關鍵詞：煙葉；代謝組學；成熟度；差異代謝物

煙葉成熟度是影響煙葉品質的重要因素之一[1]，可分為未熟、初熟、適熟、過熟4 個檔次[2-4]。王勇等[5]研究發(fā)現，適熟煙葉的各項品質指標綜合表現較好，而過熟煙葉會在較大程度上降低煙葉產量。李迪秦等[6]研究表明，上部葉在適熟向過熟過度時煙葉的物理特性和化學成分處于最佳狀態(tài)，而中性香氣成分在過熟時期達到最佳狀態(tài)。目前，雖然有相關研究探討成熟度與煙葉品質的關系，但均限于成熟度與烤后煙葉質量的關系，少有研究報道成熟度對鮮煙葉品質的影響。

代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后發(fā)展起來的一門新興學科，已成為系統生物學中不可或缺的一部分[7]。Zi等[8]研究了干旱對玉米幼苗的影響，通過構建代謝圖譜確定了苯丙素類、谷胱甘肽和嘌呤等物質在植物響應干旱脅迫中起重要作用。袁俊等[9]利用代謝組學技術，在丹參中成功識別出51種關鍵的差異代謝物響應鎘（Cd）脅迫，主要包括氨基酸和有機酸，表明丹參通過調控這些氨基酸和有機酸的代謝過程來增強其對Cd的耐受性。彭翠云等[10]利用代謝組學的方法研究發(fā)現，關鍵代謝物在延遲采收8 d的上部葉中表現為下調，并確定了豫中煙區(qū)烤煙的最佳采收期。高云等[11]利用代謝組學研究了不同生態(tài)環(huán)境下煙草代謝物的差異。盡管越來越多基于代謝組學的研究分析了生長周期對煙葉代謝的影響，但關于不同成熟度對上部煙葉代謝物影響的研究還相對較少。因此，本研究采用非靶向代謝組學技術，利用煙葉SPAD值反映煙葉成熟度，對不同成熟度煙葉進行代謝組學分析，為優(yōu)質煙葉生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年在湖南省郴州市桂陽縣敖泉鎮(zhèn)（25°75′N、112°73′E，海拔467 m）進行。供試品種為當地的主栽品種云煙87，于3 月25 日移栽，5月24日打頂，有效留葉數為18片左右。

1.2 試驗設計

結合當地煙農實際上部煙葉采收情況，設置葉片SPAD 值分別為30～35（BM1）、25～30（BM2）、20～25（BM3）、15～20（BM4）4種采收成熟度，各采收成熟度煙葉的采收時間和外觀特征如表1所示。

1.3 測定的項目與方法

1.3.1 氣象資料采集 在國家氣象信息中心中國氣象數據網（http：//data.cma.cn/dataService/cdcindex/datacode/A. 0012.0001/show_value/normal. html）收集2022年5月1日至7月31日的當地氣象數據。

1.3.2 鮮煙葉SPAD 值測定 利用葉綠素儀SPAD-502Plus（日本Konica Minolta 公司生產）參照孫陽陽等[12]的方法，避開支脈以及病斑等位置，分別測定煙葉主脈左右兩側的葉尖、葉中、葉基共6個點的SPAD值，以這6個點的平均值作為該葉片的SPAD值[13]。

1.3.3 烤后煙葉化學成分測定 烘烤結束后，參照YC/T 468—2021[14]測定煙堿含量，參照YC/T 159—2019[15]測定總氮含量，參照YC/T 159—2019[16]測定總糖、還原糖含量，參照YC/T 217—2007[17]測定鉀含量，參照YC/T 162—2011[18]測定氯含量。

1.3.4 烤后煙葉感官質量評價 按照中國煙草行業(yè)標準YC/T 530—2015[19]對烤后煙葉進行感官質量評價，包括氣味特性（香氣質、香氣量、透發(fā)性）、口感特性（雜氣、細膩程度、柔和程度、圓潤感）、刺激特性（刺激性）、余味特性（余味）。

1.4 代謝組學分析

1.4.1 樣本獲取 按試驗設計采集各處理長勢正常、無明顯病蟲害的煙株上部葉，去除葉梗、葉緣部分后剪碎葉片，用錫箔紙包裹標記，每處理重復6次，置于液氮冷凍待測。

1.4.2 試劑與儀器 主要試劑包括甲醇（≥99.0%，賽默飛世爾科技公司）、2-氯-L-苯丙氨酸（≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。主要儀器包括冷凍離心機（湘儀H1850-R）、混勻儀（其林貝爾BE-96）、組織研磨器（美壁MB-96）、超聲波清洗器（舒美KW-100TDV）、濾膜（津騰0.22 μmPTFE）、玻璃珠（Sigma G8772-500G）。

