摘""要：易碎胚性愈傷組織和胚性懸浮細(xì)胞系都是基因工程和細(xì)胞工程的理想受體材料。然而橡膠樹(shù)（Hevea"brasiliensis）易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)頻率低、耗時(shí)長(zhǎng)，且其胚性能力通常隨繼代次數(shù)的增加而下降甚至完全喪失，限制了相關(guān)研究的持續(xù)開(kāi)展。因此，快速獲得易碎胚性愈傷組織，建立具有高效體胚發(fā)生能力的胚性懸浮細(xì)胞系，并盡可能較長(zhǎng)時(shí)間維持其胚性能力是當(dāng)前橡膠樹(shù)基因工程和細(xì)胞工程研究的重要內(nèi)容。本研究以橡膠樹(shù)熱墾525未成熟花藥為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和胚性懸浮細(xì)胞系的建立，分析比較固液2種長(zhǎng)期繼代方式對(duì)維持其胚性能力的影響。結(jié)果表明：花藥外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲得的黃色致密初代愈傷組織體胚發(fā)生能力低，分散性差，不適合進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。將初代愈傷組織轉(zhuǎn)移至胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)70～80"d后，可觀察到有胚性結(jié)構(gòu)的形成和早期體細(xì)胞胚發(fā)生，同時(shí)周?chē)L(zhǎng)出鮮黃色小顆粒狀易碎胚性愈傷組織。通過(guò)常規(guī)方法建立的Ⅰ型胚性懸浮細(xì)胞系具備胚性細(xì)胞的典型特征，體胚發(fā)生能力顯著高于胚性愈傷組織，但在體胚發(fā)生過(guò)程中容易重新愈傷化；而通過(guò)篩選特定形態(tài)的胚性愈傷組織低密度啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)建立的Ⅱ型胚性懸浮細(xì)胞系，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞處在有序的胚性結(jié)構(gòu)中，其體胚發(fā)生頻率可達(dá)100%。在含2"mg/L"2，4-D的液體培養(yǎng)中持續(xù)繼代2"a后細(xì)胞明顯老化且增殖緩慢，體胚發(fā)生能力幾近喪失；而在去除2，4-D并添加低濃度脫落酸（0.1"mg/L）和水解酪蛋白（0.5"g/L）的固體培養(yǎng)基上持續(xù)繼代2"a后，體胚發(fā)生能力仍能維持在較高水平。所建立的Ⅱ型胚性懸浮細(xì)胞系可為橡膠樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化及原生質(zhì)體培養(yǎng)等相關(guān)研究長(zhǎng)期提供優(yōu)質(zhì)充足且狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定的材料來(lái)源。

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù)；易碎胚性愈傷組織；胚性懸浮細(xì)胞系；體胚發(fā)生；胚性維持中圖分類(lèi)號(hào)：S794.1""""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Establishment"of"Embryogenic"Cell"Suspensions"of"Hevea"brasiliensis"Clone"Reken"525"and"Maintenance"of"Its"Embryogenic"Competence

