關鍵詞：洗碗機，微生物，高通量測序技術，多樣性

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.013.043

0引言

隨著經濟發(fā)展，人民生活水平的提高，國內洗碗機市場需求明顯增長。洗碗機作為方便居民生活的新興家用電器，具有清潔高效、節(jié)能、省時等優(yōu)點，可滿足消費者對健康生活及享受閑暇時的需求，更加適應現代家庭快節(jié)奏的生活，已成為現代化家庭廚房設計的標配。但在洗碗機長期使用過程中，其潮濕的內環(huán)境和密閉的空間，容易發(fā)生餐具和內部件的微生物滋生現象。

目前，國際上已陸續(xù)開展了家用洗碗機內部環(huán)境微生物群落結構、特征微生物菌株分離及作用機制研究。Nina等[1]于2011年在歐洲、美洲、非洲等地共采集獲得189個洗碗機樣本，通過平板培養(yǎng)法從62%的樣本中分離獲得了曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Ca nd ida）、Ma g nusiomyce s 、鐮刀菌屬（F u s a r i u m）等微生物，研究發(fā)現皮炎外瓶霉（Exophia la der matitidis）和類磚型外瓶霉（Exophiala phaeomuriformis）是洗碗機中的優(yōu)勢菌種；于2015年在土耳其收集了937件洗碗機樣品，并從24.5%的樣品中檢出外屏霉屬（Exophiala）、假絲酵母屬（Candida）、紅酵母屬（Rhodotorula）、Magnusiomyces等微生物[2]；于2019年在斯洛文尼亞采集30臺洗碗機樣品，分離獲得632株細菌，從80%的樣品中均分離獲得蠟樣芽胞桿菌（Bacilluscereus），對洗碗機橡膠密封條進行細菌多樣性分析，發(fā)現放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）為主要優(yōu)勢微生物[3]。Brands等[4]人研究發(fā)現洗碗機的內壁表面含菌量少，存儲過程中腸桿菌科微生物有明顯增加。綜上所述，已有大量國際研究證明了家用洗碗機中存在部分潛在風險微生物，因此開展洗碗機內環(huán)境微生物多樣性及菌種特性研究對于相關風險規(guī)避和產品質量升級具有重要意義。

我國目前已經發(fā)布了多個洗碗機相關的安全性能、除菌、抗菌等評價標準[5-8]，但關于洗碗機使用過程微生物多樣性分析尚缺乏數據支持。本研究旨在研究我國洗碗機微生物群落結構，通過高通量測序技術和微生物培養(yǎng)技術，系統(tǒng)解析冬季中國不同城市家用洗碗機中微生物多樣性，深度挖掘洗碗機中極端耐受類、致污類、致病類等特征性微生物資源，為洗碗機抗菌抑菌試驗的開展、關鍵特征微生物作用機制的研究以及抗菌材料的開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

2021年12月至2022年1月，依據地理位置以及不同地域飲食習慣差異，選取北京、青島、佛山3個城市共9臺洗碗機（每臺洗碗機的使用頻率≥3次/周）作為研究對象，每臺洗碗機設置3個采樣位點（包括門封圈、出水口和提杯），共入戶采集到27個樣品，詳細信息見表1。

1.2 試劑與儀器

麥芽提取粉瓊脂（MEA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、R2A瓊脂培養(yǎng)基、強化梭菌培養(yǎng)基（RCM）（北京陸橋技術股份有限公司），氯硝胺甘油瓊脂培養(yǎng)基（DG18）（青島海博生物技術有限公司），0.85%生理鹽水（北京陸橋技術股份有限公司），丙三醇（國藥集團化學試劑有限公司），QIAamp Fast DNAStool Mini Kit（德國QIAGEN公司），真菌DNA提取試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司），磁磁珠組織DNA提取試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司），PCRMasterMix、DL 2000 Marker（北京全式金生物技術有限公司），PCR引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

生物安全柜（ESCO AC2-6S1 CLASS II TYPEA 2），隔水式培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司），微量可調移液器（德國Eppendor f公司），洗碗機（美的集團股份有限公司），電子天平（常熟市佳衡天平儀器有限公司），高速冷凍離心機（德國 Eppendorf 公司），生物樣品均質器（奧然科技（北京）有限公司），PCR儀（ABI），微量核酸蛋白分析儀（英國Biochrom有限公司），凝膠成像儀（BIO-RAD Gel DoCqM EZ），高壓滅菌鍋（日本HIR AYAMA），電泳儀（美國BIO-R AD EC250 -90）。

