收稿日期:2023-12-20
基金項目:重慶市技術創(chuàng)新與應用發(fā)展專項重點項目(cstc2020jscx-tpyzxX0007);重慶市教委重點項目(KJZD-K202201207);重慶市研究生科研創(chuàng)新項目(CYS23733)
作者簡介:尹福強(1977-),男,四川廣安人,博士,副教授,研究方向為植物真菌病害與防治。(E-mail)20200002@sanxiau.edu.cn。宋珍為共同第一作者。
通訊作者:劉 銘,(E-mail)liuming780906@163.com
摘要: 為全面了解多花黃精灰霉病病原菌杜威葡萄孢(Botrytis deweyae)特性,并有效防治由該病原菌引起的病害,本研究對Botrytis deweyae的生物學特性進行分析,并通過室內毒力測定,篩選出有效的化學殺菌劑與生物殺菌劑。結果表明,最適宜Botrytis deweyae菌絲生長的環(huán)境條件是24 h光照,25 ℃恒溫培養(yǎng),最適宜Botrytis deweyae菌絲生長的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),pH值6.0~7.0,以葡萄糖為碳源,以牛肉膏為氮源。8種化學殺菌劑中,抑菌效果最好的是500 g/L異菌脲懸浮劑和25% 抑霉唑·咯菌腈懸浮劑,半最大效應濃度(EC50)分別為0.076 μg/mL和0.094 μg/mL。7種生物殺菌劑中,0.3%四霉素水劑抑菌效果最好,EC50為0.418 μg/mL。本研究結果為Botrytis deweyae引起的多花黃精灰霉病的有效防控提供了科學依據。
關鍵詞: 多花黃精;灰霉病;杜威葡萄孢(Botrytis deweyae);生物學特性
中圖分類號: S435.672"" 文獻標識碼: A"" 文章編號: 1000-4440(2024)10-1818-08
Biological characteristics and fungicides screening of Botrytis deweyae causing gray mold of Polygonatum cyrtonema Hua
YIN Fuqiang1,2, SONG Zhen1, XU Qin1, JIANG Jiamin1, YUAN Yue1, GUO Tiantian1, XIAO Zhien1,ZHANG Feng1, MA Wanli1, LIU Ming1,2
(1.College of Biology and Food Engineering, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404120, China;2.Green Planting and Deep Processing of Genuine Medicinal Materials in Three Gorges Reservoir Area, Chongqing Engineering Laboratory, Chongqing 404120, China)
Abstract: In order to understand the characteristics of Botrytis deweyae causing gray mold of Polygonatum cyrtonema Hua and effectively control the disease caused by Botrytis deweyae, the biological characteristics of Botrytis deweyae were analyzed, and the effective chemical and biological fungicides were screened out by indoor taxicity determination. The results showed that the optimum conditions for mycelial growth of Botrytis deweyae were 24 h light, 25 ℃ constant temperature, potato dextrose agar (PDA) medium, pH 6.0-7.0, glucose as carbon source and beef extract as nitrogen source. Among the eight chemical fungicides, 500 g/L iprodione suspension agent and 25% imazalil-fludioxonil suspension agent were the most effective, with median effective concentration (EC50) of 0.076 μg/mL and 0.094 μg/mL, respectively. Among the seven biocides, 0.3% tetramycin aqueous solution had the best bacteriostatic effect, with EC50 of 0.418 μg/mL. The results of this study can provide a scientific basis for the effective prevention and control of Polygonatum cyrtonema Hua gray mold caused by Botrytis deweyae.