DAI"Xuemei，"PENG"Suna，"CHENG"Jing，"GU"Xiaochuan，"HUANG"Tiandai*

Rubber"Research"Institute，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Biology"and"Genetic"Resources"of"Rubber"Tree，nbsp;Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"State"Key"Laboratory"Incubation"Base"for"Cultivation"amp;"Physiology"of"Tropical"Crops"/"Engineering"Center"for"Rapid"Propagation"of"Tropical"Woody"Plants"/"Haikou"Key"Laboratory"of"Tropical"Plant"Seedling"Innovation，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："Both"friable"embryogenic"callus"and"suspension"cells"are"ideal"materials"for"genetic"and"cell"engineering."However，"the"induction"of"friable"embryogenic"callus"of"Hevea"brasiliensis"is"low"frequency"and"time-consuming，"and"its"embryogenic"competence"usually"decreases"gradually"or"even"completely"loses"with"the"increase"of"subculture"times."Therefore，"to"quickly"obtain"friable"embryogenic"callus，"establish"embryogenic"cell"suspensions"with"high"efficiency"of"somatic"embryogenesis，"and"maintain"the"embryogenic"competence"as"long"as"possible，"are"important"research"contents"for"genetic"and"cell"engineering"of"H."brasiliensis."In"this"study，"the"immature"anthers"of"H."brasiliensis"clone"Reken"525"was"used"as"the"explants"to"induce"callus"and"establish"embryogenic"cell"suspensions，"and"the"effects"of"two"long-term"subculture"methods-solid"and"liquid"on"the"maintenance"of"embryogenic"competence"were"compared"and"analyzed."The"results"showed"that"the"yellow"and"compact"primary"callus"tissue"induced"from"anther"explants"on"callus"induction"medium"had"a"low"ability"for"somatic"embryogenesis，"and"was"not"suitable"for"suspension"culture"due"to"poor"dispersion."After"70-80"d"of"culture"on"the"medium"for"embryogenic"callus"induction，"the"formation"of"embryogenic"structures"and"early"somatic"embryogenesis"were"observed，"and"bright"yellow"small"granular"friable"embryogenic"calli"grew"around"them."The"type"Ⅰ"embryogenic"suspension"cell"line"established"through"routine"methods"possessed"typical"characteristics"of"embryogenic"cells，"and"the"frequency"of"somatic"embryogenesis"was"significantly"higher"than"that"of"embryogenic"callus"tissue，"but"proned"to"callus"formation"during"somatic"embryogenesis;"the"type"Ⅱ"embryogenic"suspension"cell"line"established"by"screening"specific"embryogenic"tissue"and"initiating"with"low"density"suspension"culture"was"in"an"orderly"embryonic"structure"observed"by"microscope，"and"its"frequency"of"somatic"embryogenesis"could"reach"up"to"100%."After"two"years"of"continuous"subculture"in"liquid"culture"medium"containing"2"mg/L"2，4-D，"the"cells"were"obviously"aging"with"lower"proliferation"coefficient，"and"the"ability"for"somatic"embryogenesis"was"almost"lost."However，"the"ability"for"somatic"embryogenesis"still"remained"at"a"high"level"after"two"years"of"continuous"subculture"on"solid"culture"medium"without"2，4-D"but"supplemented"with"abscisic"acid"（0.1"mg/L）"and"hydrolyzed"casein"（0.5"g/L）."The"type"Ⅱ"embryogenic"suspension"cell"line"could"provide"high-quality，"sufficient"and"relatively"stable"material"sources"for"genetic"transformation"and"protoplast"culture"of"Hevea"brasiliensis"in"the"long"term.

Keywords："Hevea"brasiliensis;"friable"embryogenic"callus;"embryogenic"cell"suspensions;"somatic"embryogenesis;"maintenance"of"embryogenic"competence

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.011

橡膠樹(shù)（Hevea"brasiliensis）花藥、內(nèi)珠被等外植體通過(guò)離體誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的初代愈傷組織的體胚發(fā)生頻率和植株再生能力通常均不高，必須通過(guò)進(jìn)一步合適的培養(yǎng)或采取特定的方法才能誘導(dǎo)出松散型的易碎胚性愈傷組織。這種類(lèi)型的愈傷組織不僅體胚發(fā)生能力得到大幅度的提高，而且能通過(guò)繼代培養(yǎng)進(jìn)行穩(wěn)定快速增殖，是進(jìn)行橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)基因和基因編輯的良好受體材料[1-5]。橡膠樹(shù)高質(zhì)量易碎胚性愈傷組織的誘導(dǎo)頻率低，耗時(shí)長(zhǎng)，從起始外植體的誘導(dǎo)到獲得能穩(wěn)定快速增殖的易碎胚性愈傷組織系至少需要半年，且獲得的難易程度具有品種依賴(lài)性。目前橡膠樹(shù)易碎胚性愈傷組織的誘導(dǎo)主要通過(guò)以下2種途徑：（1）以花藥或內(nèi)珠被等為外植體，在誘導(dǎo)出初代愈傷組織后，調(diào)整繼代培養(yǎng)基中的激素配比和氯化鈣濃度，或直接在相同成分的培養(yǎng)基中通過(guò)長(zhǎng)期的繼代培養(yǎng)篩選得到易碎胚性愈傷組織，此方法建立胚性愈傷組織系需耗時(shí)10～18個(gè)月，且誘導(dǎo)頻率通常低于1%[6-9]。（2）經(jīng)花藥或內(nèi)珠被培養(yǎng)得到的愈傷組織，先誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，再以幼嫩的初生或次生胚為材料，將其對(duì)半縱切或用接種針刺劃后，轉(zhuǎn)至合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代篩選[10-11]，經(jīng)該方法得到易碎胚性愈傷組織的時(shí)間可縮短至7～10個(gè)月，誘導(dǎo)頻率也有所提高，但受品種胚性能力的限制，不能誘導(dǎo)出初生胚的品種無(wú)法通過(guò)此途徑獲得易碎胚性愈傷組織。易碎胚性愈傷組織通過(guò)懸浮培養(yǎng)建立的胚性懸浮細(xì)胞系，由于細(xì)胞團(tuán)大小和生理狀態(tài)較一致，在合適的液體培養(yǎng)條件下增殖速度往往快于固體培養(yǎng)的胚性愈傷組織，體胚發(fā)生頻率也得到一定程度的提高，可為規(guī)?；w胚誘導(dǎo)和體胚苗繁育提供大量生理狀態(tài)一致、發(fā)育同步性較好的材料來(lái)源[12]，同時(shí)也可為橡膠樹(shù)原生質(zhì)體培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化等提供細(xì)胞水平上的理想研究對(duì)象[13-16]。然而胚性懸浮細(xì)胞系的體胚發(fā)生能力隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加而呈下降趨勢(shì)，通常在繼代培養(yǎng)2～3"a后胚性便嚴(yán)重下降甚至完全丟失，這在很大程度上限制了橡膠樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體培養(yǎng)等研究的持續(xù)開(kāi)展。因此，如何快速獲得橡膠樹(shù)易碎胚性愈傷組織，建立具有高效體胚發(fā)生能力的胚性懸浮細(xì)胞系，并在繼代過(guò)程中盡可能較長(zhǎng)時(shí)間維持其胚性能力，是當(dāng)前橡膠樹(shù)基因工程和細(xì)胞工程研究的重要內(nèi)容。

