò)阻斷活化巨噬細(xì)胞中IFN-γ介導(dǎo)清除，來(lái)控制毒力［17］。隨著宿主和病原體之間存在進(jìn)化競(jìng)爭(zhēng)的假說(shuō)被提出，其佐證之一是宿主防御蛋白［稱為免疫相關(guān)GTP酶（IRG）］與原生動(dòng)物寄生蟲弓形蟲表達(dá)的rhoptry假激酶家族（ROP5）之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)ROP5使用高度多態(tài)的表面與IRG的核苷酸結(jié)合域相鄰結(jié)合，這在IRG結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生深刻的變構(gòu)變化，表現(xiàn)出兩個(gè)顯著效果，分別是阻止IRG的寡聚化以及改變弓形蟲絲氨酸/蘇氨酸激酶ROP17和ROP18靶向的兩個(gè)蘇氨酸殘基的方向［18］。編碼表面抗原的基因的SAG家族可能是寄生蟲與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用的關(guān)鍵［19］。SAG蛋白的一個(gè)核心功能可能是在寄生蟲入侵之前附著在宿主細(xì)胞上［20］。在剛地弓形蟲中，SAG基因在初級(jí)附著中起作用，研究已知E. tenella SAG1能夠結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞［21］。因此，以上七個(gè)抗原蛋白均能夠在蟲體入侵宿主的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，是作為重組抗原疫苗的潛在靶標(biāo)。

質(zhì)粒遞送進(jìn)體內(nèi)一直存在較成熟的技術(shù)手段，包括基因槍、膠體金顆粒、以及in vivo-jet PEI脂質(zhì)體和CpG ODN寡聚核苷酸等。但不同于蛋白的遞送佐劑，由于其適用范圍以及操作難度，未能探索出一種操作簡(jiǎn)便且易制備的質(zhì)粒遞送佐劑。本研究選用的磷酸鈣納米顆粒是相對(duì)比較成熟的DNA疫苗佐劑之一，已證明可以增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且使用新的NP技術(shù)可以誘導(dǎo)CD8 T細(xì)胞免疫反應(yīng)［22］，并具有多種優(yōu)點(diǎn)，例如生物相容性，安全性，抗原能有效遞送至特定位置［23］。

本研究旨在構(gòu)建ET seven真核表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)驗(yàn)證其在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)以及通過(guò)磷酸鈣納米顆粒佐劑在雞體內(nèi)引起的細(xì)胞因子水平與特異性IgG抗體水平的變化，為進(jìn)一步開發(fā)和研制柔嫩艾美耳球蟲基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體與DF-1細(xì)胞由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所寄生生物研究室保存；DNA膠回收試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技；低內(nèi)毒素質(zhì)粒小提大量試劑盒購(gòu)自美基生物公司；大腸桿菌TOP 10購(gòu)自諾維贊生物公司；DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM減血清培養(yǎng)基、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000與TMB單組分顯色液均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司：His標(biāo)簽鼠抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體與HRP標(biāo)記羊抗雞抗體均購(gòu)自Proteintech公司；限制性內(nèi)切酶Bsg Ⅰ與BamH Ⅰ購(gòu)自New England Biolabs公司；引物合成由上海生工生物公司負(fù)責(zé)，其他化學(xué)試劑均購(gòu)自上海生工生物公司。

1.2 方法

1.2.1 生信分析獲得抗原表位

利用免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)IEDB（https：//iedb.org/）的Kolaskar and Tongaonkar antigenicity方法［24］結(jié)合DNA star軟件，分析其與MHC結(jié)合能力、與MHC加工相關(guān)性、結(jié)合后免疫原性，篩選出7個(gè)抗原性高的抗原表位（表1）。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)篩選出的抗原表位的基因序列，利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)各抗原表位基因的特異性引物（表2），引物由上海生工生物公司合成。

