摘 要：本試驗通過厭氧培養(yǎng)法從健康雞的新鮮糞便中分離篩選得到1株菌株，從形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗和16S rDNA基因序列分析等方面對菌株進行鑒定，確定該菌株為丁酸梭菌。對其生物學(xué)特性進一步研究，發(fā)現(xiàn)該菌株能夠產(chǎn)生乙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸，對產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等多種腸道致病菌均有一定的抑菌能力。綜上所述，該菌株在生長、抗逆、產(chǎn)酸、抑菌方面表現(xiàn)較好，具有很好的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：丁酸梭菌；分離鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號：S816.7 文獻標(biāo)識碼：B 文章編號：1673-1085（2024）07-0009-09

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）又被稱為丁酸梭狀芽孢桿菌、酪酸梭菌，是一種菌體呈桿狀或彎曲狀、周身被鞭毛包圍的專性厭氧的革蘭氏陽性菌，隸屬芽孢桿菌科（Bacillaceae）、梭菌屬（Clostridium）[1]，廣泛存在于動物消化道、糞便、土壤和各種發(fā)酵產(chǎn)物中[2-3]。

作為革蘭氏陽性菌里特有的腸道益生菌，丁酸梭菌能夠在動物消化道中分泌多種代謝產(chǎn)物，其中最主要的代謝產(chǎn)物丁酸，有助于維持動物腸道上皮細胞的完整性，促進腸上皮組織的發(fā)育[4–6]。此外，丁酸梭菌能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等多種胞外酶以及核黃素、維生素K、B族維生素等，可有效增強腸道上皮細胞的功能，改善營養(yǎng)物質(zhì)利用率，提高有益菌豐度，競爭性抑制有害菌的生長，維持腸道健康[7-8]。丁酸梭菌可形成具有極強耐受性的芽孢，因此對各種環(huán)境的適應(yīng)能力較強[9-10]。

近年來，丁酸梭菌作為飼料添加劑在增強動物免疫功能、促進腸道健康、防治細菌性疾病等方面表現(xiàn)出積極作用，具有廣闊的應(yīng)用前景及開發(fā)潛力[11]。因此，為了進一步篩選優(yōu)良的丁酸梭菌，本研究從健康雞的新鮮糞便中分離出1株丁酸梭菌，通過形態(tài)學(xué)比較、生理生化試驗、系統(tǒng)進化關(guān)系分析確定其物種和親緣關(guān)系，并對菌株的生長、產(chǎn)酸及抑菌能力進行初步分析，為開發(fā)畜禽可用的優(yōu)良丁酸梭菌飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。

1 "材料與方法

1.1 "試驗材料與試劑

采集健康雞的新鮮糞便，加入滅菌離心管中冷藏保存帶回實驗室，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

TSN培養(yǎng)基（用于丁酸梭菌的分離培養(yǎng)）：胰蛋白胨15.0 g、酵母浸粉5.0 g、大豆蛋白胨5.0 g、檸檬酸鐵銨1.0 g、偏重亞硫酸鈉1.0 g、瓊脂20.0 g（制備固體培養(yǎng)基時添加），蒸餾水加至1 000 mL，pH調(diào)至7.6 ± 0.2，121 ℃高壓滅菌15 min。

RCM培養(yǎng)基（用于丁酸梭菌的增菌培養(yǎng)）：蛋白胨10.0 g、牛肉浸粉10.0 g、葡萄糖5.0 g、酵母粉3.0 g、可溶性淀粉1.0 g、氯化鈉5.0 g、醋酸鈉3.0 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、瓊脂20.0 g（制備固體培養(yǎng)基時添加），蒸餾水加至1 000 mL，pH調(diào)至6.8 ± 0.1，121 ℃高壓滅菌15 min。

用于生理生化鑒定的木糖-明膠培養(yǎng)基、可溶性淀粉培養(yǎng)基、硝酸鹽胨水培養(yǎng)基、SIM培養(yǎng)基、蜜二糖細菌微量生化鑒定管、松三糖細菌微量生化鑒定管購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 "丁酸梭菌的篩選及鑒定