1.4.3 代謝物提取 精確稱量適量樣本于2 mL離心管中，加入600 μL 含 2- 氯-L- 苯丙氨酸（4 ppm）的甲醇（?20 ℃ 保存），渦旋振蕩30 s；加入 100 mg玻璃珠，放入組織研磨器中，60 Hz 研磨90 s；室溫超聲15 min；12 000 r·min?1、4 ℃離心10 min，取上清液過0.22 μm膜過濾，過濾液加入到檢測瓶中， 用于LC-MS（liquid chromatographmassspectrometer）檢測[20]。

1.5 數據分析

對質譜數據進行峰識別、對齊、歸一化等處理，通過與數據庫或標準物質進行對比，定性和定量識別樣品中的代謝物；進一步對代謝物進行統計學分析和生物信息學分析，包括主成分（principalcomponent，PC）分析、系統聚類分析等，以尋找不同處理樣品間的差異代謝物；并將差異代謝物映射到生物通路數據庫，進行富集分析，以鑒定重要的代謝通路；最后，根據代謝物之間的相關性建立代謝網絡，探索代謝通路和相互作用。

2 結果與分析

2.1 生育期內氣象變化情況

2022年5月至7月，試驗地的氣溫、降水量和日照時數變化如圖1所示。試驗期間，日均溫除6月中旬相對較低外，其他時間整體呈上升趨勢。降水量在5月中旬最多，之后到7月中旬一直呈下降趨勢。日照時數表現為5、6月間差距較小，6月下旬開始日照時數呈降低趨勢。綜上，在試驗期間郴州煙區(qū)整體表現為采收期降水量相對偏多、日照時數較長。

2.2 煙株的農藝性狀分析

農藝性狀可直接反應煙株長勢。由表2 可知，在采收期，煙株的株高和莖圍變化較小，頂1、頂3和頂6葉的葉長、葉寬和葉面積逐漸增大，其中頂3和頂6葉的葉寬顯著增大。由此可知，煙株整體長勢良好，可用于后續(xù)試驗分析。

2.3 不同采收成熟度對煙葉化學成分的影響

不同采收成熟度對煙葉化學成分的影響如表3所示，隨著煙葉成熟度的增大，煙葉的煙堿、鉀和氯含量逐漸增加，總氮、總糖和還原糖含量逐漸減少，糖堿比和鉀氯比呈逐漸減小的趨勢。BM4處理的煙堿、鉀、氯含量較BM1處理分別顯著增加16.75%、17.44%、94.73%，而總氮、總糖、還原糖含量較BM1 處理分別顯著降低12.50%、13.45%、9.83%；BM3 處理煙葉的氯含量最高；BM2處理煙葉的總氮含量最高，顯著高于其余3個處理；BM1處理的糖堿比顯著高于其他處理。綜上所述，隨著煙葉成熟度的增加，煙葉的化學成分更加協調。

2.4 不同采收成熟度對煙葉感官質量的影響

煙葉的感官質量是評價烤煙品質的重要因素，由表4可知，隨著采收成熟度的增加，煙葉的感官質量總分呈先增加后減小趨勢，其中BM3處理煙葉的總分最高，其中香氣質、香氣量和刺激性得分較高；BM1處理煙葉的總分最低，除干燥感和余味表現較好外，其余指標均表現較差。

2.5 不同成熟度煙葉代謝組學比較

2.5.1 主成分分析 不同成熟度煙葉代謝組主成分分析結果如圖2所示，不同成熟度的煙葉樣品在組內聚集，表明同一處理不同重復間具有較好的一致性，而不同處理間樣品距離較遠，表明不同成熟度的煙葉樣品存在較大差異。其中，正離子模式下不同處理間差異均較大；負離子模式下BM1、BM2、BM3與BM4處理間差異較大，BM1與BM3 處理間差異也較大，BM2 處理與BM1、BM3處理間距離較近，可能是代謝物的主要變化時期，且當地煙葉采收的成熟度均處于BM2處理，因此將BM2處理視為對照。

