摘""要：木薯花葉病毒病（cassava"mosaic"disease，"CMD）對我國和世界木薯生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅和危害，目前尚無有效防治方法且缺乏抗性材料，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，被認(rèn)為是最有威脅性的病毒病之一，斯里蘭卡木薯花葉病毒（Sri"Lankan"cassava"mosaic"virus，"SLCMV）是引起木薯花葉病的主要病原之一。RNA沉默是植物和動物先天性的一種抗病毒免疫反應(yīng)機(jī)制，寄主轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post"transcriptional"gene"silencing，"PTGS）是真核生物中一種保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，也是重要的抗病毒免疫機(jī)制之一。寄主基因沉默抑制子（suppressor"of"gene"silencing"3，"SGS3）是PTGS通路的關(guān)鍵蛋白，在寄主抵御病毒侵染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。為抵御宿主這種免疫反應(yīng)，病毒通常編碼病毒沉默抑制子（viral"suppressors"of"RNA"silencing，"VSRs）來抵御寄主PTGS的病毒防御機(jī)制，與寄主蛋白互作是沉默抑制子發(fā)揮作用的主要作用機(jī)制之一。為探究SLCMV"AC2是否通過與AtSGS3互作而抑制寄主PTGS的免疫功能，本研究采用酵母雙雜交技術(shù)（yeast"two"hybrid"system，"Y2H）和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（bimolecular"fluorescence"complementation，"BiFC）分析SLCMV"AC2與AtSGS3之間的相互作用。結(jié)果表明：SLCMV"AC2與AtSGS3蛋白在酵母細(xì)胞和植物體內(nèi)均存在相互作用的關(guān)系。亞細(xì)胞共定位研究進(jìn)一步證明SLCMV"AC2在與AtSGS3互作后，可與AtSGS3形成siRNA-body的RDR6發(fā)生共定位。這些結(jié)果表明SLCMV"AC2可能通過與siRNA-body互作而影響寄主自身免疫機(jī)制，提高病毒致病性，SLCMV"AC2與AtSGS3的互作可能是SLCMV侵染木薯導(dǎo)致花葉癥狀發(fā)生的分子基礎(chǔ)。該研究結(jié)果為后續(xù)深入解析SLCMV致病機(jī)理提供新的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：斯里蘭卡木薯花葉病毒；SLCMV"AC2；AtSGS3；蛋白互作中圖分類號：Q71""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Interactions"Between"Sri"Lankan"cassava"mosaic"virus"AC2"and"AtSGS3"Proteins

LIU"Xueting1，2，"XIE"Qiuxian1，2，"LIU"Linyu1，2，"FU"Yan1，2，"ZHANG"Xiuchun2*，"REN"Yanli1*