1.2.3 ET seven基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將驗(yàn)證存在于柔嫩艾美耳球蟲生活史的7個(gè)預(yù)測(cè)基因片段通過(guò)公司合成連接到pcDNA3.1（+）真核質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化于TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后挑取白色單菌落接種至含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。同時(shí)采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒與低內(nèi)毒素質(zhì)粒小提大量試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定（Bsg Ⅰ/BamH Ⅰ）與PCR鑒定后，將質(zhì)粒送至上海生工生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 ET seven基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞

將DF-1細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度約80%時(shí)，棄掉上清，PBS緩沖液清洗2～3次，換用opti-MEM減血清培養(yǎng)基使細(xì)胞適應(yīng)2 h后，重新更換opti-MEM減血清培養(yǎng)基。按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ET seven和空質(zhì)粒pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，空白組不作任何處理。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換新的含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h與60 h收取細(xì)胞RNA與蛋白樣品。

1.2.5 PCR方法檢測(cè)ET seven基因DF-1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄

采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用promega公司的RQ1 Rnase-Free Dnase酶孵育提取的RNA，用以去除質(zhì)粒DNA的干擾。參照Prime Script Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。特異性引物為（5′→3′）F：GCAATGCCCTAATGCCGAAG/R：ACTGGGT-CGGATTATCGCTG。PCR反應(yīng)體系為10 μL，Premix Taq 5 μL，模板1 μL，上、下游引物（10 mol·μL-1）各1 μL，ddH2O補(bǔ)至10 μL。94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于含核酸染料（Gold View）的2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染60 h的DF-1細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取，將蛋白通過(guò)SDS-PAGE電泳分離后，80 V轉(zhuǎn)印90 min至NC膜，以His-tag（1∶2 000）為一抗4℃孵育12 h，羊抗鼠HRP-IgG（1∶3 000）為二抗室溫孵育1 h，采用ECL顯色。

1.2.7 磷酸鈣納米顆粒結(jié)合pcDNA3.1-ET seven的免疫反應(yīng)

采用低內(nèi)毒素質(zhì)粒小提大量提試劑盒提取空載體質(zhì)粒pcDNA3.1（+）與重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ET seven，并測(cè)定質(zhì)粒濃度。磷酸鈣納米顆粒與殼聚糖的制備參考Qia［25］、Rabiee［26］、Sokolova［27］、Pedraza［28］等的方法，將15.6 mmol·L-1檸檬酸鈉、12.5 mmol·L-1磷酸氫鈉和12.5 mmol·L-1氯化鈣25度攪拌48 h，200 W超聲30 min，調(diào)整pH＞等電點(diǎn)，離心取沉淀，與稀釋過(guò)的質(zhì)粒4℃輕晃結(jié)合。將10 mg殼聚糖粉末溶解于10 mL的0.1％乙酸中，4 ℃輕晃過(guò)夜，用注射器將三聚磷酸鹽滴入此混合物攪拌，將二者1∶1混合，振蕩器結(jié)合3 h。將1日齡無(wú)球蟲健康雛雞84只飼養(yǎng)至3日齡，隨機(jī)分成4組（表3），每組21只，分別在3日齡、10日齡、17日齡進(jìn)行免疫。

在10日齡、17日齡、24日齡采集心臟血液及各組脾組織。脾組織通過(guò)組織細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取RNA，參照Prime Script Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，以β-actin為內(nèi)參，參考Gahan等［29］的方法，引物及退火溫度見(jiàn)表4。

心臟血樣以4 000 r·min-1離心3 min取血清，間接ELISA法檢測(cè)血清特異性IgG。取96孔ELISA板，每孔包被200 ng ET seven蛋白抗原，4 ℃放置12 h，PBST洗板3次；200 μL·孔-1加入1% BSA，37 ℃封閉1 h，PBST洗板3次；每孔加入100 μL 1∶1 000稀釋待測(cè)血清，37℃孵育60 min，PBST洗板3次；每孔加入100 μL 1∶2 000稀釋的山羊抗雞IgG-HRP，37℃孵育60 min，PBST洗板3次；每孔加入200 μL TMB單組分顯色液，37℃避光作用10 min，每孔加入50 μL 2 mol·L-1濃硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)檢測(cè)儀讀取OD450 nm值。計(jì)算P/N比值，大于或等于2.1判定為陽(yáng)性，比值小于2.1為陰性。比較三次免疫后7 d針對(duì)ET seven蛋白的特異性IgG抗體水平變化。