橡膠樹(shù)熱墾525是由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所牽頭，聯(lián)合多家科研生產(chǎn)單位，經(jīng)系統(tǒng)鑒定選育出的我國(guó)首個(gè)速生、高產(chǎn)且具有廣適性的膠木兼優(yōu)品種[17]，目前尚無(wú)關(guān)于熱墾525胚性懸浮細(xì)胞系建立的報(bào)道。本研究以膠木兼優(yōu)的橡膠樹(shù)品種熱墾525為研究對(duì)象，通過(guò)花藥培養(yǎng)途徑在獲得易碎胚性愈傷組織后，選取特定形態(tài)的胚性愈傷組織為材料，采用低密度啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)的方式，建立具有高效體胚發(fā)生能力的胚性懸浮細(xì)胞系，并在繼代培養(yǎng)過(guò)程中探索長(zhǎng)時(shí)間維持其胚性能力的培養(yǎng)條件和方式，旨在為橡膠樹(shù)規(guī)?；w胚苗繁育及遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體培養(yǎng)等相關(guān)研究長(zhǎng)期提供相對(duì)穩(wěn)定且優(yōu)質(zhì)充足的材料來(lái)源。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""外植體材料""熱墾525花序采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州試驗(yàn)場(chǎng)基地。選取黃綠色未開(kāi)放的雄花蕾，經(jīng)常規(guī)消毒后，剝離完整的花藥粒作為起始外植體。

1.1.2""試劑及培養(yǎng)基""配制培養(yǎng)基所使用的無(wú)機(jī)鹽（包括大量元素、微量元素和鐵鹽）、蔗糖等購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；各種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及有機(jī)成分如維生素、氨基酸等均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司；植物凝膠購(gòu)自Sigma公司。在培養(yǎng)的各個(gè)階段采用的培養(yǎng)基編號(hào)及其組成成分見(jiàn)表1。

1.2""方法

1.2.1""初代愈傷組織和易碎胚性愈傷組織的誘導(dǎo)""從消毒雄花剝離出完整花藥粒接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1中，置于27"℃暗室中培養(yǎng)30～35"d后，將得到的初代愈傷組織轉(zhuǎn)入胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M2中，每30"d繼代1次，直至長(zhǎng)出鮮黃色小顆粒狀易碎胚性愈傷組織。

1.2.2""胚性懸浮細(xì)胞系的建立""常規(guī)方法啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)：直接用鑷子挑取1.2.1中獲得的易碎胚性愈傷組織2"g左右，轉(zhuǎn)至150"mL三角瓶中，加入30"mL液體培養(yǎng)基M3，置于27"℃暗培養(yǎng)室150"r/min搖床上啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)。在培養(yǎng)初期，每3～5"d更換1次液體培養(yǎng)基，同時(shí)用60目金屬濾網(wǎng)過(guò)濾除去不能分散的大細(xì)胞團(tuán)和褐化的組織，直至細(xì)胞團(tuán)完全均質(zhì)分散后改為每2周繼代一次，每次繼代時(shí)保留約1/5舊液體培養(yǎng)基，同時(shí)調(diào)整細(xì)胞團(tuán)和液體培養(yǎng)基的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2%～3%。經(jīng)此種方式建立的分散胚性懸浮細(xì)胞系命名為Ⅰ型胚性懸浮細(xì)胞系。

