摘要：本研究采用染色體常規(guī)壓片技術(shù)和核型分析方法，對苦馬豆（Sphaerophysa salsula）6個自然居群（P81，P89，P96，P102，P137，P142）的染色體核型特征進(jìn)行了分析，探討了不同居群間的進(jìn)化趨勢和親緣關(guān)系。結(jié)果表明：苦馬豆6個參試居群的染色體數(shù)目和基數(shù)恒定，均為2n=2X=16；主要有中部著絲粒（m）和亞中部著絲粒（sm）染色體兩種類型，中部著絲粒染色體數(shù)量多于亞中部著絲粒染色體；絕大多數(shù)居群的核型公式為2n=2X=16 m，僅居群P137的核型公式為2n=2X=14 m+2 sm；染色體長度介于1.05～2.63之間，屬于小型染色體；核型類型包括1A，2A，3A和2B，平均臂比處于1.18～1.43之間，長度比居于1.44～2.05之間，核不對稱系數(shù)介于54.02～58.98之間；居群P89的核型類型為1A，核不對稱系數(shù)最小，進(jìn)化程度最低；當(dāng)遺傳距離為4時，苦馬豆6個居群形成三大類，居群P137和P142的親緣關(guān)系較近。本研究首次分析了苦馬豆的染色體核型特征，探討了不同居群間的進(jìn)化趨勢和親緣關(guān)系，為苦馬豆屬物種系統(tǒng)發(fā)育和基因組學(xué)研究提供了細(xì)胞學(xué)的佐證。

關(guān)鍵詞：苦馬豆；染色體；核型分析；進(jìn)化趨勢；親緣關(guān)系；聚類分析

中圖分類號：Q941+.2""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2469-09

Chromosome Karyotype Analysis from Six Different Populations

of Sphaerophysa salsula （Fabaceae）

QU Rong-ju1，2， LIU Yu-ping1，2，3， CHEN Jin-yuan1，2，3， SU Xu1，2，3*，

ZHANG Peng-hui1，2， JIN Jia-rui1，2， YU Ming-jun1，2， YANG Qian1，2

（1.School of Life Sciences， Qinghai Normal University， Xining， Qinghai Province 810008， China; 2. Key Laboratory of Biodiversity

Formation Mechanism and Comprehensive Utilization of the Qinghai-Xizang Plateau in Qinghai Province， Qinghai Normal

University， Xining， Qinghai Province 810008， China; 3. Academy of Plateau Science and Sustainability， Qinghai Normal

University， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：We analyzed the karyotype features of six natural geographic populations （P81，P89，P96，P102，P137，P142） of Sphaerophysa salsula and discussed their evolutionary trends and relationships by the conventional squash technique of chromosomes and karyotype analysis. The results showed that：（1） The number and basic number of chromosomes was constant across six populations of S. salsula，with 2n=2X=16. There were mainly two types of mid-centromeric and sub-centromeric chromosomes，and the number of mid-centromeric chromosomes was more than that of sub-centromeric chromosomes. （2） The karyotype formula of most populations of S. salsula was 2n=2X=16 m，except that the karyotype formula of P137 was 2n=2X=14 m+2 sm. The chromosome length was between 1.05 and 2.63，which belonged to small chromosomes. （3） Karyotype types of S. salsula included 1A，2A，3A and 2B，the mean arm ratio was from 1.18 to 1.43，the length ratio was between 1.44 and 2.05，and the karyotype asymmetry coefficient was 54.02～58.98. Besides，the karyotype type of P89 was 1A，with the lowest karyotype asymmetry coefficient and the lowest evolutionary degree. （4） When the genetic distance was four，the six populations of S. salsula were classified into three groups. Among them，P137 and P142 had the closest relationship. This study firstly discussed the chromosome karyotype features of S. salsula，and studied the evolutionary trends and relationships of different populations，which could provide the cytological evidence for phylogeny and genomic studies of the species of Sphaerophysa.