2.5.2 差異代謝物分析 通過方差分析和質譜數據庫比對，共鑒定出230 種顯著差異代謝物（Plt;0.05），其中包括26 種氨基酸、41 種有機酸、7種糖、11種核苷、6種維生素、17種生物堿、17種醇、6種酯、2種胺等（圖3）。BM1處理有118種代謝物含量顯著高于BM2處理，主要包括16種氨基酸、24 種有機酸、3 種糖、9 種核苷、4 種維生素、11種生物堿、10種醇、3種酯等，其中倍數變化大于2的有10種，分別為甲基丁香酚、色胺、煙堿、肉桂酸甲酯、（R）-茚三酮、玉米赤霉醇、琥珀酸半醛、葡萄糖酸、脫氧肌苷、吡格列酮。BM2處理有84種代謝物含量顯著高于BM3 處理，主要包括8種氨基酸、21種有機酸、1種糖、5種核苷、4種維生素、8種生物堿、17種醇、3種酯等，其中倍數變化大于2的有10種，分別為α-松油烯、煙堿、肉桂酸甲酯、睪酮、孕二醇、環(huán)磷酸鳥苷、L-脯氨酸、吡哆醛、香草酸、吡格列酮。BM2處理有79種代謝物含量顯著高于BM4 處理，主要包括11 種氨基酸、18 種有機酸、1 種糖、5 種核苷、3 種維生素、7種生物堿、5種醇、1種酯等，其中倍數變化大于2的有36種，分別為5-氨基-2-氧代戊酸、α-松油烯、1，4-二甲基-7-乙基甘菊烯、毛果蕓香堿、1-十六烷醇、睪酮、谷胱甘肽、纖毛二糖、植物鞘氨醇、孕二醇、前列腺素D1、孕烯醇酮甲腈、21-脫氧皮質醇、布法二烯內酯、3α，7α-二羥基-5β-膽甾烷、林可霉素、異槲皮苷、維甲酰b-葡糖苷酸、角黃素、L-木糖酸酯、吡哆醛、壬二酸、泛酸、褪黑素、胞苷、脫氧肌苷、半乳糖基甘油、2-O-（α-D-甘露糖基）-D-甘油酸、1-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、19-羥基丹參酮、（13E）-11α-羥基-9，15-二氧代前列素-13-烯酸、5-O-阿魏?？鼘幩?、核黃素減少、6-磷酸海藻糖、帕西林、地高辛。

2.5.3 主要差異代謝物聚類熱圖分析 將在煙葉成長過程中起到積極響應、對煙葉品質具有較大影響且在不同成熟度間具有顯著差異的代謝物作為篩選條件，篩選主要差異代謝物，結果共篩選出27種主要差異代謝物，對差異代謝物進行聚類熱圖分析，如圖4所示。L-色氨酸、綠原酸、棕櫚油酸在BM1處理表現為顯著上調，在BM4處理顯著下調，在BM3 處理處于中間狀態(tài)；刀豆氨酸、肌酸、山梨醇、葫蘆巴堿、α-亞麻酸、甘油酸、創(chuàng)傷性酸、膽堿、馬泰樹脂醇、脫氧肌苷、蕓香苷在BM1處理表現為顯著上調；L-苯丙氨酸、鳥嘌呤、L-脯氨酸在BM1處理表現為顯著上調，在BM3處理顯著下調；L-蛋氨酸在BM4處理表現為顯著上調；葡糖二酸、尼古丁在BM2和BM4處理表現為顯著上調，在BM1和BM3處理顯著下調；油酸在BM3處理表現為顯著上調；L-絲氨酸、黃氧酸在BM1處理表現為顯著下調，在其余3個處理均顯著上調；L-谷氨酸、丁香酸、丁香酚、色胺在BM4處理表現為顯著上調，在BM3處理的上調幅度略低于BM4，而在BM1處理顯著下調。

2.5.4 代謝通路的差異富集分析 由圖5可知，BM1與BM2處理間差異代謝物的主要富集通路為氨基酸代謝（色氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，賴氨酸生物合成，酪氨酸代謝，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝）；其他次生代謝物的生物合成（苯丙烷生物合成、單巴坦生物合成）；折疊、分類和降解（硫接力系統）；脂質代謝（花生四烯酸代謝）；膜運輸（ABC轉運蛋白）；輔助因子和維生素的代謝（泛酸和輔酶A的生物合成、煙酸和煙酰胺代謝、維生素B6代謝）；其他氨基酸的代謝（氰胺酸代謝、β-丙氨酸代謝）；轉化（氨酰生物合成）。由此說明可通過調節(jié)相關的代謝通路使煙葉達到適時采收狀態(tài)。