1.3 可培養(yǎng)分析方法

1.3.1 可培養(yǎng)微生物的分離純化

將洗碗機樣品原液以10倍梯度逐級稀釋，制得1：10的樣品菌懸液。分別吸取樣品原液和稀釋后的菌懸液100 μL涂布于固體培養(yǎng)基上，每組兩個平行，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10天，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件詳見表2。每天觀察不同條件下的菌落特征（包括大小、形狀、顏色、質地、有無滲透液、有無可溶性色素等），選取不同形態(tài)的單菌落進行平板劃線，純化得到菌株保存于甘油管。記錄不同菌株的菌落特征和數量。

1.3.2 可培養(yǎng)微生物的菌種鑒定

選取的單菌落通過平板劃線法進行純化，在適宜的培養(yǎng)條件下通過兩次分離純化獲得純菌種，并通過MALDI-TOF MS進行初步鑒定，通過甲酸萃取法制備檢測樣品，挑取培養(yǎng)基上的單菌落，混勻于300 μL ddH2O中，加900 μL無水乙醇充分振蕩，離心去除上清液，晾干后，用50 μL 70%甲醇重懸細胞，加50 μL乙腈反復吹打，將樣品混合均勻；按照MALDI-TOF MS 檢測規(guī)程進行鑒定分析，確定菌株的分類學地位。

對于MALDI-TOF MS無鑒定結果的菌株，提取細菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用細菌16 S rR NA基因通用引物27 F和149 2R 進行PCR 擴增，反應條件參數如下：94℃，5 min，1cycle；94℃、1 min，55℃、1 min，72℃、1.5 min，30cycles；72℃，10 min，1 cycle。將PCR產物在上海生工生物進行16S rRNA基因測序。將16S rRNA測序結果通過EzBio Cloud服務器（www.ezbiocloud.net/identify）進行相似性搜索，與已發(fā)表的有效模式菌株進行比較，確定菌株的分類學地位。對于真菌菌株，提取真菌菌株的基因組DNA，分別采用（I T SrDNA）、核糖體rDNA大亞基（26S D1 / D2）等分子標記引物對絲狀真菌和酵母菌的核酸序列進行PCR擴增。PCR反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共27個循環(huán)；72℃ 10 min。得到的PCR產物送至生工生物進行測序。根據測序結果，用菌株的26S rDNA和ITS基因作為靶序列，在GenBank數據庫中用BLAST程序搜索同源序列，挑選與靶序列最相近的參考菌株系列進行比較，獲得菌株的分類學地位。

1.4 樣品宏基因組提取和高通量測序

利用Q I A a m p D N A提取試劑盒，提取洗碗機樣品種的宏基因組D N A。以質檢合格的宏基因組D N A為模板進行P C R擴增，利用通用引物33 8F（5'-AC T C C TACG G GAG G C AG C A-3'）和8 0 6R（5'-G GACTACH VG G GTWTCTA A T-3'）擴增16 S r R NA 基因V3 -V4區(qū)；利用引物I T S1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGT TCT TCATCGATGC-3'）擴增ITSrDNA區(qū)。PCR擴增體系：5×FastPfu 緩沖液8 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L，上、下游引物各2 μL，FastPfu 酶1 μL，DNA 30 ng，ddH2O補足至40 μL。PCR 反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共27個循環(huán)；72℃ 10 min。使用Agencourt AMPure XP磁珠對PCR擴增產物進行純化并溶于洗脫緩沖液中，完成文庫的構建。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對構建文庫的片段范圍及濃度進行檢測，檢測合格的文庫利用HiSeq 2500平臺進行擴增子測序。

1.5 數據分析

數據分析主要包括測序數據過濾、Tag拼接、OTU聚類、物種注釋和物種復雜度分析等流程。利用QIIME 2的DADA2方法對下機數據進行質控，去除低質量序列、嵌合體并得到Clean Data。使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11），利用重疊關系將雙末端測序得到的成對Reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的Tags。利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將拼接好的Tags聚類為OTU，并采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析，并在界、門、綱、目、科、屬和種水平統(tǒng)計分析各樣本的群落組成。利用QIIME2中q2-diversity方法進行Alpha多樣性分析，chao指數、shannon指數共同表征樣品的Alpha多樣性。