1.2.1 "丁酸梭菌的篩選 "稱取樣品3 g，加入裝有100 mL生理鹽水的三角瓶中，振蕩搖勻，靜置10 min。取上清液10 mL加入到90 mL無菌水中，置于80 ℃下水浴加熱10 min，殺死非芽孢菌。將上一步處理過的樣品溶液移入?yún)捬醪僮髋_，用無菌水逐級稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6個梯度，使用移液槍分別吸取100 μL于TSN固體培養(yǎng)基上，涂布均勻。每組設(shè)置3個平行。

待TSN固體培養(yǎng)基凝固后，將平板移入?yún)捬醪僮髋_的恒溫箱內(nèi)，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，期間觀察氧氣指示劑是否變色。當(dāng)菌落形成后，提取單菌落進行顯微鏡鏡檢，觀察菌落的形態(tài)特征。從中挑取符合丁酸梭菌形態(tài)特征的單菌落，采用“三區(qū)劃線法”接種于RCM固體培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)3～5代，得到形態(tài)基本一致的純菌落，命名為D-1，用于后續(xù)菌種鑒定。

1.2.2 "形態(tài)學(xué)鑒定 "在厭氧操作臺內(nèi)，將連續(xù)培養(yǎng)3～5代后的純菌落D-1接種于RCM固體培養(yǎng)基和TSN固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫箱內(nèi)厭氧培養(yǎng)24 h，觀察記錄篩選菌株D-1在兩種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，同時進行革蘭氏染色。

1.2.3 "生理生化鑒定 "參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[12]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]中的細菌鑒定方法，對篩選菌株D-1進行相關(guān)生理生化鑒定，包括明膠液化試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、單糖分解試驗。

1.2.4 "分子生物學(xué)鑒定 "在厭氧操作臺內(nèi)，將篩選菌株D-1按照5%的接種量接種于RCM液體培養(yǎng)基，移入?yún)捬醪僮髋_的恒溫箱中，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)2～3代。按照細菌基因組提取試劑盒（北京天根）說明書步驟提取篩選菌株DNA，然后對其進行16S rDNA PCR擴增。PCR擴增引物采用細菌通用引物組：27F：5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系采用25 μL體系，包含PCR Mixture 21 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)置；94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性20 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性條帶產(chǎn)物送至華大基因進行測序。將測序結(jié)果通過BLAST在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中與已知序列進行比對分析，下載同源度最高的菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析。為了進一步確定篩選菌株D-1的親緣關(guān)系，使用MEGA 11軟件[14]對下載序列和目的序列進行多重序列比對，檢測最佳模型，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹分支可信度采用1 000次自展（Bootstrap）分析。

1.3 "菌株生物學(xué)特性

在厭氧操作臺內(nèi)，將篩選菌株D-1按照5%的接種量接種于RCM液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)24 h。

1.3.1 "生長能力測定 "（1）OD值檢測：培養(yǎng)24 h后，使用紫外分光光度計和pH計測定篩選菌株D-1培養(yǎng)液的生物量OD600值及pH值。每組設(shè)置3個平行。

（2）活菌數(shù)檢測：培養(yǎng)24 h后，使用移液槍吸取1 mL D-1培養(yǎng)液，加入玻璃試管內(nèi)，用無菌水稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6個梯度。然后將不同稀釋度的D-1培養(yǎng)液接種至TSN固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落數(shù)計算樣品中丁酸梭菌活菌數(shù)。每組設(shè)置3個平行。

（3）芽孢率檢測：培養(yǎng)24 h后，使用移液槍吸取1 mL D-1培養(yǎng)液，加入玻璃試管內(nèi)，用無菌水稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6個梯度。然后將玻璃試管放置于水浴鍋中，保持80 ℃水浴加熱10 min后，接種至TSN固體培養(yǎng)基，根據(jù)公式計算芽孢率：

芽孢率=芽孢數(shù)/活菌數(shù)×100%

每組設(shè)置3個平行。

1.3.2 "抗逆能力測定 "（1）耐高溫檢測：培養(yǎng)24 h后，使用移液槍吸取1 mL D-1培養(yǎng)液，加入玻璃試管內(nèi)，用無菌水將稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6個梯度。然后將玻璃試管放置于水浴鍋中，保持85 ℃水浴加熱10 min，分別于加熱前、加熱5 min時和加熱10 min時取樣，接種至TSN固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落數(shù)計算存活率。每組設(shè)置3個平行。