1."School"of"Biological"and"Geographical"Sciences，"Yili"Normal"University，"Yining，"Xinjiang"835000，"China;"2."Institute"of"Tropical"Bioscience"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："Cassava"mosaic"disease"（CMD）"poses"a"serious"threat"and"danger"to"cassava"production"in"China"and"the"world，"and"there"is"no"effective"control"method"andnbsp;lack"of"resistant"materials，"causing"serious"economic"losses，"and"is"considered"one"of"the"most"threatening"viral"diseases."Sri"Lankan"cassava"mosaic"virus"（SLCMV）"is"one"of"the"major"pathogens"causing"cassava"mosaic"disease."RNA"silencing"is"an"innate"antiviral"immune"response"mechanism"in"plants"and"animals，"and"post"transcriptional"gene"silencing"（PTGS）"is"a"conserved"gene"expression"regulatory"mechanism"in"eukaryotes，"and"is"one"of"the"important"antiviral"immune"mechanisms."Suppressor"of"gene"silencing"3"（SGS3）"is"a"key"protein"of"the"PTGS"pathway"and"plays"a"critical"role"in"host"defense"against"viral"invasion."To"counteract"this"host"immune"response，"viruses"usually"encode"viral"suppressors"of"RNA"silencing"（VSRs）"to"counteract"the"viral"defense"mechanism"of"host"PTGS，"and"interaction"with"host"proteins"is"one"of"the"main"mechanisms"of"action"for"the"silencing"suppressors"to"function."In"order"to"investigate"whether"SLCMV"AC2"inhibits"the"immune"function"of"host"PTGS"by"interacting"with"AtSGS3，"we"analyzed"the"immune"function"of"host"PTGS"by"using"yeast"two-hybrid"（Y2H）"system"and"bimolecular"fluorescence"complementation"（BiFC）"experiments，"to"analyze"the"interaction"between"AtSGS3"and"SLCMV"AC2."The"results"showed"that"SLCMV"AC2"interacted"with"AtSGS3"protein"in"both"yeast"cells"and"plants."In"subcellular"co-localization"experimental"studies，"we"further"demonstrated"that"SLCMV"AC2"could"co-localize"with"AtRDR6，"a"close"partner"of"AtSGS3，"after"interacting"with"AtSGS3."The"data"suggest"that"SLCMV"AC2"may"affect"the"host"autoimmune"mechanism"and"enhance"viral"pathogenicity"by"interacting"with"siRNA-body，"and"that"the"interaction"between"SLCMV"AC2"and"AtSGS3"may"be"the"molecular"basis"for"the"development"of"foliar"symptoms"in"SLCMV-infected"cassava，"and"the"results"of"this"study"would"provide"a"new"theoretical"basis"for"the"subsequent"in-depth"analysis"of"the"pathogenicity"mechanism"of"SLCMV.

Keywords："Sri"Lankan"cassava"mosaic"virus"（SLCMV）;"SLCMV"AC2;"AtSGS3;"protein"interaction

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.003

RNA沉默，又被稱為RNA干擾（RNA"interfe re nce，"RNAi）是生物進(jìn)化過程中由雙鏈RNA誘發(fā)的、高度保守的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。寄主轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post"transcriptional"gene"silencing，"PTGS）是真核生物中一種保守的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，在很多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。植物通過PTGS增強(qiáng)寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，減少病毒的積累，從而減緩病毒的系統(tǒng)侵染，因此PTGS也是重要的抗病毒免疫機(jī)制之一[1-4]。在植物體內(nèi)，PTGS包括起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段[5]。PTGS的起始階段是來源不同的雙鏈RNA（double-stranded"RNAs，"dsRNA）或者內(nèi)部折疊形成的局部dsRNA經(jīng)核酸酶RNase-Ⅲ家族的Dicer-like（簡稱DCL）切割產(chǎn)生19～25"nucleotide（nt）長的雙鏈小RNA（siRNA）。效應(yīng)階段則是產(chǎn)生的初級sRNA被Argonaute（AGO）蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-ind uced"silencing"complex，"RISC），并指導(dǎo)AGO蛋白專一地識別與其互補(bǔ)的RNA或DNA序列進(jìn)行切割或修飾。在效應(yīng)階段由AGOs切割產(chǎn)生的單鏈RNA會在植物體內(nèi)依賴RNA的RNA聚合酶（RNA"dependent"RNA"polymerases，"RDRs）的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閐sRNA，由DCL切割成雙鏈siRNAs，將沉默信號進(jìn)行放大則稱為擴(kuò)增階段。