Key words：Sphaerophysa salsula;Chromosome;Karyotype analysis;Evolutionary trend;Relationship;Clustering analysis

苦馬豆（Sphaerophysa salsula）是豆科（Fabaceae）、蝶形花亞科（Papilionoideae）、苦馬豆屬（Sphaerophysa）的一種多年生草本植物，是我國西北荒漠區(qū)的重要旱生植物，主要分布于海拔960～3180 m的草原、荒漠、沙灘、山坡、荒地、溝渠、鹽池?？囫R豆具有較強(qiáng)的耐鹽堿、耐貧瘠等特性，生態(tài)價值較高，是鹽堿地改良的一種重要資源植物［1］；同時，它具有較高的藥用價值，利尿、消炎、止血，可用于治療肝硬化、浮腫、腎炎等疾?。?］。目前，國內(nèi)外對苦馬豆的研究主要集中于種子萌發(fā)特性［3-5］、化學(xué)成分［6-8］、藥理作用［9-11］、共生微生物［12-14］等方面，而關(guān)于苦馬豆系統(tǒng)發(fā)育的研究相對較少［15］，尤其從群體水平探討苦馬豆染色體數(shù)目和核型分析的研究未見報道。

染色體是遺傳物質(zhì)的主要載體，在細(xì)胞分裂過程中由染色質(zhì)凝縮而成，其形態(tài)和數(shù)目是最穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征之一［16-17］。染色體核型分析是基礎(chǔ)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究方法，主要通過觀察和統(tǒng)計細(xì)胞有絲分裂中期的染色體，計算其數(shù)目和長度等數(shù)量特征，分析著絲點位置、染色體類型和隨體有無等結(jié)構(gòu)特征［18］，進(jìn)而探究同種和不同物種之間的親緣關(guān)系［19］。迄今為止，國內(nèi)外諸多學(xué)者［20-22］利用染色體壓片技術(shù)研究了許多被子植物的染色體數(shù)目及核型特征，并闡明了這些植物的系統(tǒng)位置和進(jìn)化關(guān)系，取得了顯著成效。譬如，Rane等［20］分析了虎掌藤屬（Ipomoea）10種植物的染色體核型，認(rèn)為該屬植物均為二倍體，2n=2X=30，并推斷了物種間的進(jìn)化關(guān)系；顧志建等［21］報道了青藏高原地區(qū)云霧雀兒豆（Chesneya nubigena）的染色體數(shù)目和核型，發(fā)現(xiàn)其為二倍體，核型公式為2n=2X=16=10 m+6 sm，屬于2B型；白俐等［22］采用常規(guī)壓片法研究了苦參屬（Sophora）6種植物的染色體數(shù)目和核型，結(jié)果表明該屬植物的染色體基數(shù)均為9，屬內(nèi)不同物種間染色體核型差異較大；同樣，楊萍等［23］采用常規(guī)染色體壓片技術(shù)研究了扇穗茅6個不同自然地理居群的染色體數(shù)目和核型，發(fā)現(xiàn)參試居群間的親緣關(guān)系與海拔高度存在極大的相關(guān)性。此外，研究還表明染色體制片和核型分析可以為植物高質(zhì)量基因組研究提供細(xì)胞學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)［24］。據(jù)此，本研究采用常規(guī)染色體壓片技術(shù)和核型分析方法，探究苦馬豆6個不同居群的染色體數(shù)目和核型，推斷其進(jìn)化趨勢和親緣關(guān)系，旨在為苦馬豆屬物種系統(tǒng)發(fā)育和基因組學(xué)研究提供細(xì)胞學(xué)方面的理論佐證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究的試驗材料為2021年7—9月采自內(nèi)蒙古、陜西、寧夏和青海地區(qū)苦馬豆6個自然地理居群的成熟種子，具體采樣信息詳見表1。憑證標(biāo)本均保存于中國科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（QTPMB）。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發(fā) 從苦馬豆6個參試居群中精選完整飽滿且無蟲孔的成熟種子，然后從每個居群中分別選取10粒種子進(jìn)行萌發(fā)試驗。即先將種子置于—20℃冰箱中處理24 h，隨后將其均勻放于預(yù)先鋪有用蒸餾水濕潤的兩層濾紙的培養(yǎng)皿中［25］，并于22℃恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)；待苦馬豆種子根長長至0.5～1.0 cm時進(jìn)行取樣預(yù)處理。

1.2.2 預(yù)處理 剪取的苦馬豆根尖置于預(yù)先蒸餾水濕潤的2.0 mL EP管中，立即將其透入到充滿N2O密封罐中處理130 min，設(shè)置壓強(qiáng)為0.55 MPa。

1.2.3 固定和解離 預(yù)處理好的苦馬豆根尖立即放入含有卡諾氏固定液（95%乙醇∶冰醋酸=3∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用）的2.0 mL EP管中，保證根尖充分浸入固定液，然后迅速將EP管放置于4℃冰箱中至少固定10 min，隨后用45%的乙酸解離5 min，待用。