（2）耐酸檢測：培養(yǎng)24 h，使用移液槍按照1%的接種量吸取D-1培養(yǎng)液，接種于pH值分別為1.0、2.0、3.0的 PBS緩沖液內(nèi)，在37 ℃恒溫箱下厭氧培養(yǎng)，分別于0、1、2、3 h時取樣，接種至TSN固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落數(shù)計算存活率。每組設(shè)置3個平行。

1.3.3 "抑菌能力測定 "采用牛津杯法檢測D-1菌株對4種不同腸道致病菌株的抑菌效果。使用移液槍吸取100 μL培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)液，分別注入已接種致病菌株（100 μL）的LB培養(yǎng)基上的牛津杯中，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h，使用量尺測定不同培養(yǎng)基上的抑菌圈直徑（mm）。

1.3.4 "產(chǎn)酸能力測定 "為了保證菌株活力，在厭氧操作臺內(nèi)，將培養(yǎng)24 h后的篩選菌株D-1繼續(xù)按照5%的接種量接種于RCM液體培養(yǎng)基，在37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)2～3代，然后將連續(xù)培養(yǎng)后的培養(yǎng)液以12 000 r/min離心處理10 min，獲得上清液。采用高效液相色譜（HPLC）法測定離心后上清液中的丁酸含量。

色譜條件[15]如下：色譜柱為AgilentPolaris C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為40 ℃，流動相為甲醇和0.1%磷酸，流速為1.0 mL/min，檢測波長為20 nm，進樣量為10 μL，重復(fù)進樣2次。丁酸的保留時間為15.461 min，配置1.25～10.0 g/L正丁酸作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 "結(jié)果與分析

2.1 "篩選菌株的鑒定

2.1.1 "形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 "將篩選菌株D-1分別接種于TSN固體培養(yǎng)基和RCM固體培養(yǎng)基，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，可見篩選菌株在TSN固體培養(yǎng)基上形成的菌落與檸檬酸鐵反應(yīng)生成黑色的硫化鐵（圖1A）；在RCM固體培養(yǎng)基上形成的菌落形狀為圓形，表面濕潤有光澤，顏色為不透明乳白色（圖1B）；革蘭氏染色結(jié)果表明，篩選菌株D-1是革蘭氏陽性菌，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)表現(xiàn)為直桿狀、兩端鈍圓（圖1C）。

2.1.2 "生理生化鑒定結(jié)果 "對篩選菌株D-1進行硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、單糖分解試驗，鑒定結(jié)果如表1。結(jié)果表明，篩選菌株生理生化特征均與丁酸梭菌的特征相符，初步判斷該分離菌為丁酸梭菌。

2.1.3 "分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 "將篩選菌株D-1接種于RCM液體培養(yǎng)基，于37 ℃連續(xù)多代厭氧培養(yǎng)后，得到較高濃度的菌體培養(yǎng)液。將菌體培養(yǎng)液離心后取沉淀，提取16S rDNA進行PCR擴增。將擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳中進行DNA驗證，發(fā)現(xiàn)在1 000～1 500 bp之間出現(xiàn)一條特異性條帶（圖2），與預(yù)期條帶大小相符。

將擴增產(chǎn)物送至華大基因測序，得到篩選菌株D-1的16S rDNA序列。隨后將獲得的基因序列利用BLAST與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中的已有序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)篩選菌株D-1與梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）的丁酸梭狀芽孢桿菌序列相似性最高，為99.85%。為進一步確定篩選菌株的親緣關(guān)系，利用MEGA 11軟件對篩選菌種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），發(fā)現(xiàn)篩選菌株D-1與丁酸梭狀芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近，同時結(jié)合菌株形態(tài)和生理生化試驗可以確定篩選菌株D-1為丁酸梭狀芽孢桿菌，即丁酸梭菌。

2.2 "篩選菌株的生物學(xué)特性

2.2.1 "生長能力測定結(jié)果 "由表2可知，篩選菌株D-1在37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，OD600值為1.820，pH值為4.40，活菌數(shù)為4.3×108 CFU/mL，芽孢數(shù)為3.5×108 CFU/mL，芽孢率為81.4%。