研究表明，依賴RNA的RNA聚合酶6（RNA"dependent"RNA"polymerase"6，"RDR6）是合成dsRNA的關(guān)鍵酶，對多種病毒具有抗性。RDR6的沉默會導(dǎo)致中國小麥花葉病毒（Chinese"wheat"mosaic"virus，"CWMV）等多種病毒RNA的積累[6-9]，因此在抗病毒沉默途徑中起著重要作用?；虺聊种谱?（suppressor"of"gene"silencing"3，"SGS3）在PTGS中的功能大多都與RDR6一同被鑒定出來，作為RDR6的輔助因子SGS3本身無法合成dsRNA，但當(dāng)與RDR6在細(xì)胞質(zhì)中形成小的、較為分散的焦點(diǎn)狀，被稱為siRNA-body的顆粒，可將植物體內(nèi)的單鏈小RNA（single"stranded"small"RNA，"ssRNA）招募到RDR6上，使其進(jìn)行dsRNA的合成。因此在植物的抗病毒沉默途徑中同樣起著重要作用，然而二者之間的動態(tài)平衡往往是由植物病毒或其他植物組分所操控的。例如，甘薯褪綠矮化病毒（Sweet"potato"chlorotic"stunt"virus，"SPCSV）所編碼的RNase3能夠與siRNA-body產(chǎn)生共定位，抑制RNAi及削弱植物的抗病毒防御[10]，萵苣壞死黃色病毒（Lettuce"necrotic"yellows"virus，"LNYV）所編碼的P蛋白可通過在細(xì)胞質(zhì)中與siRNA-body發(fā)生相互作用從而抑制RNAi擴(kuò)增[11]，車前草花葉病毒（Plantago"asiatica"mosaic"virus，"PlAMV）則通過編碼的TGBp1蛋白與siRNA-body發(fā)生互作從而抑制dsRNA和ta-siRNA的合成[12]。

斯里蘭卡木薯花葉病毒（Sri"Lankan"cassava"mosaic"virus，"SLCMV）是雙生病毒科（Geminiv iri dae）菜豆金黃花葉病毒屬（Begomovirus）木薯雙生病毒（Cassava"mosaic"virus，"CMV）的一個株系，是引發(fā)木薯花葉?。╟assava"mosaic"disease，"CMD）的主要病原物之一[13]。SLCMV基因組由DNA-A[包含6個基因：AV1（CP）、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4]和DNA-B（包含2個基因：BV1、BC1）2個環(huán)狀單鏈DNA組分組成，是一個典型的雙組分單鏈DNA病毒，SLCMV編碼的AC2蛋白則是由DNA-A組分反義鏈編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子[13-14]。病毒是專性寄生生物，擁有極小的基因組，因此編碼的蛋白大多數(shù)是多功能蛋白，研究表明東非木薯花葉喀麥隆病毒（East"African"cassava"mosaic"Cameroon"virus，"EACMCV）編碼的AC2蛋白不僅對基因的轉(zhuǎn)錄激活有著高度保守的作用，而且還是沉默抑制子，在病毒侵染過程中發(fā)揮著重要作用[15]。然而，SLCMV"AC2是否通過與寄主PTGS沉默抑制通路的關(guān)鍵蛋白SGS3互作進(jìn)而抵御寄主的自身免疫功能還未見相關(guān)報道。為研究SLCMV是否可能通過AC2蛋白與寄主因子SGS3和RDR6相互作用，而抑制寄主RNA沉默功能導(dǎo)致病毒致病性增強(qiáng)，本研究利用酵母雙雜交（yeast"two-hybrid，"Y2H）、雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular"fluorescence"complementation，"BiFC）和亞細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn)，對SLCMV"AC2蛋白與擬南芥SGS3（AtSGS3）之間的相互作用進(jìn)行研究，研究結(jié)果將為闡明木薯花葉病毒是如何調(diào)控RNA沉默的抗病毒防御功能的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1""材料與方法