Key words: Polygonatum cyrtonema Hua;gray mold;Botrytis deweyae;biological characteristics
多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)為天門冬科(Asparagaceae)黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物,被《中國藥典》收錄[1],具有養(yǎng)陰補氣、健脾潤肺的功效,是集食用、藥用和觀賞于一體的重要經濟作物[2],被廣泛種植在重慶、四川、云南和湖南等地。
多花黃精生產周期達3~4年,病原菌積累量大,易于發(fā)生病害。近年來,隨著種植面積不斷擴大,田間管理相對粗放,病害發(fā)生愈加嚴重,已報道的病害有多花黃精炭疽病[3-4]、根腐病[5-6]、葉斑病[7]和灰霉病[8]等,給多花黃精產業(yè)帶來了重大損失?;颐共∈且环N常見的真菌性病害,傳播范圍廣,侵染能力強,對多花黃精造成嚴重危害,浙江貝母灰霉病高發(fā)年份病株率達82%以上,造成10%~30%的經濟損失[9],四川華重樓因灰霉病年產量損失可達65%,給當地中藥材種植戶帶來巨大損失[10]。灰霉病主要由葡萄孢屬(Botrytis)病原菌引起,迄今該屬已收錄約20個種[11],引起黃精灰霉病的病原菌已鑒定出的有灰葡萄孢(Botrytis cinerea)[8]和杜威葡萄孢(Botrytis deweyae)[12],其中杜威葡萄孢是在黃精上首次發(fā)現并報道。Botrytis deweyae最早由Frances M Dewey在栽培黃花菜(Hemerocallis hybrids)上首次發(fā)現并命名[13],其生物學特性和防治藥劑的篩選還未見報道。為更全面了解Botrytis deweyae特性,并有效防治由該病原菌引起的病害,本研究擬對杜威葡萄孢的生物學特性進行初步分析,并通過室內毒力測定,篩選出有效的化學殺菌劑與生物殺菌劑,為多花黃精灰霉病的綜合防治提供依據。
1 材料與方法
1.1 供試菌株與培養(yǎng)基
1.1.1 供試菌株 多花黃精灰霉病的病原菌杜威葡萄孢菌(Botrytis deweyae)由重慶三峽學院生物與食品工程學院植物保護研究室提供。
1.1.2 供試培養(yǎng)基 培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Potato dextrose agar,PDA)、玉米瓊脂培養(yǎng)基(Corn meal agar,CMA)、胡蘿卜培養(yǎng)基(Carrot agar,CA)、查氏培養(yǎng)基(Czapek)、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(Potato sucrose agar,PSA)、燕麥培養(yǎng)基(Oatmealagar,OA)、水培養(yǎng)基(Water agar,WA)和綠豆培養(yǎng)基(Bean agar,BA)。
1.2 菌株生物學特性
1.2.1 培養(yǎng)基對菌株生長的影響 用5 mm無菌打孔器從菌落邊緣取菌餅分別接種至PDA、CMA、CA、Czapek、PSA、OA、WA和BA平板培養(yǎng)基中央,25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,觀察Botrytis deweyae的生長狀況并采用十字交叉法[14]測量菌落直徑,每處理重復3次[15-16]。
1.2.2 溫度對菌株生長的影響 分別在5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5 d,觀察Botrytis deweyae的生長狀況,菌落直徑測量方法同方法1.2.1。
1.2.3 pH值對菌株生長的影響 用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液分別調整培養(yǎng)基pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0,共8個處理,25 ℃培養(yǎng)5 d,觀察Botrytis deweyae的生長狀況,菌落直徑測量方法同方法1.2.1。