2.2.2 "抗逆能力測定結(jié)果 "由圖4可知，篩選菌株D-1在85 ℃處理5 min時存活率在95%以上，在85 ℃處理10 min時存活率在80%以上。

由圖5可知，當(dāng)篩選菌株D-1在pH值為3.0的酸性環(huán)境下培養(yǎng)3 h時，其存活率為85%以上；在pH值為2.0的高酸性環(huán)境下培養(yǎng)3 h時，其存活率為75%以上；在pH值為1.0的強酸性環(huán)境下培養(yǎng)3 h時，其存活率為60%以上。

2.2.3 "抑菌能力測定結(jié)果 "由表3可知，篩選菌株D-1對4種腸道致病菌株的抑菌圈直徑在11～14 mm之間，表明篩選菌株對這4種腸道致病菌株均有一定的抑菌效果。

2.2.4 "產(chǎn)酸能力測定結(jié)果 "由圖6和圖7可知，篩選菌株D-1在接種后的0～4 h內(nèi)，為菌株生長遲滯期，菌株生長速度緩慢，具體表現(xiàn)為菌液OD600值和pH值緩慢增長；4 h后菌株D-1進入對數(shù)生長期，此階段菌株生長速度很快，細菌開始大量繁殖，具體表現(xiàn)為菌液OD600值和pH值迅速升高；12 h后菌株D-1進入穩(wěn)定生長期，此階段菌株生長速度趨于穩(wěn)定，菌株數(shù)目基本保持不變，最終菌液OD600值穩(wěn)定在1.8左右，pH值穩(wěn)定在4.4左右。同時，篩選菌株D-1也會隨著菌株生長而不斷產(chǎn)生丁酸，丁酸產(chǎn)量與菌株數(shù)目呈正相關(guān)，最終穩(wěn)定在2.0 g/L左右。結(jié)果表明，篩選菌株D-1會在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物丁酸，從而導(dǎo)致細菌培養(yǎng)液pH降低。

3 "討論

3.1 "丁酸梭菌的篩選鑒定

丁酸梭菌是動物腸道微生態(tài)菌群的重要組成菌株之一，在促進動物生長發(fā)育、增強機體免疫力、抑制病原微生物繁殖等方面具有重要作用[4–10]。由于同源動物糞便內(nèi)的益生菌能夠作用于同源動物本身，相比其他來源的益生菌具有更高的益生價值[16]。因此，醫(yī)學(xué)上將健康動物的糞便菌群移植到腸道菌群失調(diào)的同源動物體內(nèi)，使后者腸道菌群恢復(fù)穩(wěn)態(tài)，從而達到治療腸道疾病的目的，這個轉(zhuǎn)移糞便細菌的方法叫做“糞菌移植”[17]。因此，從健康動物糞便中分離篩選益生菌作為同源動物的菌種來源，對于開發(fā)相應(yīng)的飼料添加劑產(chǎn)品具有重要意義。

本研究從健康雞的新鮮糞便中分離出1株在形態(tài)上符合丁酸梭菌特征的菌株D-1，并進一步通過細菌形態(tài)學(xué)觀察和生理生化分析對該菌株進行鑒定。但是，由于細菌種類繁多，傳統(tǒng)的細菌鑒定方法僅能通過形態(tài)和特性進行初步鑒定，無法準(zhǔn)確地鑒定出細菌的種屬[18]。近年來，隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，16S rDNA技術(shù)已經(jīng)能夠深入分析細菌的遺傳特征，從而揭示細菌間親緣關(guān)系的遠近，最終實現(xiàn)細菌的準(zhǔn)確種屬鑒定[19]。因此，本研究在細菌形態(tài)學(xué)觀察和生理生化分析的基礎(chǔ)上，通過16S rDNA序列分析技術(shù)鑒定，最終確定篩選菌株D-1為丁酸梭狀芽孢桿菌，即丁酸梭菌。