1.1""材料

本氏煙草（Nicotiana"benthamiana）種子、酵母表達(dá)載體pGADT7、pGBKT7、AD-T、BD-53、AD-PARN[16]、BD-SGS3[17]、植物表達(dá)載體pG1300-YN1、YC-SGS3、pZP-P19[17]和RDR6-RFP均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ等工具酶購于寶日生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）；高效無縫克隆試劑盒購于莫納生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于上海易匯生物科技有限公司（OMEGA）；大腸桿菌DH5α、酵母感受態(tài)AH109和農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101均購于上海唯地生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒和DNA"Marker購于天根生化科技（北京）有限公司；LB培養(yǎng)基購于生工生物工程（上海）股份有限公司；SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基均購于北京泛基諾科技有限公司；3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）購于北京啟研生物科技有限公司；卡那霉素（kana my cin）、利福平（rifampicin）購于北京索寶來科技有限公司。

1.2""方法

1.2.1""酵母表達(dá)載體BD-AC2的構(gòu)建""為構(gòu)建SLCMV"AC2蛋白含結(jié)合域的酵母表達(dá)載體BD-AC2，參考已報道的SLACMV序列（GenBank："KT861468.1），人工合成兩端分別添加酵母獵物載體pGBKT7限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)兩側(cè)序列的目的片段Y2H-AC2。參照無縫克隆試劑盒說明書，將人工合成片段Y2H-AC2與經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后的pGBKT7載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布到含有50"ng/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，將平板倒置于37"℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12"h。挑取3～5個單菌落，使用通用引物pGBKT7-F和pGBKT7-R（表1）進(jìn)行菌落PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系：引物（10"μmol/L）各1"μL，2×Magic"Green"Taq"SuperMix10"μL，用ddH2O補(bǔ)充到20"μL。PCR反應(yīng)條件為：94"℃預(yù)變性5"min，94"℃變性30"s，56"℃退火30"s，72"℃延伸1"min，循環(huán)35次；最后72"℃徹底延伸10"min。挑取2個經(jīng)菌落PCR鑒定的陽性克隆，委托華大基因科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2""熒光雙分子互補(bǔ)表達(dá)載體YN-AC2的構(gòu)建""為構(gòu)建SLCMV"AC2蛋白含綠色熒光蛋白N端序列的的BiFC載體YN-AC2，參考已報道的SLACMV序列（GenBank："KT861468.1），人工合成兩端分別添加表達(dá)載體pG1300-YN1[17]限制性核酸內(nèi)切酶MluⅠ和KpnⅠ位點(diǎn)兩側(cè)序列的目的片段BiFC-AC2。參照無縫克隆試劑盒說明書將目的片段BiFC-AC2與經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Mlu"I和Kpn"I進(jìn)行雙酶切后的pG1300-YN1進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布到含有50"ng/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，將平板倒置于37"℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12"h。挑取3～5個單菌落進(jìn)行PCR檢測，使用AC2特異引物AC2-1F和AC2-390R（表1）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件與1.2.1中一致，挑取經(jīng)PCR鑒定為陽性的克隆委托深圳華大基因科技有限公司完成測序鑒定。

1.2.3""酵母自激活性鑒定""參照產(chǎn)品說明書將構(gòu)建成功的AC2酵母誘餌載體與酵母激活域表達(dá)載體pGADT7共同轉(zhuǎn)化AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Leu/-Trp（SD-LW）培養(yǎng)基上，28"℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48～96"h，挑取經(jīng)PCR鑒定陽性的單克隆菌落于25nbsp;μL無菌水中，重懸制成懸浮菌液，使用無菌水梯度稀釋成10倍、100倍、1000倍，各吸取2"μL接種于SD-LW培養(yǎng)基和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade（SD-LWHA）缺陷培養(yǎng)基中，分別以AD-T與BD-Lam和AD-T與BD-53共轉(zhuǎn)化的酵母為陰性對照和陽性對照。共轉(zhuǎn)化成功的酵母單菌落進(jìn)行梯度稀釋后接種于固體培養(yǎng)基中，28"℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3"d觀察并記錄生長情況。若酵母菌落僅在SD-LW培養(yǎng)基中能正常生長，而在SD-LWHA培養(yǎng)基中無法生長，則說明質(zhì)粒無自激活活性；若酵母菌落在SD-LW培養(yǎng)基和SD-LWHA培養(yǎng)基中均能正常生長，說明該酵母誘餌表達(dá)載體具有自激活活性。若有自激活活性，則采取在SD-LWHA缺陷型培養(yǎng)基中添加3-AT的方法進(jìn)行抑制，逐步增加3-AT的濃度，直至其在添加了該濃度3-AT的SD-LWHA培養(yǎng)基中菌落無法正常生長，則說明在該濃度的3-AT條件下BD-AC2自激活活性基本抑制，可作于后續(xù)點(diǎn)板3-AT添加的濃度。