1.2.4 制片、染色和觀察 取出解離完成的苦馬豆根尖，放置于載玻片中央，用雙面刀片切除除根尖頂端分生組織外的其他部分，然后用改良的石炭酸品紅染液對其染色，7 min后蓋上蓋玻片，立即用鑷子鈍端輕輕敲擊蓋玻片，使根尖分生組織充分散開，隨后迅速將載玻片掠過酒精燈外焰，蒸干組織區(qū)域的液體，用濾紙垂直向下按壓蓋玻片，使染色體均勻分散；用Olympus BX53型相差顯微鏡觀察染色體形態(tài)和統(tǒng)計數(shù)目，同時選取形態(tài)良好、數(shù)目清晰的分裂中期染色體視野拍照［26］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 從苦馬豆每個參試居群中選擇30個以上處于分裂中期的細(xì)胞，利用Olympus BX53型相差顯微鏡確定染色體數(shù)目和倍性；然后，從每個居群中分別挑選10個分散良好、數(shù)目完整、形態(tài)清晰的染色體進(jìn)行核型分析。即采用Photoshop 2021軟件統(tǒng)計苦豆子每個個體的所有染色體長臂長和短臂長［27］，測量數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel中進(jìn)行統(tǒng)計；采用常規(guī)方法計算染色體的相對長度和臂比，依據(jù)李懋學(xué)［28］方法進(jìn)行染色體配對；根據(jù)Kuo等［29］的方法計算相對長度系數(shù)、平均臂比、染色體長度比、核不對稱系數(shù)等參數(shù)，并利用Arano［30］和Stebbins［31］方法進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計和核型分類。此外，根據(jù)刑世巖［32］方法分析苦馬豆染色體核型進(jìn)化趨勢，使用Excel軟件繪制核型二維進(jìn)化圖；參照李曉莉等［33］方法計算染色體平均臂比及其方差、相對長度方差、染色體長度比、各類型染色體比例等參數(shù)，并采用SPSS 26軟件進(jìn)行苦馬豆染色體的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目與倍性鑒定

研究結(jié)果表明，苦馬豆6個居群的染色體均為二倍體，基數(shù)為8，且數(shù)目恒定，2n=2X=16，不存在染色體數(shù)目和形態(tài)的異常（圖1）。

2.2 染色體形態(tài)特征與類型分析

從苦馬豆每個參試居群中，分別選取較為清晰的染色體中期分裂圖，然后根據(jù)著絲點位置以及染色體相對長度、臂比等參數(shù)，對其進(jìn)行同源染色體配對，結(jié)果顯示每個居群均有8對染色體，參數(shù)統(tǒng)計結(jié)果詳見表2。

從表2可以看出，除居群P137的染色體由中部著絲點染色體（m）和近中部著絲點染色體（sm）組成外，其他所有居群的染色體均為中部著絲點染色體（表2）。同時，根據(jù)染色體相對長度系數(shù)［34］和Kuo［29］分類標(biāo)準(zhǔn)，苦馬豆的染色體可以劃分為長染色體L型（≥1.26）、中長染色體M2型（1.01～1.25）和中短染色體M1型（0.76～1.00）三種類型，其中居群P137的染色體類型為M2和M1型，而其他5個居群的染色體類型均為L，M2和M1型（表2）。此外，本研究還根據(jù)苦馬豆染色體的配對結(jié)果和參數(shù)數(shù)據(jù)，繪制了染色體的核型模式圖（圖2）。

2.3 染色體核型分析

基于苦馬豆所有居群染色體長度的統(tǒng)計分析，本研究得到了它們的染色體長度比、臂比大于2的比例、核型公式和類型以及核不對稱系數(shù)等參數(shù)。結(jié)果顯示，苦馬豆所有居群染色體的核型公式均為2n=2X=16，其中居群P137的核型公式為2n=2X=14 m+2 sm，其他參試居群的核型公式為2n=2X=16 m；長度比介于1.44～2.05之間，居群P102的長度比最大（2.05），居群P137的長度比最?。?.44）（表3）?？囫R豆染色體核型類型包括1A，2A，2B和3A，其中居群P137和P142中臂比大于2的染色體占比較高，核型類型為3A；而居群P89不存在臂比大于2的染色體，核型類型為1A，說明居群P89的染色體最對稱（表3）。此外，苦馬豆參試居群染色體平均臂比處于1.18～1.43之間，且平均臂比較高的居群，其核不對稱系數(shù)也較大；其中，居群P81的核不對稱系數(shù)相對較大（58.98%），居群P89的核不對稱系數(shù)較?。?4.02%），其他居群的核不對稱系數(shù)介于兩者之間（表3）。

