摘 要：本研究從湖南省7個主要花生種植區(qū)采集的新鮮花生根瘤進行根瘤菌分離、純化，共獲得7株根瘤菌菌株。分別以湖南地方花生品種安化小籽花生、常寧小籽花生為測試品種，通過溫室盆栽接種試驗進行篩選，7株根瘤菌均能在兩個花生品種上有效結(jié)瘤，其中R3-2、R4-6固氮能力最強。通過16S rDNA基因測序及序列比對，初步鑒定菌株R3-2屬于日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）。室內(nèi)耐酸試驗結(jié)果顯示，菌株R3-2具有一定的耐酸性能，在pH為 5.4 （含pHgt;5.4 ）的改良的Keyser和Munns培養(yǎng)基上生長良好，且具有一定的重金屬耐受性。在原生環(huán)境中進行的田間小區(qū)試驗結(jié)果表明，70%常規(guī)施氮量并接種R3-2根瘤菌的處理組花生生長最佳，產(chǎn)量比對照組（常規(guī)施氮無接種根瘤菌）提高28.54%。菌株R3-2在固氮的同時具有一定的抵抗土壤中氫離子和重金屬脅迫的能力，為我國南方花生栽培應(yīng)用根瘤菌提供了一種新的選擇。

關(guān)鍵詞：花生；日本慢生根瘤菌；耐酸；產(chǎn)量；生物固氮

中圖分類號：Q939.36" " " " " " " " " " 文獻標志碼：A" " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2025.01.006

Abstract： In this study， fresh peanut nodules were collected from seven major peanut growing areas in Hunan Province， and a total of 7 rhizobia strains were isolated and purified. The local peanut varieties Anhua small-seeded peanut and Changning small-seeded peanut varieties in Hunan Province were selected to test the capability of the 7 rhizobia strains by greenhouse pot inoculation experiments， and all 7 rhizobia strains could effectively form nodulation on the two peanut varieties， among which R3-2 and R4-6 showed the strongest nitrogen-fixing capability. Through 16S rDNA gene sequencing and sequence alignment， strain R3-2 was preliminarily identified as belonging to Bradyrhizobium japonicum. Further experiments demonstrated that the strain R3-2 had certain acid resistance and it grew well in modified Keyser and Munns medium while the pH is equal to 5.4 （including pHgt;5.4）， and holding a certain tolerance to heavy metals. Finally， field experiments were carried out in the native environment of R3-2， and the results showed that peanut yield of the treatment group with 70% conventional nitrogen application and R3-2 rhizobia inoculation was the highest， which was 28.54% higher than that of the control group which is with conventional nitrogen application without rhizobia inoculation. With the fine effect on nitrogen fixation， as well as its positive tolerances on hydrogen ion and heavy metals， strain R3-2 is the potential rhizobium utilized in peanut cultivation in southern China.

花生（Arachis hypogaea L.）是豆科一年生草本植物，我國三大傳統(tǒng)油料作物之一［1］。同時，花生也是全球繼大豆（Glycine max L.）、油菜（Brassica campestris L.）、向日葵（Helianthus annuus L.）之后的第四大食用油來源，第三大植物蛋白來源，花生仁平均含油45%～51%、蛋白質(zhì)25%、碳水化合物24.2% ［2］。氮是農(nóng)作物生長必需的三大元素之一，化學(xué)氮肥的施用為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)作出了巨大貢獻，但長期施用氮肥導(dǎo)致農(nóng)田土壤出現(xiàn)酸化、板結(jié)等問題，影響農(nóng)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展［3］。生物固氮是利用微生物自身固氮或微生物與植物共生固氮的模式將空氣中的氮氣轉(zhuǎn)化為植物可吸收的氮素形式，其中尤其以豆科植物和豆科根瘤菌的共生固氮效率最高［4］?；ㄉ鷮儆诙箍浦参铮ㄉc花生根瘤菌通過形成根瘤來固定空氣中的氮氣，為花生生長提供必需的氮素營養(yǎng)［5］。花生-根瘤菌共生固氮體系可以滿足花生生長所需氮量的50%左右，同時還可以改善土壤肥力，提高花生的產(chǎn)量和品質(zhì)［6］。Shang等［7］證明，花生接種慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）后顯著改變了其根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成，增加了潛在有益微生物的相對豐度，改變了根際細菌的共生網(wǎng)絡(luò)。

20世紀50年代開始，我國北方花生主產(chǎn)區(qū)開展了一系列花生高產(chǎn)栽培技術(shù)研究，包括高產(chǎn)品種選育、花生根瘤菌接種、科學(xué)施肥、拌種、起壟等高產(chǎn)種植管理技術(shù)，實現(xiàn)了花生的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)［5］。其中，1956—1985年，花生根瘤菌的研究和應(yīng)用取得重大進展，接種根瘤菌后平均每畝花生增產(chǎn)23.6 kg，增產(chǎn)率為13.4%［8］，在北方主產(chǎn)區(qū)獲得廣泛應(yīng)用。但是，豆科作物固氮效率在不同品種和不同菌系間差異很大。鄭永美等［9］利用同位素15N示蹤技術(shù)，探究了19個花生品種的根瘤固氮效率，發(fā)現(xiàn)不同花生品種的根瘤結(jié)瘤數(shù)和固氮量等存在顯著差異。豆科作物生物固氮效率是作物品種、菌系及品種與菌系互作的結(jié)果［10］，同時還受一系列外在因素如土壤氮素含量、酸堿度、水分、鉀肥、溫度、土壤類型、種植年限、種植方式（混播或單播）、土著根瘤菌系及其數(shù)量、菌劑接種技術(shù)措施等因素的影響［11］。熊煥燁［12］比較了遼寧省主栽的普通結(jié)瘤特性的花生品種農(nóng)花5號（NH5）和高效結(jié)瘤特性花生品種紅花16號（HH16）不同施氮量時接種根瘤菌的效果，施氮量為105 kg/hm2時效果顯著，過量施用氮肥（gt;135 kg/hm2）會抑制花生的生長。Zhao等［13］調(diào)查了酸性土壤對花生-慢生根瘤菌共生相互作用和根瘤的碳、氮代謝的影響，發(fā)現(xiàn)魯花11號和贛花5號在pH為5.0的土壤生長時，其生產(chǎn)性能、根瘤數(shù)、根瘤干重以及地上部和根部的氮含量均較低。El-Sherbeny等［14］研究表明，根瘤菌的施用策略對其增產(chǎn)效果影響較大，前茬花生秸稈還田配合接種慢生根瘤菌后增產(chǎn)效果最佳。Shao等［15］發(fā)現(xiàn)，花生長期連作降低了根瘤菌種群的多樣性，優(yōu)勢根瘤菌遼寧慢生根瘤菌（B. liaoningense）和渥太華慢生根瘤菌（B. ottawaense）得到了顯著富集。