低密度啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)：在體視顯微鏡下挑取5～10粒顏色鮮黃、表面光滑、結(jié)構(gòu)緊密且含多個(gè)球形凸起的胚性組織（直徑為0.2～0.5"mm），轉(zhuǎn)至含30"mL液體培養(yǎng)基M4的三角瓶中，置于27"℃暗培養(yǎng)室150"r/min搖床上啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)。每2周繼代培養(yǎng)1次，直至得到分散均勻且能穩(wěn)定增殖的胚性細(xì)胞系。每次繼代時(shí)保留約1/5舊液體培養(yǎng)基，同時(shí)調(diào)整細(xì)胞團(tuán)和液體培養(yǎng)基的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1%～2%。經(jīng)此種方式建立的均質(zhì)胚性懸浮細(xì)胞系命名為Ⅱ型胚性懸浮細(xì)胞系。

1.2.3""體細(xì)胞胚誘導(dǎo)""將1.2.1中花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)的初代愈傷組織、易碎胚性愈傷組織以及1.2.2中經(jīng)2種不同方式啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)建立的胚性細(xì)胞懸浮系分別接種至固體體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基M5上，胚性懸浮細(xì)胞團(tuán)在接入固體培養(yǎng)基前先用不含激素的液體MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基漂洗2遍，以去除細(xì)胞的激素殘留，之后用滅菌濾紙吸干多余水分，每皿接種8塊愈傷組織或細(xì)胞團(tuán)（直徑為3～5"mm），不同材料各接種40塊，試驗(yàn)重復(fù)3次，置于27"℃暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每30"d繼代培養(yǎng)1次，60"d后分別計(jì)算體胚誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)系數(shù)。

1.2.4""胚性細(xì)胞系的繼代保存""將低密度啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)建立的胚性懸浮細(xì)胞系按以下2種方式進(jìn)行繼代保存：（1）繼續(xù)在相同成分的M4液體培養(yǎng)基中按每14"d一次的頻率進(jìn)行繼代保存；（2）將其轉(zhuǎn)至固體繼代培養(yǎng)基M6上，每20"d挑取新生長(zhǎng)的胚性愈傷組織（直徑為3～5"mm）進(jìn)行繼代保存。繼代培養(yǎng)2"a后分別取固體和液體繼代保存的材料接種至M5培養(yǎng)基上進(jìn)行體胚誘導(dǎo)，60"d后分別計(jì)算體胚誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)系數(shù)。

1.3""數(shù)據(jù)處理

體胚誘導(dǎo)率計(jì)算公式：體胚誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)獲得體胚的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)′100%；

體胚誘導(dǎo)系數(shù)計(jì)算公式：體胚誘導(dǎo)系數(shù)=誘導(dǎo)獲得的體胚總數(shù)/接種外植體總數(shù)。

采用Excel"2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理，用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析。

2""結(jié)果與分析

2.1""熱墾525初代愈傷組織和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

未成熟花藥外植體在接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基7"d后外植體開(kāi)始膨大，14"d后開(kāi)始有少量愈傷組織的生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)至30"d后即可誘導(dǎo)出黃色大顆粒、質(zhì)地較致密的初代愈傷組織（圖1A）。初代愈傷組織分散性差，不適宜進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在將其轉(zhuǎn)入胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M2培養(yǎng)

70～80"d后，可觀察到有胚性結(jié)構(gòu)及早期的體細(xì)胞胚發(fā)生，同時(shí)在部分體細(xì)胞胚基部或周?chē)L(zhǎng)出鮮黃色、小顆粒狀易碎胚性愈傷組織（圖1B）。