3.2 "抗逆能力分析

目前，丁酸梭菌作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中。研究表明，飼料中添加丁酸能夠提高機體免疫力，改善腸道形態(tài)和結(jié)構(gòu)，抑制炎癥反應(yīng)[20–23]。但是，丁酸梭菌在工廠化制備成為飼料添加劑的過程中需要經(jīng)過高溫、高壓的制粒過程；進入動物體內(nèi)后，丁酸梭菌需先經(jīng)過胃才會進入腸道發(fā)揮益生功能。這就要求丁酸梭菌微生態(tài)制劑不僅能耐受生產(chǎn)中的高溫、高壓，還能耐受胃的酸性環(huán)境[24]。本研究篩選得到的丁酸梭菌D-1在85 ℃的高溫處理10 min時存活率在80%以上，在pH值為1.0的強酸處理3 h時存活率在60%以上，表明D-1既能承受飼料制作過程中的高溫高壓，也能順利通過胃進入腸道發(fā)揮益生功能，有作為飼料添加劑的潛力。

此外，丁酸梭菌在使用過程中主要以活菌制劑狀態(tài)存在，而丁酸梭菌的芽孢具有更強的環(huán)境耐受力，因此提高丁酸梭菌的芽孢生成率也是保證丁酸梭菌微生態(tài)制劑發(fā)揮作用的有效方法。本研究篩選得到的丁酸梭菌的生孢率為81.4%，可為后續(xù)提高丁酸梭菌在發(fā)酵過程中的菌體濃度以及芽孢生成率提供參考。

3.3 "益生能力分析

研究表明，丁酸梭菌的代謝產(chǎn)物中含有大量丁酸、乳酸等酸性物質(zhì)，能夠在腸道內(nèi)制造局部酸性環(huán)境，促進雙歧桿菌和乳桿菌等腸道益生菌增殖，抑制有害菌生長[25]。有研究表明，丁酸梭菌能夠產(chǎn)生的細菌素、抗菌肽等物質(zhì)，進一步抑制有害菌繁殖，維持腸道生態(tài)平衡[26]。本研究中的產(chǎn)酸試驗表明，D-1的丁酸產(chǎn)量可達2.0 g/L，進一步驗證其為丁酸梭菌。

此外，本研究分別采用牛津杯法和活菌計數(shù)法驗證D-1的抑菌活性，結(jié)果表明D-1對包括大腸桿菌和沙門氏菌在內(nèi)的多種腸道致病菌株均具有抑制作用。Yang等[27]發(fā)現(xiàn)飼喂丁酸梭菌的嶺南黃肉雞盲腸中的腸道致病菌數(shù)量明顯降低，而乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌的數(shù)量則明顯增加；賈麗楠等[28]同樣發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌能夠?qū)θ庾须u腸道致病菌產(chǎn)生抑制作用。這些試驗結(jié)果與D-1的抑菌試驗結(jié)果相對應(yīng)，表明D-1具有一定的益生作用。但是，能夠引起動物腸道發(fā)生疾病的細菌還有很多，對于該篩選菌株能否抑制其他腸道病原菌的生長還有待進一步研究。

4 "結(jié)論

本研究從健康雞的新鮮糞便中分離得到1株在形態(tài)學(xué)上與丁酸梭菌相似的菌株D-1，經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定確定為丁酸梭菌。生物學(xué)特性研究表明，該菌株具有較好的生長、抗逆、產(chǎn)酸及抑菌能力，有作為飼料添加劑的潛力。

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22-25.

Isolation， Identification and Biological Characteristics of

Clostridium butyricum

ZHAI Kaixuan1 ， LI Jinxiang1， LENG Dunpeng1， ZANG Xueyun1， YU Pengbo2，

MIAO Yue1， QI Huidong1

（1. Qingdao Zhong Ren Animal Pharmaceutical， Co.， Ltd.，Qingdao "266300， China;

2. Mishan Animal Husbandry and Veterinary Workstation， Weihai "264200， China）

Abstract： "In this experiment， a strain was isolated from the fresh feces of healthy chickens by anaerobic culture， and identified as Clostridium butyricum by morphological observation， physiological and biochemical test and 16S rDNA gene sequence analysis. Further study on its biological characteristics showed that the strain could produce volatile fatty acids such as acetic acid and butyric acid， it has certain bacteriostatic activity against a wide range of intestinal pathogens， including Clostridium perfringens， Staphylococcus aureus， Salmonella and Escherichia coli. In summary， the screened strain had good performance in the growth， stress resistance， acid production， antibacterial performance is good， which has good application values.

Keywords：Clostridium butyricum; Isolation and identification; Biological characteristics