2 結果與分析

2.1 洗碗機樣品中可培養(yǎng)微生物的分離與鑒定

為探究洗碗機使用過程中微生物多樣性，在屬水平上統(tǒng)計洗碗機分離株種類和數量。本研究從冬季9 臺洗碗機的2 7個樣品中共分離獲得2 45株微生物菌種，其中細菌148株，涵蓋28個屬，如圖1（a）所示；真菌共分離獲得9 7株，涵蓋28個屬，如圖1（b）所示。其中，在屬水平上分離頻次較高的細菌主要芽孢桿菌屬（Bacillus）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、Cytobacillus 、微小桿菌（Exiguobacterium）、普里斯特氏菌屬（Priestia）等；分離頻次較高的真菌主要有分離頻次較高的真菌主要有曲霉屬（A spergi l lu s）、青霉屬（Penicillium）、假絲酵母屬（Candida）、鐮刀菌屬（Fusarium）、外瓶霉屬（Exophiala）等。

通過韋恩圖分析，3個城市的共有細菌為5種，如圖2（a）所示。分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、不動桿菌屬（A c i n e t o b a c t e r ）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、普里斯特氏菌屬（Priestia）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。芽孢桿菌屬（Bacillus）在洗碗機門封圈、下水口等區(qū)域容易富集。不動桿菌屬（Acinetobacter）在潮濕的環(huán)境中利于其生長。在3個城市中共有真菌為4種，如圖2（b）所示。分別為曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Candida）、外瓶霉屬（Exophiala）和鐮刀菌屬（Fusarium）。在洗碗機樣品中存在大量曲霉，該屬菌株在高濕條件下生長良好。假絲酵母屬（Candida）在室溫及37℃環(huán)境中均能生長。

2.2 洗碗機樣品中微生物群落結構分析

本研究共完成了洗碗機27個樣品的16S rRNA基因V 3 -V4區(qū)擴增子測序，共測序獲得16 5 5個OTU。門水平上，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）是洗碗機樣品中的優(yōu)勢細菌菌門，相對豐度分別為68.38%和9.75%，如圖3（a）所示。為了進一步明確細菌群落的物種組成，從屬水平上對洗碗機樣品細菌組成進行分析，如圖3（b）所示，假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和埃希氏桿菌屬（Escherichia）是洗碗機樣品優(yōu)勢細菌菌屬，相對豐度占比均在5%以上，分別為14.59%、10.96%、6.11%。這幾類屬在菌種可培養(yǎng)分離中均有分離到，埃希氏桿菌屬（Escherichia）的菌株分離頻次較高。

對洗碗機27個樣品進行I T S rDNA序列高通量測序，共測序獲得691個OT U。其中，子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）是洗碗機樣品中的優(yōu)勢菌，相對豐度分別為6 5 .14%和2 6 . 2 0 %，如圖4（a）所示，為了進一步明確真菌群落的物種組成，從屬水平上對洗碗機樣品真菌組成進行分析，如圖4（b）所示，假絲酵母屬（Candida）是洗碗機樣品優(yōu)勢真菌菌屬，相對豐度占比達到10.14%，枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）和外瓶霉屬（Exophiala）相對豐度占比均在5%以上，分別為8.11%、8.08%、6.05%。其中，假絲酵母屬（Candida）、枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）和外瓶霉屬（Exophiala）均是子囊菌門（Ascomycota）中的種類，在洗碗機可培養(yǎng)分離過程中均有分離，也是非培養(yǎng)中豐度較高的菌屬；擔子菌門（Bsidiomycota）的絲孢酵母屬（Trichosporon ）和紅酵母屬（Rhodotorula）在大部分洗碗機樣品中占有相對較高的豐度，在可培養(yǎng)實驗中均有分離。

2.3 洗碗機樣品中微生物多樣性分析

根據地理位置和不同的飲食習慣，本研究選取了北京、青島和佛山3個具有典型飲食習慣的城市，以shannon指數和chao指數作為代表，探究不同地域對微生物α多樣性指數的影響，詳見圖5。在3個城市中，青島地區(qū)微生物物種總數最高，見圖5（a）和5（c），細菌chao指數在52～ 4 0 9之間，真菌chao指數在82～127.6之間，北京地區(qū)和佛山地區(qū)的微生物物種總數較低，細菌c h a o 指數在4 4.75～ 667.21之間，真菌chao指數在29～111.6之間，佛山地區(qū)的不同樣品間細菌物種總數差異較大；shannon指數主要反應群落的異質性，青島地區(qū)的不同樣品間細菌多樣性差異較大，青島地區(qū)的洗碗機真菌多樣性最高，北京地區(qū)的不同樣品間真菌多樣性差異較大，見圖5（b）和5（d）。青島地區(qū)的微生物在物種總數和多樣性上均比其它兩個城市的高，不同樣品間的物種總數和多樣性差異較大可能與該地區(qū)所選取三臺洗碗機的微生物污染狀況差異較大有關。