1.2.4""酵母雙雜交研究SLCMV"AC2與AtSGS3蛋白互作""參照AH109"Chemically"Competent"Cell"產(chǎn)品說明書將SLCMV"AC2的誘餌質(zhì)粒和AtSGS3的激活域載體AD-SGS3共轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母細(xì)胞中，重懸后的細(xì)胞懸液均勻涂布到SD-LW培養(yǎng)基中，倒置于28"℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～96"h，待菌落長出后，挑取單克隆菌落分別使用誘餌載體和激活域載體的通用引物pGBKT7-F/"pGBKT7-R和pGADT7-F/pGADT7-R進(jìn)行PCR鑒定。鑒定正確的菌落梯度稀釋后各取2"μL不同濃度稀釋的菌液分別接種于SD-LW培養(yǎng)基和SD-LWHA培養(yǎng)基，置于28"℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)3～5"d，觀察并記錄SLCMV"AC2與AtSGS3是否互作。

1.2.5""熒光雙分子互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SLCMV"AC2與AtSGS3蛋白互作""參照GV3101"Chemically"Competent"Cell產(chǎn)品說明書將植物表達(dá)載體YN-AC2、YN-SGS3和pG1300-YN1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌均勻涂布到含有相應(yīng)抗性的LB固體培養(yǎng)基上，28"℃倒置培養(yǎng)72～"90"h。使用槍頭挑取經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的單菌落到5"mL含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，置于28"℃"200"r/min恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)過夜。菌液7000"r/min離心15"min后棄上清，并使用5"mL注射緩沖液重懸沉淀，充分旋渦震蕩均勻后將菌液濃度均稀釋至OD600為0.5。注射緩沖液配置：分別取2"mL"1"mol/L的MgCl2，2"mL"1"mol/L的2-嗎啉乙磺酸（MES）和200"μL"100"mg/ml的乙酰丁香酮（AS），最后用超純水定容到200"mL。稀釋后的菌液在室溫放置2～3"h后，等體積混勻用于注射生長旺盛的5～7葉期本生煙葉片。每個組合3個重復(fù)，注射后的本生煙避光處理過夜，然后在正常條件下培養(yǎng)。2～3"d后，每個樣品取約1～2"cm2使用激光共聚焦顯微鏡（Olympus"FV3000）進(jìn)行觀察煙草細(xì)胞熒光情況并拍照，GFP激發(fā)光為488"nm。

1.2.6""SLCMV"AC2與AtSGS3形成的復(fù)合物和AtRDR6的亞細(xì)胞共定位""參照1.2.5中的實(shí)驗(yàn)方法將重組質(zhì)粒YN-AC2、YC-SGS3、RDR6-RFP與pZP-P19分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)，挑取經(jīng)PCR鑒定為陽性的單克隆菌落到含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。參照1.2.5中的配方配置注射緩沖液，使用注射緩沖液將菌液重懸并將OD600的值均一到0.5，將菌液OD600均為0.5的YN-AC2、YC-SGS3、RDR6-RFP與pZP-P19四種農(nóng)桿菌菌液以1∶1∶1∶1的比例混勻，室溫靜置2～3"h后注射本生煙，至少注射3片煙草葉片，避光條件下處理24"h，然后在正常條件下處理2～3"d。使用熒光共聚焦顯微鏡對煙草細(xì)胞熒光表達(dá)情況進(jìn)行觀察并拍照記錄，GFP激發(fā)光為488"nm，RFP激發(fā)光為546"nm。