由圖6可知，BM2與BM3處理間差異代謝物的主要富集通路為氨基酸代謝（甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，賴氨酸退化，色氨酸代謝，精氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，賴氨酸生物合成）；其他次生代謝物的生物合成（東莨菪堿、哌啶和吡啶生物堿的生物合成，苯丙烷生物合成）；碳水化合物代謝（檸檬酸循環(huán)）；脂質代謝（亞油酸代謝）；膜運輸（ABC轉運蛋白）；輔助因子和維生素的代謝（維生素B6代謝、泛酸和輔酶A的生物合成）；其他氨基酸的代謝（谷胱甘肽代謝、β-丙氨酸代謝）；核苷酸代謝（嘧啶代謝）；信號轉導（植物激素信號轉導）；轉化（氨酰生物合成）。

由圖7可知，BM2與BM4處理間差異代謝物的主要富集通路為氨基酸代謝（精氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，賴氨酸生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，色氨酸代謝）；其他次生代謝物的生物合成（苯丙烷生物合成）；碳水化合物代謝（半乳糖代謝、丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)）；能量代謝（光合生物中的碳固定）；折疊、分類和降解（硫接力系統）；脂質代謝（亞麻酸代謝）；膜運輸（ABC轉運蛋白）；輔助因子和維生素的代謝（泛酸和輔酶A的生物合成）；其他氨基酸的代謝（β-丙氨酸代謝、谷胱甘肽代謝）；轉化（氨酰生物合成）。

2.5.5 代謝網絡分析 為分析不同采收成熟度煙葉間差異代謝物的核心生物學功能，對代謝通路的差異富集分析結果進一步進行KEGG通路富集分析，結果如圖8所示。在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路中，L-色氨酸、2-酮丁酸、膽堿、甘油酸、L-高絲氨酸、肌酸、甜菜堿顯著上調，其中甘油酸、膽堿和肌酸表現為BM1處理含量較高，其余處理均較低；L-高絲氨酸表現為BM4含量較高，BM2、BM1處理次之，BM3處理最低；L-絲氨酸顯著下調。在苯丙烷類生物合成中，亞精胺、L-苯丙氨酸、綠原酸、松柏醛顯著上調，其中綠原酸表現為BM1處理含量較高，BM3、BM2處理次之，BM4處理較低；芥子酸、紫杉醇、4-羥基苯乙烯、丁香酚顯著下調，其中芥子酸表現為BM4 處理含量較高，BM3處理次之，BM2和BM1處理較低，丁香酚表現為BM4處理含量較高，BM3處理次之，BM1處理較低。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝中，琥珀酸、L-天冬氨酸顯著上調，L-谷氨酸、2-酮戊二酸顯著下調，其中琥珀酸表現為BM4處理含量較高，BM2含量次之，其余處理較低，L?谷氨酸表現為BM4處理含量較高，BM3處理次之，BM2處理較少，BM1處理最低。

3 討論

氣候條件對于煙草的品質及風格特色的形成至關重要[22]。研究表明，烤煙生長發(fā)育期和成熟期氣溫在20～28 ℃最理想，烤煙的內在質量隨著平均溫度的升高而提升[23]；生育期的適宜降水量為400～520 mm，其中還苗伸根期80～100 mm，旺長期200～260 mm，成熟期120～160 mm[24]。這與本研究煙草生育期的氣候條件相一致，由此表明，本研究烤煙生長的環(huán)境條件較適宜。

在烤煙生產的眾多環(huán)節(jié)中，成熟度是決定煙葉質量的關鍵因素之一。成熟度的差異直接影響煙葉中主要化學成分的含量，進而對煙葉的感官品質產生顯著影響。本研究表明，隨著采收成熟度的增加，煙葉的煙堿、鉀和氯含量逐漸增加，而總氮、總糖和還原糖含量逐漸減少。其中煙堿含量的增加可能與成熟煙葉中氮代謝途徑改變有關，其中一部分氮被用于合成煙堿；鉀含量的增加可能與成熟度較高的煙葉中光合作用和營養(yǎng)物質運輸的增強有關；總氮、總糖和還原糖含量的減少反映了成熟過程中氮同化和碳水化合物代謝的變化，總氮含量的減少可能與成熟煙葉中蛋白質合成減少或分解加速有關，而總糖和還原糖的減少可能與淀粉等多糖的轉化或呼吸作用的增強相關，這與宋笑龍等[25]研究結果一致。本研究表明，成熟度對烤煙的感官質量有顯著影響，具體表現為隨著煙葉成熟度的增加，感官質量總分呈先增加后減小趨勢，說明在一定范圍內提高煙葉的成熟度可以改善其感官品質，尤其是在香氣和刺激性方面。適宜的成熟度有助于香氣物質的充分轉化和積累，同時降低刺激性物質含量，從而提升煙葉的整體感官體驗。本研究發(fā)現，BM1處理煙葉的感官質量表現較差，可能是因為其成熟度不足，導致煙葉中的化學組分未達到理想的協調狀態(tài)。這與關輝等[26]研究結果一致。