2 結(jié) 果

2.1 抗原表位的生信分析

利用免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)IEDB（https：//iedb.org/）的Kolaskar and Tongaonkar antigenicity方法［24］，分析其與MHC結(jié)合能力、與MHC加工相關(guān)性、結(jié)合后免疫原性，篩選出七個(gè)抗原性高的抗原表位。篩選出AMA1、AMA2、MIC3、MIC4、MIC13、ROP5、SAG1的表位區(qū)域抗原指數(shù)分別為0.92、0.77、0.56、1.04、0.84、0.8、0.65，通過(guò)DNA star軟件分析七個(gè)片段連接后的親水性強(qiáng)弱，選擇構(gòu)建可溶性性最高的MIC13-AMA2-MIC3-MIC4-ROP5-SAG1-AMA1的組合順序，由EAAAK小分子多肽連接，構(gòu)建為ET seven，抗原指數(shù)為0.8，見(jiàn)圖1。

2.2 pcDNA3.1-ET seven真核表達(dá)載體構(gòu)建

對(duì)柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子mRNA進(jìn)行七個(gè)抗原基因片段的PCR擴(kuò)增（圖2），其中AMA1基因片段大小約為250 bp；AMA2基因片段大小約為350 bp；MIC3基因片段大小為350 bp；MIC4基因片段大小約為300 bp；MIC13基因片段大小約為400 bp；ROP5基因片段大小約為500 bp；SAG1基因片段大小約為400 bp，證明預(yù)測(cè)片段在柔嫩艾美耳球蟲生活史中存在，重組質(zhì)粒通用引物PCR鑒定（圖3）基因片段長(zhǎng)度大小約為2 000 bp，符合預(yù)期，雙酶切（圖4）及測(cè)序鑒定正確，酶切位點(diǎn)為Bsg Ⅰ與BamH Ⅰ，Bsg Ⅰ位于目的片段內(nèi)部，酶切長(zhǎng)度理論值為1 075 bp，結(jié)果表明ET seven與pcDNA3.1載體連接正確，ET seven基因片段大小為1 731 bp。

2.3 pcDNA3.1-ET seven真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ET seven和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總RNA，使用Promega公司的RQ1 Rnase-Free Dnase酶孵育，通過(guò)PCR特異性引物擴(kuò)增，檢測(cè)目的基因ET seven的特異性表達(dá)。結(jié)果顯示Dnase酶孵育后RNA電泳顯示無(wú)特異性條帶，而Dnase酶孵育后RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，電泳可見(jiàn)特異性條帶，大小約為100 bp，符合預(yù)期，見(jiàn)圖5。

2.4 pcDNA3.1-ET seven真核表達(dá)載體蛋白水平檢測(cè)

重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ET seven轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞60 h后，收集細(xì)胞裂解液后進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒在75 ku左右出現(xiàn)條帶，與預(yù)測(cè)結(jié)果大小一致，而空載體與未轉(zhuǎn)染的樣品孔未出現(xiàn)該條帶，見(jiàn)圖6。

2.5 磷酸鈣納米顆粒結(jié)合pcDNA3.1-ET seven重組質(zhì)粒免疫反應(yīng)變化

以磷酸鈣納米顆粒結(jié)合pcDNA3.1-ET seven重組質(zhì)粒，采用腿部多點(diǎn)肌肉注射免疫接種，三次免疫7 d后采取每組心臟血樣檢測(cè)IgG水平變化，采取脾臟提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR檢測(cè)各組免疫后7 d IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40的轉(zhuǎn)錄水平。