2""結(jié)果與分析

2.1""酵母表達(dá)載體BD-AC2的構(gòu)建

使用pGBKT7載體通用引物對選取的4個大腸桿菌單克隆菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖1所示。不同BD-AC2單克隆菌落PCR產(chǎn)物的片段大小均在500～750"bp之間，與預(yù)期目的基因片段大小一致，4個菌落均為陽性克隆，其中2個陽性克隆的測序序列比對正確，表明酵母誘餌表達(dá)載體BD-AC2構(gòu)建成功。

2.2""熒光雙分子表達(dá)載體YN-AC2的構(gòu)建

使用SLCMV"AC2特異引物對選取的4個大腸桿菌單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示。不同YN-AC2單克隆菌落PCR產(chǎn)物片段大小均約為250～500"bp，與預(yù)期目的基因片段大小一致，4個菌落均為陽性克隆，其中2個陽性克隆的測序序列比對正確，表明熒光雙分子表達(dá)載體YN-AC2構(gòu)建成功。

2.3""酵母自激活鑒定

酵母自激活驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示，可以觀察到陽性對照在SD-LW二缺培養(yǎng)基和SD-LWHA四缺培養(yǎng)基中均能正常生長形成菌落，而陰性對照僅在SD-LW培養(yǎng)基中正常生長，表明該酵母雙雜交系統(tǒng)能有效檢驗(yàn)蛋白之間的互作。BD-AC2與pGADT7共轉(zhuǎn)化的菌株在SD-LW和SD-LWHA缺陷型培養(yǎng)基中均能正常生長，但在添加4"mmol/L"3-AT的SD-LWHA缺陷型培養(yǎng)基不能正常生長。

該結(jié)果表明BD-AC2質(zhì)粒具有自激活活性，即不與其他蛋白相互作用的條件下可激活下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但4"mmol/L"3-AT可有效抑制BD-AC2的自激活活性。AD-SGS3與BD共轉(zhuǎn)化的酵母菌株僅在SD-LW二缺培養(yǎng)基中正常生長，在SD-LWHA四缺培養(yǎng)基中則無法正常生長，表明AD-SGS3質(zhì)粒不存在自激活活性，可直接用于后續(xù)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。

2.4""SLCMV"AC2與AtSGS3互作的酵母雙雜交驗(yàn)證

SLCMV"AC2與AtSGS3互作的酵母雙雜交驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示，所有共轉(zhuǎn)化的酵母在SD-LW缺陷型培養(yǎng)基中均能正常生長，但在添加4"mmol/L"3-AT的SD-LWHA缺陷型培養(yǎng)基中僅陽性對照及共轉(zhuǎn)化BD-AC2與AD-SGS3的酵母可正常生長，陰性對照及共轉(zhuǎn)化BD-AC2與AD-PARN的酵母無法正常生長。結(jié)果表明BD-AC2與AD-SGS3之間存在相互作用。

2.5""BiFC驗(yàn)證SLCMV"AC2與AtSGS3相互作用

剪取不同處理的本生煙葉片在激發(fā)光為488"nm條件下的激光共聚焦顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果表明：YN-AC2與YC-SGS3共注射本生煙葉片可在激發(fā)光488"nm下恢復(fù)綠色熒光，而空載pG1300-YN1與YC-SGS3共同注射未見熒光恢復(fù)（圖5），進(jìn)一步驗(yàn)證了斯里蘭卡木薯花葉病毒AC2與AtSGS3之間的相互作用。