生物堿類物質不但在植物的生理代謝過程中發(fā)揮作用，還對煙葉的品質產生影響[27]。向海英等[28]研究發(fā)現，大部分生物堿隨著煙葉成熟的增加逐漸累積，而少部分生物堿隨著煙葉的成熟含量逐漸降低，其中包括膽堿，這與本研究結果一致。本研究發(fā)現，在煙葉的成熟過程中甜菜堿含量呈現上調狀態(tài)。甜菜堿的增加可維持細胞的滲透平衡，緩解低溫傷害[29]，同時可提高烤煙葉片超氧化物歧化酶活性，促進滲透調節(jié)物質脯氨酸的積累，提高烤煙的抗旱能力[30]。

多胺是廣泛存在于植物體內的生長調節(jié)物質，在植物的生理過程中扮演著重要角色，其中亞精胺是較常見的一種[31]。多胺與植物抗逆性有關，在植物面臨各種逆境時，細胞內會積累大量多胺，這些多胺能夠對核酸酶和蛋白質酶的活性產生顯著影響，尤其是與抗逆性相關的保護酶，從而維護質膜和原生質的穩(wěn)定性，為植物組織提供保護作用，從而顯著增強植物對各種逆境的應對能力[32]。本研究表明，隨著煙葉成熟度的增加，其采收時間也相應的向后推遲，在采收后期出現的降雨、低溫等環(huán)境會導致煙葉中亞精胺含量的升高，從而提高煙葉的抗逆性。

氨基酸是煙草初級代謝的關鍵物質，在植物的生理活動中起重要作用[33]。研究表明，與蛋白質合成相關的多種氨基酸（谷氨酰胺、苯丙氨酸、絲氨酸、精氨酸等），隨著煙葉的成熟，其代謝物含量逐漸降低[36]，這與本研究結果一致。絲氨酸與煙堿含量呈顯著負相關，在煙草的代謝過程中，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路可能與煙堿的合成和分解過程有關，這些代謝通路可作為煙堿代謝的潛在調控通路[34]，這與本研究結果一致。本研究發(fā)現，芥子酸等香氣前體物質隨上部葉成熟度的增加而降低，這與楊洋等[22]研究結果一致。研究表明，天冬氨酸隨著煙葉的成熟呈上調趨勢，在氮素充足的環(huán)境中，三羧酸循環(huán)產物可以轉化為天冬氨酸，而天冬氨酸是合成生物堿的初始底物，因此生物堿含量也逐漸增加[35]。本研究發(fā)現，在煙葉成熟過程中甘油酸呈下調變化，谷氨酸與煙堿含量呈正相關關系，這些代謝物可能是控制煙草中煙堿合成和代謝的關鍵指標，這與賈中林等[36]研究結果一致。由此說明，隨著煙葉的成熟，初生代謝活動減弱，糖代謝、次生代謝活動增強，甘油酸含量下降對烤煙品質有促進作用，進一步支持了增加成熟度可提高煙葉品質這一研究結論。

本研究表明，BM2處理處于煙葉成熟變化的關鍵節(jié)點。根據非靶向代謝組學分析可知，上部煙葉成熟過程中的關鍵代謝物可能是馬泰樹脂醇、α-亞麻酸、刀豆氨酸、綠原酸、膽堿、肌酸、脫氧肌苷、葡糖二酸、甘油酸、鳥嘌呤、L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-色氨酸、丁香酚、尼古丁、油酸、棕櫚油酸、蕓香苷、山梨醇、丁香酸、創(chuàng)傷性酸、葫蘆巴堿、色胺酸、黃氧酸；關鍵代謝通路可能是氨基酸代謝、次生代謝物的生物合成、膜運輸、輔助因子代謝、轉化，其中甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸和丙氨酸代謝、苯丙烷類生物合成、天冬氨酸和谷氨酸代謝等通路在煙葉成熟過程中油分和香氣物質的形成起重要調控作用。