基于OTU的PCA主成分分析，如圖6（a）所示，北京和青島細菌群落結構具有較高的相似性，佛山其他兩個城市具有較大的差異性；如圖6（b）所示，佛山和青島真菌群落結構具有較高的相似性，北京其他兩個城市具有較大的差異性。不同地域對洗碗機中共有微生物的影響研究發(fā)現，北京、青島和佛山3個城市注釋到的細菌OTU數目分別為750、957和987，共有OTU數目為328個，如圖7（a）所示，不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和埃希氏桿菌屬（Escherichia）是豐度排名前3位的共有細菌菌屬，其中不動桿菌屬（Acinetobacter）與可培養(yǎng)分離共有細菌菌屬一致；北京、青島和佛山3個城市注釋到的真菌OTU數目分別為249、416和329，共有真菌OTU數目為87個，如圖7（b）所示，其中假絲酵母屬（Candida）、外瓶霉屬（Exophiala）和曲霉屬（Aspergillus）是豐度排名前3位的共有真菌菌屬，與可培養(yǎng)分離共有真菌菌屬基本一致。

2.4 洗碗機樣品中微生物群落結構影響因素分析

為了進一步探究不同地域、不同采樣位置、使用年限和是否有水處理系統(tǒng)對樣品微生物群落結構的影響，選取chao和shannon指數，采用單因素方差分析，探究影響洗碗機微生物群落結構的關鍵因素，詳見表3。單因素方差分析發(fā)現，不同采樣位置對洗碗機樣品細菌物種總數和多樣性具有顯著影響，不同地域對洗碗機樣品真菌物種總數和多樣性具有顯著影響，使用年限和是否有水處理系統(tǒng)對樣品微生物總數和多樣性均無顯著影響。

3 討論

根據可培養(yǎng)方法和高通量測序結果可知，細菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、普里斯特氏菌屬（Priestia）、不動桿菌屬（Aci netob a cter）等；真菌主要有曲霉屬（A sp er g i l lu s）、假絲酵母屬（Ca nd id a）、外瓶霉屬（Exophiala）、青霉屬（Penicillium）、Magnusiomyces、邁耶氏酵母屬（Meyerozyma）等。

芽孢桿菌屬（Bacillus）是自然界分布極為廣泛的一類微生物，在廚房環(huán)境中普遍存在，尤其在洗碗機門封圈、下水口等區(qū)域容易富集，在不同城市大部分樣品中均分離培養(yǎng)出芽孢桿菌屬的微生物。據文獻報道，大多數芽孢桿菌屬細菌是無害的，但有一些對人和動物是有致病性的，該屬的蠟樣芽孢桿菌可引起食物中毒，已知蠟樣芽孢桿菌在免疫受損患者中引起菌血癥以及其他癥狀如嘔吐和腹瀉[9]，一些菌株產生不耐熱腸毒素，在食入后10～15 h內引起腹瀉。不動桿菌屬（Acinetobacter）廣泛分布于水、空氣、食品之中，具有較強粘附力，能夠形成生物膜，潮濕的環(huán)境利于其生長[10]，容易在洗碗機門封圈與出水口處富集。埃希氏桿菌屬（Escherichia）為人和動物腸道中的一種細菌，大多數菌株是無害的，但某些血清型（EPEC、ETEC等）會在其宿主中引起感染[11]，能夠引起人體或動物胃腸道感染，除胃腸道感染以外，還會引起尿道感染、關節(jié)炎、腦膜炎以及敗血型感染等[12]。曲霉菌屬（Aspergillus）是自然界分布極廣一類微生物，在洗碗機零部件中也存在大量曲霉，據文獻報道，該屬菌是空調系統(tǒng)積塵主要伴生真菌之一[13]，能夠引起過敏反應并會導致霉變，在高濕條件下生長良好。假絲酵母屬（Candida）對熱的抵抗力不強，加熱至60℃ 1小時后即可死亡，但對干燥、日光、紫外線及化學制劑等抵抗力較強，在室溫及37℃環(huán)境中均能生長[14]。