結(jié)果，磷酸鈣納米顆粒結(jié)合pcDNA3.1-ET seven重組質(zhì)粒的試驗(yàn)組在前兩次免疫后7 d均無(wú)明顯差異，但在第三次免疫后7 d，即24日齡時(shí)能夠引起對(duì)比空白組和對(duì)照組在IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40細(xì)胞因子mRNA高水平的變化，檢測(cè)的細(xì)胞因子指標(biāo)中CD-40的上調(diào)最為顯著，且與兩組對(duì)照組差異最顯著，IL-6次之，IL-10最低，除IL-12外，佐劑對(duì)照和空載體對(duì)照的細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量均與空白組和免疫早期相比上調(diào)，見(jiàn)圖7。

磷酸鈣結(jié)合pcDNA3.1-ET seven質(zhì)粒免疫后，IgG水平隨免疫次數(shù)顯著上升，與空白組對(duì)比差異極顯著（Plt;0.001），其中二次免疫后7 d，即17日齡時(shí)，檢測(cè)其特異性IgG抗體水平呈陽(yáng)性，且三次免疫后，即24日齡呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，其余各組除空載體組第三次免疫后7 d呈陽(yáng)性外，均呈陰性，見(jiàn)圖8。

3 討 論

球蟲疫苗在全身和局部淋巴器官中誘導(dǎo)基于Th1細(xì)胞和細(xì)胞因子的反應(yīng)，因此目前的球蟲疫苗除了活卵囊疫苗外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均致力于研究一種能夠特異性針對(duì)球蟲感染，且可以引起有效長(zhǎng)期保護(hù)的新型疫苗，其中重組DNA疫苗是較理想的發(fā)展方向，DNA疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生持久性免疫應(yīng)答，具有易生產(chǎn)，穩(wěn)定性強(qiáng)，貯存、運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)［30］。多表位的抗原可以針對(duì)性地產(chǎn)生球蟲生活史中不同時(shí)期抗原片段的抗體，同時(shí)可以構(gòu)建保護(hù)腸道相關(guān)抗原結(jié)合的抗原表位，增強(qiáng)對(duì)球蟲的抵抗能力。Fatollahzadeh等［23］成功構(gòu)建編碼GRA14和ROP13基因的重組DNA疫苗，能夠引起IL-17與IL-22顯著上調(diào)，同時(shí)誘導(dǎo)高水平的IgG反應(yīng)，降低弓形蟲載蟲量。ET seven同時(shí)囊括了柔嫩艾美耳球蟲生活史的入侵階段的優(yōu)勢(shì)抗原，其基因序列高度保守，具有更為優(yōu)勢(shì)的免疫原性，能夠誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞水平免疫應(yīng)答反應(yīng)。