2.6""SLCMV"AC2與AtSGS3形成的復(fù)合物和RDR6的亞細(xì)胞共定位

為研究SLCMV"AC2與AtSGS3形成的復(fù)合物是否與AtRDR6在細(xì)胞內(nèi)共定位，將YN-AC2、YC-SGS3與攜帶RFP標(biāo)簽的重組質(zhì)粒RDR6-RFP和pZP-P19共注射本生煙。結(jié)果如圖6所示，與BiFC結(jié)果相同，SLCMV"AC2與AtSGS3在激發(fā)光488"nm下恢復(fù)綠色熒光，并且與激發(fā)光546"nm條件下RDR6-RFP表達(dá)的紅色熒光發(fā)生重合。該研究結(jié)果表明SLCMV"AC2與AtSGS3形成的復(fù)合物和AtRDR6在本生煙表皮細(xì)胞中共定位。

3""討論

重組是許多病毒進(jìn)化的關(guān)鍵過程，尤其是對于基因組高度壓縮的雙生病毒，這導(dǎo)致病毒快速變異[18]，木薯花葉病是一種高度復(fù)雜的疾病，這與木薯花葉病毒是典型的雙組分雙生病毒息息相關(guān)。PTGS是植物抗病毒防御天然機(jī)制，為了成功建立感染，在復(fù)制和基因表達(dá)過程中利用RNA的病毒必須克服宿主抗病毒沉默反應(yīng)。

病毒編碼的蛋白大多數(shù)是多功能蛋白，研究表明雙生病毒編碼的AC2蛋白不僅對基因的轉(zhuǎn)錄激活有著高度保守的作用，并且可能在病毒侵染過程中發(fā)揮著重要作用。SUNTER等[19]研究表明，雙生病毒編碼的AC2蛋白是反式激活晚期病毒基因AV1和BV1的病毒轉(zhuǎn)錄激活因子，近期也有研究表明ACMV的AC2反式激活幾個植物基因[20-21]。VANITHARANI等[15]研究表明印度木薯花葉病毒（Indian"cassava"mosaic"virus）編碼的AC2蛋白是病毒沉默抑制子，能抑制寄主

圖6""亞細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SLCMV"AC2和SGS3與RDR6在煙草細(xì)胞核中的共定位

Fig."6""Subcellular"co-localization"experiment"to"verify"the"co-localization"of"SLCMV"AC2"and"SGS3"with"RDR6"in"tobacco"nucleus