1.2.4 光照對菌株生長的影響 分別在在24 h光照、12 h光照/12 h黑暗、24 h黑暗條件下25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,觀察Botrytis deweyae的生長狀況,菌落直徑測量方法同方法1.2.1。
1.2.5 碳源對菌株生長的影響 以含蔗糖的查氏培養(yǎng)基為對照(CK),分別用含等質量碳元素的葡萄糖、甘露醇、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油和乳糖作為碳源替換蔗糖。每個培養(yǎng)皿中定量20 mL培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后,將菌餅分別接至含不同碳源的培養(yǎng)基上,25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,采用十字交叉法測量菌落直徑,每處理重復3次[17-18]。
1.2.6 氮源對菌株生長的影響 以含硝酸鈉的查氏培養(yǎng)基為對照(CK),分別用含等量氮元素的甘氨酸、牛肉膏、苯丙氨酸、氯化銨、硝酸鉀、蛋白胨和尿素作為氮源替換硝酸鈉。觀察Botrytis deweyae的生長狀況,菌落直徑測量方法同方法1.2.5。
1.3 藥劑室內毒力測定
采用菌絲生長速率法[19]測定多花黃精杜威葡萄孢菌菌絲生長速率。在無菌條件下,將 8種化學殺菌劑和 7種生物殺菌劑按表1配制成6個梯度的質量濃度,以加無菌水的PDA平板作為對照,在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d,觀察抑菌效果,菌落直徑測量方法同方法1.2.1。
抑菌率=(對照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%
1.4 數據分析
利用SPSS 26.0軟件計算毒力回歸方程、半最大效應濃度(EC50)和相關系數(R2),并使用SPSS 26.0軟件對測定數據進行分析,圖、表利用Origin 2022 繪制。
2 結果與分析
2.1 多花黃精灰霉病癥狀及病原菌形態(tài)
Botrytis deweyae主要危害多花黃精葉片和莖尖,侵染初期葉片和莖尖出現不規(guī)則的水浸狀病斑,濕度較大時產生霉狀物。后期病斑連成一片,葉片逐漸變薄,葉片邊緣變透明。Botrytis deweyae在生長初期出現白色菌絲,3 d后轉為灰色,7 d后產生菌核,菌核近球形。單個Botrytis deweyae分生孢子梗及分生孢子呈葡萄穗狀,單個分生孢子呈卵圓形或橢圓形(圖1)。
2.2 多花黃精杜威葡萄孢菌生物學特性
2.2.1 培養(yǎng)基對菌株生長的影響 圖2顯示,Botrytis deweyae在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、玉米瓊脂培養(yǎng)基(CMA)、胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)、查氏培養(yǎng)基(Czapek)、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)、燕麥培養(yǎng)基(OA)、水培養(yǎng)基(WA)和綠豆培養(yǎng)基(BA)上均能生長,但生長速度差異顯著,在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長速度最快,培養(yǎng)5 d后菌落直徑達87.4 mm(圖2A)。菌絲生長速度由高到低的培養(yǎng)基依次為PDA、PSA、CA、OA、CMA、Czapek、BA、WA??梢?,PDA培養(yǎng)基更適宜Botrytis deweyae菌絲生長。
2.2.2 溫度對菌株生長的影響 隨著溫度升高,菌絲生長速度加快,當溫度達到25 ℃時,生長最快,培養(yǎng)5 d后菌落直徑達到87.4 mm;當溫度達到30 ℃,菌絲生長速度減慢,當溫度為35 ℃時菌絲幾乎停止生長(圖2B)。5 ℃培養(yǎng)的菌落直徑和與30 ℃培養(yǎng)的菌落直徑無顯著差異。可知,Botrytis deweyae菌絲最適生長溫度為25 ℃。