本研究以pcDNA3.1（+）作為真核表達(dá)載體，成功將構(gòu)建ET seven基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-ET seven通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞，采用PCR與Western blot試驗(yàn)證實(shí)了pcDNA3.1-ET seven質(zhì)粒能在DF-1細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。由于高劑量質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染難以規(guī)避質(zhì)粒殘留的影響，干擾mRNA水平表達(dá)的檢測(cè)，因此使用Dnase酶對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞樣本RNA進(jìn)行孵育，以去除假陽(yáng)性的影響。PCR結(jié)果顯示在約100 bp處有特異性條帶，且測(cè)序反饋比對(duì)后序列正確，Western blot結(jié)果也顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后在75 ku左右出現(xiàn)條帶，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后蛋白表達(dá)成功。磷酸鈣納米顆粒結(jié)合pcDNA3.1-ET seven免疫后細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。這與Paston等［31］認(rèn)為的DNA疫苗在通過(guò)佐劑輔助質(zhì)粒進(jìn)入胞膜后，可以引起一定的免疫原性結(jié)論相符。IL-2為促炎因子，能夠促進(jìn)B細(xì)胞增殖，活化T細(xì)胞與NK細(xì)胞，同時(shí)還可以促進(jìn)IFN-γ的分泌［32］。IL-6通過(guò)刺激急性期反應(yīng)、造血和免疫反應(yīng)來(lái)促進(jìn)宿主防御［33］，在腸道中IL-6水平升高有助于增強(qiáng)發(fā)炎部位固有層中T細(xì)胞的存活率和細(xì)胞凋亡抵抗力，CD4+ T細(xì)胞的這種擴(kuò)增導(dǎo)致炎癥的持續(xù)存在。IL-6還通過(guò)刺激腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IEC）的增殖和擴(kuò)增來(lái)引發(fā)重要的穩(wěn)態(tài)功能［34］。本試驗(yàn)在加強(qiáng)免疫后能夠引起高水平的IL-2與IL-6分泌，細(xì)胞免疫已經(jīng)開始啟動(dòng)，樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）細(xì)胞也被激活，IL-2作為調(diào)節(jié)免疫功能的幾種淋巴細(xì)胞的信使之一，誘導(dǎo)抗原刺激T細(xì)胞的增殖。其中IL-6的分泌量最高，認(rèn)為本試驗(yàn)選用的7個(gè)抗原進(jìn)入雞體后轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白是針對(duì)腸道球蟲入侵，因此與腸道免疫更為相關(guān)的IL-6指標(biāo)的上升符合預(yù)期，且能說(shuō)明針對(duì)性的腸道細(xì)胞免疫較為強(qiáng)烈。細(xì)胞因子IL-10是一種關(guān)鍵的抗炎介質(zhì)，可保護(hù)宿主免受對(duì)病原體和微生物群的過(guò)度旺盛反應(yīng)，同時(shí)在其他環(huán)境中發(fā)揮重要作用。IL-10與其受體的結(jié)合會(huì)激活主要的JAK1-TYK2-STAT3信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)STAT3介導(dǎo)的抗炎反應(yīng)［35］。試驗(yàn)由于產(chǎn)生的高水平的IL-6對(duì)于雞體來(lái)說(shuō)炎癥反應(yīng)較強(qiáng)烈，IL-10在應(yīng)對(duì)高水平的炎癥反應(yīng)時(shí)，開始與受體結(jié)合誘導(dǎo)STAT3介導(dǎo)抑炎反應(yīng)來(lái)平衡內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。除IL-10外，IL-6是另一個(gè)最顯著激活STAT3的細(xì)胞因子，在相同的細(xì)胞類型中，促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子也可能通過(guò)相同的分子發(fā)出信號(hào)，盡管誘導(dǎo)的反應(yīng)截然不同，并導(dǎo)致不同的基因激活程序［36］。當(dāng)DC被IL-6刺激時(shí)，STAT3是促炎的，但當(dāng)被IL-10刺激時(shí)，STAT3是抗炎的［37］。其他促炎因子，尤其是IL-6，對(duì)于DC的競(jìng)爭(zhēng)刺激是導(dǎo)致IL-10的上調(diào)的原因之一。IL-12由轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞產(chǎn)生，可刺激NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和IFN-γ的產(chǎn)生，對(duì)T細(xì)胞有促進(jìn)有絲分裂作用，在腸道穩(wěn)態(tài)和炎癥中起關(guān)鍵作用，與腸道炎癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［38］。