PTGS對病毒的降解，提高病毒復(fù)制量和致病性；研究還發(fā)現(xiàn)EACMCV編碼的AC2與協(xié)同基因非洲木薯花葉病毒喀麥隆株（African"cassava"mosaic"virus，ACMV-[CM]）編碼的AC4共同作用能夠抑制GFP誘導(dǎo)的PTGS，并消除與PTGS相關(guān)的siRNA，同時增加GFP"mRNA積累。SGS3不僅調(diào)控植物生長發(fā)育，還參與次級siRNA的產(chǎn)生并放大PTGS的沉默效應(yīng)，在抗病毒過程中發(fā)揮重要作用，是寄主PTGS通路的關(guān)鍵蛋白。在抗病毒防御中SGS3的作用因病毒而異，如寄主SGS3被沉默或敲除后，馬鈴薯A病毒（Potato"virus"A，"PVA）、油菜花葉病毒（Oilseed"rape"mosaic"virus，"ORMV），蕪菁花葉病毒（Turnip"mosaic"virus，"TuMV）等的病毒積累量也隨之降低；而黃瓜花葉病毒（Cucumber"mosaic"virus，"CMV）則在SGS3被敲除后積累量大幅提高；蕪菁清脈病毒（Turnip"vein"clearing"virus，"TVCV）則基本不受SGS3表達(dá)量的影響[22]。研究報道，多種病毒的VSR已經(jīng)進(jìn)化出不同的機(jī)制來抑制SGS3的功能[23]，如番茄黃葉卷曲病毒（Tomato"yellow"leaf"curl"virus，"TYLCV）編碼的V2蛋白通過直接競爭SGS3底物來抑制SGS3的RNA結(jié)合活性[24]，車前草花葉病毒（Plantago"asiatica"mosaic"virus，"PlAMV）TGBp1蛋白直接通過與SGS3/RDR6相互作用并共同聚集來干擾dsRNA的合成[12]。然而長期以來的研究表明，與SGS3互作或促進(jìn)SGS3降解而抑制寄主PTGS的抗病毒免疫功能很可能是一種普遍存在的植物病毒侵染機(jī)制[23，"25-26]，如NbCaM可與NbSGS3相互作用并通過自噬介導(dǎo)NbSGS3蛋白水平降解，從而起到RNA沉默抑制因子的作用并增強(qiáng)病毒感染[27]；水稻條紋花葉病毒（Rice"stripe"mosaic"virus，"RSMV）編碼的P4可以與水稻內(nèi)源基因沉默抑制因子3（OsSGS3）相互作用，并通過泛素化和自噬通路促進(jìn)OsSGS3的降解[28]。然而SLCMV"AC2是否通過與寄主PTGS沉默抑制通路的關(guān)鍵蛋白SGS3互作進(jìn)而抵御寄主的自身免疫功能尚無相關(guān)報道，為探討SLCMV的植物病毒侵染機(jī)制，首先構(gòu)建BD-AC2酵母表達(dá)載體，與AD-SGS3共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)，酵母雙子雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)SLCMV"AC2蛋白能與SGS3發(fā)生蛋白的相互作用；然后本研究構(gòu)建YN-AC2熒光雙分子表達(dá)載體，與YC-SGS3表達(dá)載體的農(nóng)桿菌共注射并在煙草葉片中瞬時表達(dá)，熒光雙分子實(shí)驗(yàn)中也驗(yàn)證了二者之間的互作。作為RDR6的輔助因子，SGS3在PTGS中的所有功能幾乎都是與RDR6一起被鑒定出來的，如rdr6或sgs3突變體對CMV的侵染超級敏感性并且能夠抑制GUS轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的s-PTGS、rdr6或sgs3突變體能夠抑制雙生病毒誘導(dǎo)的基因沉默等；rdr6或sgs3突變體表現(xiàn)的發(fā)育畸形是由于抑制了TAS3的合成等。已有研究表明SGS3/RDR6介導(dǎo)的病毒siRNA擴(kuò)增在幾種病毒中發(fā)揮重要的抗病毒作用，如蕪菁皺縮病毒（Turnip"crinkle"virus，"TCV）[17]，馬鈴薯A病毒（Potato"virus"A，"PVA）[25]、番茄帶狀斑點(diǎn)病毒（Tomato"zonate"spot"virus，"TZSV）[29]等。本研究結(jié)果表明SLCMV"AC2不僅與AtSGS3互作，并且形成的復(fù)合物與AtSGS3形成siRNA-body的RDR6發(fā)生共定位，因此推測AC2蛋白可能通過與AtSGS3互作影響siRNA-body的形成從而抑制寄主PTGS功能導(dǎo)致病毒致病性增強(qiáng)。

迄今，已從幾乎所有的真核生物病毒屬中鑒定出至少一種VSRs，通過干擾PTGS的各個步驟劫持或抑制抗病毒PTGS。已有研究表明SLCMV"AC4是病毒基因沉默的強(qiáng)抑制子，可通過抑制寄主RNA沉默誘導(dǎo)的PTGS通路提高致病性[15]，在本研究中發(fā)現(xiàn)SLCMV"AC2可與AtSGS3存在相互作用，然而SLCMV"AC2是否發(fā)揮沉默抑制子的功能？SLCMV"AC2是否通過與寄主SGS3互作來對寄主行使PTGS病毒調(diào)控機(jī)制起負(fù)調(diào)控作用？以及具體相互作用機(jī)理尚不明確，這些問題還有待進(jìn)一步研究。

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