同時，本研究還以平均臂比（MAR）為橫軸，以核不對稱系數(shù)（As.K）和染色體長度比（CLR）為縱軸，分別構(gòu)建“平均臂比-核不對稱系數(shù)”和“平均臂比-染色體長度比”的二維圖（圖3），分析苦馬豆參試居群間染色體核型的進(jìn)化趨勢。研究結(jié)果表明，苦馬豆染色體的平均臂比與核不對稱系數(shù)呈正相關(guān)，6個參試居群沿平均臂比-核不對稱系數(shù)向右上角進(jìn)化程度依次增高（圖3A）。其中，居群P81的核不對稱系數(shù)最大，染色體對稱性最低；居群P89的核不對稱系數(shù)最小，染色體對稱性最高。此外，從圖3B可以明顯看出苦馬豆的染色體核型呈“雙向進(jìn)化趨勢”，其中居群P81和P102的進(jìn)化程度最高。

另外，依據(jù)參試居群染色體的平均臂比、臂比gt;2的染色體比例、核不對稱系數(shù)等，本研究還構(gòu)建了苦馬豆參試居群間的核型聚類圖，并分析了不同居群間的親緣關(guān)系。結(jié)果顯示，當(dāng)遺傳距離為25時，參試居群形成A，B兩大分支，其中居群P89和居群P96構(gòu)成B支，居群P137，P142，P102，P81組成A支；遺傳距離為15時，參試居群聚為3個分支，其中構(gòu)成B支的兩個居群形成獨立的分支；當(dāng)遺傳距離為1時，6個參試居群獨立成支（圖4）。因此，居群P137和P142以及居群P89和P96的親緣關(guān)系相對較近。

3 討論

染色體數(shù)目、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和核型作為較穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征，對研究植物的分類、起源和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系有著重要作用［35-36］；并且，植物染色體數(shù)目和基數(shù)還可為后續(xù)基因組研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)［37］。譬如，張力天等［38］通過常規(guī)根尖壓片法對西藏日喀則市白草染色體數(shù)目的統(tǒng)計和核型分析，發(fā)現(xiàn)白草的染色體數(shù)目為36，基數(shù)為9（2n=4X=36=34 m+2 sm）。本研究發(fā)現(xiàn)，苦馬豆的染色體數(shù)目為16條，基數(shù)為8（2n=2X=16），這與先前李紅等［39］對駱駝刺（Alhagi camelorum）染色體核型特征的研究結(jié)果一致，推測它們可能是豆科植物中親緣關(guān)系較近的類群，這也得到蘇丹丹等［15］利用葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建的苦馬豆和駱駝刺的親緣關(guān)系結(jié)果的支持和印證。除居群P137的核型公式為2n=2X=14 m+2 sm外，苦馬豆5個居群的核型公式均為2n=2X=16 m，表明苦馬豆的染色體具有較高的遺傳穩(wěn)定性［40］。Du等［41］認(rèn)為額外的DNA主要添加到植物較小染色體的長臂上且受地理位置和海拔高度的影響，因而苦馬豆6個參試居群中僅有居群P137的染色體核型由7對中部著絲粒染色體和1對近中部著絲粒染色體構(gòu)成，這可能是由于該居群主要生長于緯度相對較低的生境中所導(dǎo)致的。據(jù)此，本研究認(rèn)為苦馬豆染色體形態(tài)變化產(chǎn)生的多樣性是其長期適應(yīng)環(huán)境演化的結(jié)果［42］。

染色體形態(tài)作為重要的核型特征，可被用于探討不同物種或不同居群間的親緣關(guān)系和進(jìn)化趨勢［43］。譬如，孫立民等［44］通過對古銀杏（Ginkgo biloba）半同胞家系染色體核型分析及進(jìn)化趨勢的研究，認(rèn)為不同的地理區(qū)位和漫長的生活史期間的環(huán)境變化是導(dǎo)致古銀杏各家系間核型組成和類型存在較大差異的主要原因；宛濤等［45］通過觀察分析內(nèi)蒙古不同生態(tài)區(qū)冷蒿（Artemisia frigida）的染色體核型，發(fā)現(xiàn)不同生態(tài)區(qū)冷蒿的染色體形態(tài)和倍性具有一定的差異，推測這可能是由生態(tài)環(huán)境的影響造成的；王亞男等［46］采用染色體常規(guī)壓片技術(shù)探討了沙鞭（Psammochloa villosa）不同居群的染色體核型特征和進(jìn)化關(guān)系，認(rèn)為同種植物染色體形態(tài)隨著生境不同而發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)，苦馬豆參試居群的染色體長度介于1.05～2.63之間，隸屬于小型染色體；染色體核型可被劃分為1A，2A，3A和2B，長度比、核不對稱系數(shù)、平均臂比等均存在明顯差異，說明苦馬豆不同參試居群間的染色體形態(tài)差異較大，這可能由于它們所處的地理環(huán)境條件不同造成，進(jìn)一步驗證了先前研究結(jié)果［44-46］的正確性與合理性，同樣認(rèn)為同種植物在長期的環(huán)境因子作用下將會逐漸演變成適應(yīng)各自生境的生態(tài)居群。