2.2""不同方式建立胚性細(xì)胞懸浮系

以易碎胚性愈傷組織為材料，采用常規(guī)方法啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)60目金屬濾網(wǎng)的過(guò)濾篩選和6～8次的繼代培養(yǎng)后，獲得均質(zhì)分散且快速增殖的Ⅰ型胚性懸浮細(xì)胞系（圖2A），大多數(shù)細(xì)胞團(tuán)直徑大小集中在0.1～0.2"mm之間。在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞團(tuán)由多個(gè)等徑球形細(xì)胞緊密結(jié)合而成，細(xì)胞質(zhì)濃厚，內(nèi)含物豐富（圖2B），具備胚性細(xì)胞的典型特征。而通過(guò)體視顯微鏡挑選出特定形態(tài)的胚性愈傷組織采用低密度方式啟動(dòng)的懸浮培養(yǎng)，平均每4"d細(xì)胞生長(zhǎng)量可增加1～2倍。經(jīng)過(guò)4～6次的繼代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定增殖的Ⅱ型胚性懸浮細(xì)胞系（圖2C）。在顯微鏡下觀察，Ⅱ型胚性懸浮細(xì)胞直徑介于1～2"mm之間，具有多個(gè)致密的球形凸起結(jié)構(gòu)（圖2D），細(xì)胞處在有序快速分裂的原球胚階段。

2.3""不同培養(yǎng)物的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)

如表2所示，分別將初代愈傷組織、易碎胚性愈傷組織和2種類(lèi)型的胚性懸浮細(xì)胞在固體體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基M5上培養(yǎng)60"d后，體胚誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)系數(shù)均呈現(xiàn)顯著差異。初代愈傷組織的體胚誘導(dǎo)效果最差（圖3A），體胚誘導(dǎo)率僅有37.5%左右，平均每塊愈傷組織僅誘導(dǎo)出1.2個(gè)體細(xì)胞胚；易碎胚性愈傷組織的體胚誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)系數(shù)均有顯著升高（圖3B），分別是初代愈傷組織的1.7倍和4.3倍；Ⅰ型胚性懸浮細(xì)胞的體胚誘導(dǎo)率雖然比易碎胚性愈傷組織有較明顯的提高，但體胚誘導(dǎo)系數(shù)卻低于后者，原因在于Ⅰ型胚性懸浮細(xì)胞在體胚誘導(dǎo)過(guò)程中存在嚴(yán)重的愈傷化現(xiàn)象（圖3C）；特定形態(tài)的胚性組織通過(guò)低密度懸浮培養(yǎng)得到的Ⅱ型胚性細(xì)胞系體胚誘導(dǎo)率最高（圖3D），達(dá)到100%，且平均每團(tuán)胚性細(xì)胞可誘導(dǎo)出10個(gè)以上的體細(xì)胞胚，體胚誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)系數(shù)分別比Ⅰ型胚性懸浮細(xì)胞提高了1.3倍和2.8倍。

2.4""不同繼代方式對(duì)胚性細(xì)胞增殖和胚性能力維持的影響

Ⅱ型胚性懸浮細(xì)胞系在相同成分的液體培養(yǎng)基中持續(xù)繼代培養(yǎng)2"a后，細(xì)胞團(tuán)增殖效率嚴(yán)重下降，與建立初期細(xì)胞團(tuán)相比有明顯增大趨勢(shì)（圖4A），將其轉(zhuǎn)至體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，僅觀察到類(lèi)似球形胚結(jié)構(gòu)的組織產(chǎn)生，在隨后的發(fā)育過(guò)程中進(jìn)一步膨大褐化（圖4B），最終未能得到正常的體細(xì)胞胚；將Ⅱ型胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)移至去除植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑并添加少量脫落酸（0.1"mg/L）和水解酪蛋白（0.5"g/L）的固體培養(yǎng)基M6中持續(xù)繼代培養(yǎng)2"a后，仍能均質(zhì)快速增殖（圖4C），并且能保持較高的體胚發(fā)生能力（圖4D），此時(shí)的體胚誘導(dǎo)率和體胚誘導(dǎo)系數(shù)分別為60%和3.80（表3），與最初獲得的易碎胚性愈傷組織胚性潛力相當(dāng)，且體胚發(fā)育的同步性明顯有所提升。

3""討論

本研究通過(guò)將熱墾525未成熟花藥外植體接入較高激素含量的培養(yǎng)基中獲得初代愈傷組織，隨即將其轉(zhuǎn)入低激素含量且添加了適量ABA和AgNO3的胚性誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)70～80"d后便可誘導(dǎo)出具有較高體胚發(fā)生能力的易碎胚性愈傷組織。這與LARDER等[10]報(bào)道的獲得易碎胚性愈傷組織的時(shí)間相比有較明顯的縮短，可在一定程度上降低長(zhǎng)期繼代篩選帶來(lái)的細(xì)胞變異風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)這種方式得到易碎胚性愈傷組織可在固體培養(yǎng)基上穩(wěn)定增殖，體胚發(fā)生能力也比初代愈傷組織有大幅度的提高，但其在體胚誘導(dǎo)和發(fā)育過(guò)程中同時(shí)存在胚性愈傷、球形胚、心形胚、魚(yú)雷形胚和子葉胚等不同發(fā)育階段的培養(yǎng)物，不利于后續(xù)體胚苗的同步批量生產(chǎn)。