洗碗機樣品中分離到的大部分優(yōu)勢真菌廣泛分布于自然環(huán)境中，如曲霉屬、青霉屬、枝孢菌屬等；部分洗碗機樣品中存在條件致病菌，如曲霉屬、青霉屬、假絲酵母屬等；部分洗碗機樣品中存在抗逆特性菌，如外瓶霉、假絲酵母、Magnusiomyces 等；外瓶霉、Magnusiomyces 是文獻報道洗碗機中常見的真菌菌屬[15 ]，在本研究洗碗機樣品中均有分離到；外瓶霉屬（Exophiala）的菌株分布廣泛，通常從土壤、木材以及一些植物材料上分離得到，且耐高溫（4 ～ 47℃），該屬菌株是文獻報道洗碗機中出現頻率最高的黑酵母菌種，洗碗機橡膠類零部件是該類菌種的主要聚集地，研究推測橡膠類部件表面粗糙、具有疏水性、釋放芳香烴類化合物是該類菌種聚集的主要原因[16 -17]。Magnusiomyces 分離自洗碗機、乳制品、醫(yī)療器械、土壤、水、空氣、植物等環(huán)境，耐高溫（5～47℃），生長pH范圍（2.5～12），耐高鹽（17% NaCl），可引起肺部感染，口腔感染，血液腫瘤病人敗血癥[18-19]。青霉屬（Penicillium）廣泛存在于空氣、土壤及腐爛的水果、蔬菜、肉類中，洗碗機內部高濕的環(huán)境有利于青霉菌的生長，該屬的種類很多，在蔬菜、糧食、肉類和食物上常有分布，多呈灰綠色，部分該屬菌株有致病性，引起角膜、皮膚、外耳、呼吸道、泌尿系統(tǒng)感染和心內膜炎，可在嚴重免疫功能低下患者中引起播散性疾病，許多菌株產生真菌毒素[20]。邁耶氏酵母屬（Meyerozyma）的菌株可用于發(fā)酵食品釀造，具有耐鹽特性[21]。

4 結論

（1）本研究基于可培養(yǎng)技術共分離獲得2 45株微生物菌種，其中細菌148株，涵蓋28個屬；真菌共分離獲得97株，涵蓋28個屬。其中，在屬水平上細菌優(yōu)勢菌屬主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、埃希氏桿菌屬（Escher ich ia）、纖維芽孢桿菌屬（Cytobacillus）、微小桿菌（Exiguobacterium）、普里斯特氏菌屬（Priestia）等；真菌優(yōu)勢菌屬主要有曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、假絲酵母屬（Candida）、鐮刀菌屬（Fusarium）、外瓶霉屬（Exophiala）等。通過高通量測序分析，門水平上，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）是洗碗機樣品中的優(yōu)勢細菌菌門；子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Bsidiomycota）是洗碗機樣品中的優(yōu)勢真菌菌門。從屬水平上，假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和埃希氏桿菌屬（Escher ichia）是洗碗機樣品優(yōu)勢細菌菌屬；假絲酵母屬（Ca ndida）、枝孢菌屬（Cladosporium）、曲霉屬（Aspergillus）和外瓶霉屬（Exophiala）是非培養(yǎng)中豐度較高的菌屬。

（2）對洗碗機樣品中的微生物多樣性分析，在3個城市中，青島地區(qū)細菌物種總數最高，北京地區(qū)和佛山地區(qū)的細菌物種總數較低，佛山地區(qū)的不同樣品間細菌物種總數差異較大，青島地區(qū)的不同樣品間細菌多樣性差異較大；青島地區(qū)真菌物種總數和多樣性最高，北京地區(qū)和佛山地區(qū)的真菌物種總數較低，北京地區(qū)的不同樣品間真菌多樣性差異較大。

（3）對洗碗機樣品中微生物群落結構影響因素分析，不同采樣位置對洗碗機樣品細菌物種總數和多樣性的具有顯著影響，不同地域對洗碗機樣品真菌物種總數和多樣性具有顯著影響，使用年限和是否有水處理系統(tǒng)對樣品微生物總數和多樣性均無顯著影響。

（4）對洗碗機優(yōu)勢菌屬特性分析，芽孢桿菌屬（Bacillus）在廚房環(huán)境中普遍存在，在洗碗機門封圈、下水口等區(qū)域容易富集，曲霉菌屬（Aspergillus）高濕條件下生長良好，假絲酵母屬（Candida）對干燥、日光、紫外線及化學制劑等抵抗力較強，外瓶霉屬（Exophiala）主要在洗碗機橡膠類零部件區(qū)域聚集，耐高溫，是文獻報道洗碗機中出現頻率最高的黑酵母菌種。

作者簡介

許華，碩士研究生，工程師，研究方向為洗碗機消殺技術。

姚粟，通信作者，博士，教授級高級工程師，研究方向為工業(yè)微生物。

（責任編輯：張佩玉）