研究表明，植物染色體向著核型不對稱的方向進(jìn)化，即核型越不對稱進(jìn)化程度越高；著絲粒位置和染色體長度差異決定植物染色體的核不對稱性［31］。通常，植物染色體具有向核不對稱系數(shù)增大以及Stebbins標(biāo)準(zhǔn)1A—4C方向演化的趨勢［47］。本研究結(jié)果表明，苦馬豆參試居群的核不對稱系數(shù)介于54.02%～58.98%之間，居群的進(jìn)化程度依次為P89lt;P96lt;P102lt;P142lt;P137lt;P81；參試居群的染色體核型類型可被劃分為1A，2A，3A和2B，居群染色體的進(jìn)化程度為P89lt;P81lt;P96lt;P137lt;P142lt;P102。由此看來，居群P89的進(jìn)化程度最低，即該居群的核型類型為1A，核不對稱系數(shù)最小，染色體對稱性最高，推測寧夏回族自治區(qū)石嘴山市可能為苦馬豆的生物多樣性中心和起源中心［34］。相反，居群P81核不對稱系數(shù)最大，進(jìn)化程度最高。研究表明，海拔高度的變化能夠引起降水、地表溫度和升溫速率等環(huán)境因子的改變，尤其隨著海拔的升高溫度會逐漸降低［48］。苦馬豆6個參試居群中，居群P81生長的海拔最高，核不對稱系數(shù)最大，這可能是由于其處于較低的環(huán)境溫度進(jìn)而影響染色體著絲粒位置導(dǎo)致的。同樣，居群P102的染色體屬于2B型染色體，長度比最大，進(jìn)化程度最高，研究團(tuán)隊推測較高的緯度條件共同促進(jìn)了居群P102的染色體長度差異變化［41］。因此，本研究認(rèn)為生態(tài)因子對苦馬豆染色體的進(jìn)化方向具有重要影響，不同的生態(tài)因子往往使苦馬豆的染色體核型向著特定的方向進(jìn)化，這為以后苦馬豆的引種馴化和優(yōu)良種質(zhì)資源篩選提供了重要參考。

另外，聚類分析能夠有效整合多變量信息來推斷不同物種和不同居群間的親緣關(guān)系［49］。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)遺傳距離為25時苦馬豆參試居群形成A，B兩大分支，其中A支包括居群P137，P142，P102和P81，B支包含居群P89和P96，同一分支內(nèi)不同居群間具有較近的親緣關(guān)系；當(dāng)遺傳距離為1時，居群P137和P142先聚成1個分支，然后與其他居群形成不同的分支；并且，居群P137和居群P142始終親緣關(guān)系最近。本研究首次報道了苦馬豆不同居群的染色體核型特征、進(jìn)化趨勢和親緣關(guān)系，可以為將來解析苦馬豆屬乃至蝶形花亞科物種系統(tǒng)進(jìn)化和群體基因組學(xué)研究提供細(xì)胞學(xué)佐證。

4 結(jié)論

苦馬豆染色體的數(shù)目為16條，基數(shù)為8，核型公式為2n=2X=16；除居群P137的染色體由近中部著絲粒（sm）和中部著絲粒（m）染色體構(gòu)成外，其他居群的染色體均為中部著絲粒染色體。苦馬豆的染色體長度介于1.05～2.63之間，屬于小型染色體；平均臂比處于1.18～1.43之間，長度比居于1.44～2.05之間；染色體核型類型包括1A，2A，3A和2B，核不對稱系數(shù)介于54.02%～58.98%之間，染色體呈“雙向進(jìn)化趨勢”；當(dāng)遺傳距離為4時，苦馬豆6個居群形成三大類，居群P137和P142的親緣關(guān)系較近。本研究首次分析了苦馬豆不同居群的染色體核型特征與差異，探討了它們的進(jìn)化趨勢和親緣關(guān)系，可為今后苦馬豆屬物種系統(tǒng)發(fā)育和基因組學(xué)研究提供細(xì)胞學(xué)佐證。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）