建立懸浮細(xì)胞系是胚性組織快速增殖且同步化培養(yǎng)的一種重要手段。在橡膠樹(shù)中，目前只有少數(shù)品種有成功建立胚性懸浮細(xì)胞系的報(bào)道，均是采用常規(guī)高密度啟動(dòng)懸浮培養(yǎng)的方式，即不經(jīng)特別篩選直接挑取1～3"g愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并在繼代過(guò)程中使用一定孔徑的濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾篩選得到均質(zhì)懸浮細(xì)胞系[11，"18-19]。本研究通過(guò)常規(guī)和低密度2種懸浮培養(yǎng)方式均建立了均質(zhì)分散的胚性懸浮細(xì)胞系，但二者在大小形態(tài)及體胚發(fā)生能力上存在較大差別。采用常規(guī)方式建立的Ⅰ型胚性細(xì)胞系在顯微鏡下由幾個(gè)到幾十個(gè)大小較一致且內(nèi)含物豐富的細(xì)胞組成，體胚發(fā)生能力明顯高于易碎胚性愈傷組織，但在體胚發(fā)育過(guò)程中存在較嚴(yán)重的愈傷化現(xiàn)象；而通過(guò)在體視顯微鏡下挑選特定形態(tài)的胚性愈傷組織進(jìn)行低密度懸浮培養(yǎng)建立的Ⅱ型胚性懸浮細(xì)胞系，在顯微鏡下觀察具有多個(gè)球形凸起，細(xì)胞處在有序的胚性結(jié)構(gòu)中，可快速誘導(dǎo)出大量發(fā)育較同步的魚(yú)雷形胚和子葉型胚，這將是利用間歇浸沒(méi)式生物反應(yīng)器（RITA）進(jìn)行橡膠樹(shù)體胚苗規(guī)模化繁殖的理想材料。

胚性懸浮細(xì)胞系在建立后隨著繼代次數(shù)的增加胚性逐年下降甚至完全喪失是多數(shù)植物在離體培養(yǎng)過(guò)程中存在的共同問(wèn)題。HERINGER等[20]在通過(guò)間歇浸沒(méi)培養(yǎng)系統(tǒng)提高桃棕（Bactris"gasipaes"Kunth）的體胚發(fā)生效率研究中指出，細(xì)胞總DNA甲基化水平與其體胚發(fā)生能力呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，細(xì)胞長(zhǎng)期暴露在外源激素和液體等滲透和氧化脅迫環(huán)境下會(huì)通過(guò)提高自身甲基化水平來(lái)增加抗脅迫耐受性，從而導(dǎo)致胚性的下降或喪失。在萱草（Hemerocallis）胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)去除培養(yǎng)基中的激素成分，使胚性組織維持在原球胚階段增殖而未進(jìn)一步發(fā)育，再通過(guò)改變pH緩沖培養(yǎng)后在分化培養(yǎng)基上可繼續(xù)體胚發(fā)育[21]；在狼尾草（Pennisetum"purpureum"Schum.）胚性愈傷組織長(zhǎng)期繼代過(guò)程中通過(guò)在培養(yǎng)基中添加低濃度的ABA，可使愈傷組織的胚性得到一定程度的恢復(fù)[22]。本研究通過(guò)分析比較固體和液體2種長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)方式對(duì)細(xì)胞胚性能力維持的影響，進(jìn)一步證實(shí)長(zhǎng)時(shí)間的激素處理和液體環(huán)境是細(xì)胞老化和胚性下降的主要原因，而在繼代培養(yǎng)基中去除激素，適當(dāng)添加有利于胚性恢復(fù)的物質(zhì)，并采用固體培養(yǎng)方式降低繼代頻次可較長(zhǎng)時(shí)間維持細(xì)胞的胚性潛力。通過(guò)這種方法保存的胚性組織可長(zhǎng)期為橡膠樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體培養(yǎng)等研究提供相對(duì)穩(wěn)定且不受季節(jié)限制的優(yōu)質(zhì)材料。

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