2.2.3 pH對菌株生長的影響 Botrytis deweyae在pH值5.0~12.0均能生長,菌落直徑為65.6~85.2 mm。pH值為5.0時,菌絲生長速度最慢,菌落直徑僅65.6 mm。pH值6.0和pH值7.0時菌絲生長最快,菌落直徑分別為85.2 mm和83.0 mm??梢?,pH值6.0~7.0最適于Botrytis deweyae生長(圖2C)。
2.2.4 光照對菌株生長的影響 不同光照條件下,菌絲均能生長,但菌落直徑差異顯著。24 h光照條件下,Botrytis deweyae菌絲生長最快,培養(yǎng)5 d后菌落直徑達75.5 mm。12 h光照/12 h黑暗交替、24 h黑暗條件,菌絲生長速率較慢,菌落直徑分別為63.4 mm和65.5 mm??梢?,24 h光照條件更適于Botrytis deweyae生長(圖2D)。
2.2.5 碳源對菌株生長的影響 最適宜Botrytis deweyae生長的碳源是葡萄糖,在葡萄糖作為碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d,Botrytis deweyae菌落直徑可達73.0 mm,是可溶性淀粉作為碳源培養(yǎng)基中菌落直徑的2倍。較為適宜Botrytis deweyae生長的碳源是麥芽糖和乳糖,菌落直徑分別為66.7 mm和68.5 mm。而Botrytis deweyae對甘露醇、查氏碳、果糖、甘油和可溶性淀粉利用效果較差,菌落直徑為34.4~53.8 mm。綜上,葡萄糖最有利于Botrytis deweyae生長(圖2E)。
2.2.6 氮源對菌株生長的影響 在不同氮源中,Botrytis deweyae對牛肉膏的利用效果最好,培養(yǎng)5 d后,牛肉膏作為氮源的培養(yǎng)基中菌落直徑達81.1 mm;其次是蛋白胨,培養(yǎng)5 d后,蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基中菌落直徑為60.8 mm。Botrytis deweyae對查氏氮、苯丙氨酸、硝酸鉀、氯化銨和甘氨酸利用效果差,菌落直徑為31.9~52.3 mm。在尿素作為氮源的培養(yǎng)基中,菌絲幾乎不生長??梢?,牛肉膏最有利于Botrytis deweyae生長,而尿素可抑制Botrytis deweyae生長(圖2F)。
2.3 殺菌劑對多花黃精杜威葡萄菌的室內毒力
2.3.1 化學殺菌劑對多花黃精杜威葡萄孢菌的抑菌作用 8種化學殺菌劑對Botrytis deweyae的菌絲生長均有抑制作用(圖3),其中抑菌效果好的是500 g/L異菌脲懸浮劑和25%抑霉唑·咯菌腈懸浮劑,EC50分別為0.076 μg/mL和0.094 μg/mL。其次是400 g/L氟硅唑乳油、50% 啶酰菌胺水分散粒劑、50%腐霉利可濕性粉劑和65%甲硫·乙霉威可濕性粉劑,EC50為0.236~7.780 μg/mL。25%嘧菌酯懸浮劑和80%嘧霉胺水分散粒劑抑菌效果最差,EC50分別為114.550 μg/mL和30.620 μg/mL(表2)。
2.3.2 生物殺菌劑對多花黃精杜威葡萄孢菌的抑菌作用 7種生物殺菌劑對Botrytis deweyae的菌絲生長均有抑制作用(圖4),其中抑菌能力最強的是0.3%四霉素水劑,EC50為0.418 μg/mL。其次是6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑、3%中生菌素可濕性粉劑、1%申嗪霉素懸浮劑和6%春雷霉素可濕性粉劑,EC50為1.242~37.497 μg/mL。10%多抗霉素可濕性粉劑和8%寧南霉素水劑抑菌效果最差,EC50分別為470.977 μg/mL和207.970 μg/mL(表3)。
3 討論
目前,國內外尚無有關Botrytis deweyae生物學特性與防治藥劑篩選的報道。本研究發(fā)現,適宜Botrytis deweyae菌絲生長的環(huán)境為24 h全光照、培養(yǎng)溫度25 ℃,適宜Botrytis deweyae菌絲生長的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基,pH 6.0~7.0,并以葡萄糖為碳源,以牛肉膏為氮源。藥劑室內毒力測定結果表明,化學殺菌劑500 g/L異菌脲懸浮劑和25%抑霉唑·咯菌腈懸浮劑,生物殺菌劑0.3%四霉素水劑對Botrytis deweyae抑菌效果較好,可作為防治多花黃精灰霉病的殺菌劑。