也可以通過(guò)促進(jìn)IL-10和抑制性受體表達(dá)以及特化Treg細(xì)胞群的出現(xiàn)來(lái)支持一系列抗炎機(jī)制［39］。因此，試驗(yàn)結(jié)果顯示IL-12與IL-10的同時(shí)上調(diào)符合IL-12對(duì)IL-10的調(diào)節(jié)。IFN-γ是Th1主導(dǎo)的自身免疫過(guò)程的特征細(xì)胞因子，相關(guān)研究表明在炎癥和自身免疫性疾病期間，IFN-γ的內(nèi)源性產(chǎn)生應(yīng)被視為具有雙向免疫調(diào)節(jié)后果的過(guò)程，通常會(huì)導(dǎo)致病理學(xué)的緩和［40］。IFN-γ還可能刺激APC分泌更多的IL-12，從而觸發(fā)IFN-γ產(chǎn)生周期的重新激活，被稱為IFN-γ合成的正反饋回路，在腫瘤和炎癥環(huán)境中均存在這種變化［41］。IL-12的分泌量較IL-10與IFN-γ更高，位于這二者分泌的上游，側(cè)面印證其在二者之間的調(diào)節(jié)作用。此外DC中的IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以促進(jìn)共刺激分子（如CD40、CD54、CD80、CD86和CCR7）的高表達(dá)［42］。CD40是腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族的共刺激成員，與其配體結(jié)合可激活TRAF6來(lái)激活相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致DC的存活及成熟［43］。同時(shí)也可以間接激活NK細(xì)胞，主要是通過(guò)抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）分泌IL-12［44］。CD40在試驗(yàn)中分泌量最高，提示炎癥反應(yīng)的整體水平較高，同時(shí)CD40促進(jìn)IL-12進(jìn)一步上調(diào)抑炎因子IL-10。磷酸鈣納米顆粒中的殼聚糖常被用作免疫增強(qiáng)劑廣泛使用［26］。殼聚糖納米顆?？梢耘cDNA結(jié)合并保護(hù)其免受核酸酶降解［45］，透過(guò)生物屏障。研究表明殼聚糖作為DNA的載體，能夠增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)［46］，可以激活巨噬細(xì)胞，增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并增強(qiáng)細(xì)胞毒性CTL反應(yīng)［47］，可以通過(guò)誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生來(lái)刺激DC成熟，增強(qiáng)抗原特異性T輔助性T（Th-1）反應(yīng)［48］，因此可以解釋佐劑對(duì)照以及質(zhì)粒對(duì)照在試驗(yàn)中的有關(guān)細(xì)胞因子水平的上調(diào)。綜上，ET seven可以引起高水平的細(xì)胞免疫，同時(shí)雞體協(xié)調(diào)激活相關(guān)通路介導(dǎo)雙向免疫調(diào)節(jié)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，但單次免疫及兩次免疫難以引起高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答，三次加強(qiáng)免疫效果顯著增強(qiáng)，不排除免疫程序也可能對(duì)DNA疫苗的免疫有局限性，考慮合適的免疫日齡可能會(huì)改變細(xì)胞免疫應(yīng)答起效的時(shí)間。在磷酸鈣納米顆粒包被pcDNA3.1-ET seven免疫血清反應(yīng)原性的試驗(yàn)中，間接ELISA檢測(cè)到特異性IgG在二次免疫后呈現(xiàn)陽(yáng)性，且隨免疫次數(shù)增加形成強(qiáng)陽(yáng)性，證明質(zhì)粒pcDNA3.1-ET seven可誘導(dǎo)有效的體液免疫水平，免疫雞體后具有良好的免疫原性與反應(yīng)原性，這與Smith等［49］在新冠DNA疫苗的研發(fā)中，在小鼠體內(nèi)的免疫結(jié)果一致，一次免疫的體液免疫水平不足以達(dá)到陽(yáng)性，但在二次免疫后7 d呈現(xiàn)陽(yáng)性且免疫滴度持續(xù)升高，綜合細(xì)胞免疫及體液免疫水平，加強(qiáng)免疫的策略明顯優(yōu)于單次免疫，這與Song等［50］和Ding等［51］的結(jié)論相同，也為DNA球蟲疫苗的使用，提供了防控新思路。

在后續(xù)的研究中，需要探索ET seven DNA疫苗與蛋白疫苗的聯(lián)合免疫，結(jié)合prime-boost免疫策略，以研究細(xì)胞免疫結(jié)合體液免疫在特定免疫程序下對(duì)柔嫩艾美耳球蟲入侵雞體的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)，以期為球蟲新型疫苗的研究及應(yīng)用提供新思路。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建雞球蟲7價(jià)多表位嵌合重組抗原ET seven真核質(zhì)粒，在體外DF-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染有表達(dá)，結(jié)合磷酸鈣納米顆粒佐劑免疫雞體有較好免疫反應(yīng)，均能引起細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。ET seven具有良好的免疫原性，能夠?yàn)殡u球蟲基因工程疫苗的研發(fā)提供新思路。

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（編輯 白永平）