葡萄孢屬(Botrytis)不同種之間的生物學特性不完全相同?;移咸焰撸˙otrytis cinerea)菌絲生長的最適培養(yǎng)條件為20 ℃溫度,光暗交替(12 h光照/12 h黑暗),最適培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基,pH值5.0~6.0,以可溶性淀粉和蔗糖為碳源,以牛肉膏和硫酸銨為氮源[20]。蔥鱗葡萄孢(Botrytis squamosa)最適培養(yǎng)條件為25 ℃溫度,pH值6.0,光暗交替,以葡萄糖為碳源,以牛肉膏為氮源[21]。Botrytis deweyae最適生長pH值較Botrytis cinerea和Botrytis squamosa高,對光照的需求更明顯;Botrytis deweyae最適生長溫度和碳、氮源與Botrytis cinerea 不同,與Botrytis squamosa一致。明確病原菌生物學特性,有助于了解病原菌引起的流行病害的發(fā)生特征,并在此基礎上有效防控病害。Botrytis deweyae不耐高溫,30 ℃時生長緩慢,35 ℃時停止生長。4~5月環(huán)境溫度有利于Botrytis deweyae病原菌生長,多花黃精灰霉病發(fā)生較重;6~9月高溫,Botrytis deweyae病原菌生長受到抑制,多花黃精灰霉病發(fā)生較輕。生產中,在多花黃精出苗后應做好灰霉病的監(jiān)測與防控工作,及時清除雜草和植株病殘體,減少田間病原菌的積累,從而降低多花黃精灰霉病的發(fā)病率。
異菌脲是一種廣譜觸殺型殺菌劑,以觸殺作用和保護作用為主,也具有一定的治療作用[22],對葡萄孢屬(Botrytis)、鏈孢霉屬(Neurospora)、核盤菌屬(Sclerotinia)真菌有較好的抑制效果[23],廣泛應用于甜瓜、葡萄和蘋果樹等作物或果樹灰霉病防治[24]。抑霉唑·咯菌腈為復配藥劑,其中抑霉唑是一種內吸性殺菌劑,破壞霉菌的細胞膜并抑制霉菌孢子的形成,適用于植物真菌病害的防治,在番茄[25]和草莓[26]等作物灰霉病防治上使用廣泛;咯菌腈是一種新型殺菌劑,抑制孢子萌發(fā)的同時能夠抑制菌絲體的生長,可用于防治由子囊菌等真菌引起的植物病害[27]。由于長期使用化學殺菌劑容易引發(fā)病原菌的抗藥性,往往會通過加大藥劑用量來達到殺菌效果,而過度使用化學藥劑會造成藥劑殘留,為解決這一問題,可以將幾種化學殺菌劑復合調配來降低病原菌的抗性,從而減少殺菌劑的用量。抑霉唑與咯菌腈復配可增強抑菌效果,擴大防治范圍,避免病原菌產生抗性。異菌脲與抑霉唑·咯菌腈降解快,安全性高,在推薦劑量和1.5倍推薦劑量下,異菌脲在番茄中的殘留量都低于國家規(guī)定的最大殘留限量[28];0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL抑霉唑分別浸果2 min后,抑霉唑在柑橘全果中的殘留量均低于國家規(guī)定的最大殘留限量(MRL)[29];防治黃瓜灰霉病的咯菌腈在黃瓜中的殘留量為0.01 mg/kg,符合殘留檢測標準,咯菌腈與腐霉利混用對黃瓜灰霉病病原菌灰葡萄孢具有顯著的抑制作用,且混合藥劑在黃瓜中的殘留量要明顯少于單獨使用的咯菌腈或者腐霉利,在土壤中的降解速率明顯高于單獨使用咯菌腈或者腐霉利[30]。因此在生產上可選用0.3 μg/mL異菌脲和1.04 μg/mL抑霉唑·咯菌腈防治Botrytis deweyae引起的多花黃精灰霉病。
使用化學農藥防治藥用植物病害,易造成中藥材中農藥殘留、病原菌抗藥性及環(huán)境污染等問題。相比之下,生物農藥具有安全無毒的優(yōu)勢,積極開發(fā)生物農藥是控制灰霉病的有效途徑。四霉素是一種高效低毒的防治真菌病害的生物殺菌劑[31],不僅具有較強的抑菌作用,還能增強作物的抗病性,被廣泛用于草莓[32]和葡萄[33]等作物或果樹灰霉病防治,1.3 μg/mL四霉素對灰霉病病原菌具有顯著的抑菌效果,是防治Botrytis deweyae的理想生物農藥。
4 結論
隨著多花黃精灰霉病的發(fā)生愈加嚴重,篩選出合適的防治藥劑迫在眉睫,本研究篩選得到的2種化學殺菌劑(500 g/L異菌脲懸浮劑和25% 抑霉唑·咯菌腈懸浮劑)和1種生物殺菌劑(0.3% 四霉素水劑)對Botrytis deweyae具有較強的抑菌作用,本研究結果為Botrytis deweyae引起的多花黃精灰霉病的防控提供了科學依據。
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(責任編輯:成紓寒)