研究表明，豆科根瘤菌的生長和結(jié)瘤對生存環(huán)境要求較高，通常情況下根瘤菌在中性或中堿性的土壤中結(jié)瘤固氮效果最好，而在酸性土壤中固氮結(jié)瘤效果較差［16］。中國南方花生主要種植于丘陵紅壤、黃壤，大部分土壤瘠薄，屬酸性甚至強酸性（pH 4.5～5.5）土壤，地力普遍偏低［17］，北方主產(chǎn)區(qū)篩選的花生根瘤菌在南方不具有競爭優(yōu)勢。湖南省花生種植區(qū)的土壤主要為酸性土壤，且生產(chǎn)上習慣種植的花生品種大多為具有地方特色和地域優(yōu)勢的地方品種，如安化小籽花生［18］、常寧小籽花生等［19］。從湖南本土的花生品種和酸性土壤環(huán)境下分離的自然結(jié)瘤的野生根瘤菌資源，再應(yīng)用到其原生環(huán)境中，比其他地域分離的根瘤菌具有更好的環(huán)境適應(yīng)性和更高的定殖結(jié)瘤率及固氮效率［20］。因此，本研究嘗試從湖南省本土主要花生種植區(qū)采集的新鮮花生根瘤進行根瘤菌分離，通過室內(nèi)盆栽試驗和田間試驗篩選出適宜我省土壤環(huán)境和本地品種的高效花生固氮菌株，為花生根瘤菌劑的開發(fā)提供菌種資源，實現(xiàn)化肥減量和農(nóng)業(yè)增效。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

7株花生根瘤菌為本課題組自湖南省宜章、資興、常寧、湘鄉(xiāng)、漣源、永順、安化等地花生新鮮根瘤中分離，分別是R1-3、R3-2、R4-6、R7、R8-3、R9-7-1、R9-7-2，置于20%甘油凍存管中-80℃保存。

1.2 供試花生品種

盆栽試驗選用安化小籽紅皮花生（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準的農(nóng)產(chǎn)品地理標志品種）和常寧小籽紅皮花生，田間小區(qū)試驗采用資興本地小籽花生。

1.3 培養(yǎng)基

花生根瘤菌的培養(yǎng)和分離純化采用酵母甘露醇瓊脂（yeast mannitol agar，YMA）培養(yǎng)基，各菌株培養(yǎng)液采用酵母甘露醇（yeast mannitol，YM）培養(yǎng)基，YMA中加溴麝香草酚藍（bromothymol blue，BTB）檢查細菌生長時的產(chǎn)酸或產(chǎn)堿反應(yīng)，花生溫室栽培采用液體微氮培養(yǎng)液，上述所有培養(yǎng)基配制方法均參照文獻［21］。

菌株耐酸性評估采用Graham等［22］改良的Keyser和Munns培養(yǎng)基，115℃蒸汽高壓滅菌15 min，冷卻至52℃，分別調(diào)節(jié)pH值為 5.0、5.4、6.0、6.5、7.0，倒入平板，冷卻至28℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 花生高效共生固氮菌株室內(nèi)盆栽篩選

選擇東北某公司花生根瘤菌產(chǎn)品中分離的菌株R6作為對照菌株，與上述7株供試菌株組成盆栽試驗菌株，同時設(shè)置不接種根瘤菌的空白，共9個處理，每處理3個重復(fù)，共27盆，隨機排列。

選飽滿、新鮮、無破損的花生種子，表面消毒后放入墊有濾紙并加無菌水潤濕的無菌培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)。待種子主根2 cm長時，在預(yù)先制備的OD600（600 nm波長處的光密度值）為0.6～1.0根瘤菌YM培養(yǎng)液中浸泡30 min，每苗1 mL根瘤菌培養(yǎng)液，浸泡完成后幼苗轉(zhuǎn)移到盛有滅菌蛭石和微氮培養(yǎng)液的組培盆（80 mm×95 mm）。對照用滅菌的YM培養(yǎng)液。每處理3個重復(fù)。組培盆外覆隔光膜，溫室放置15～28℃，采用全光譜植物生長光源，光照時間16 h/d。培養(yǎng)45 d收獲，測量并統(tǒng)計花生總結(jié)瘤數(shù)、植株的地上部分干重。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察和生化特征分析

按細菌鑒定手冊，對根瘤菌進行革蘭氏染色確定其革蘭氏屬性，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形狀和大??；同時在YMA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)特征。

在添加BTB的YMA培養(yǎng)基中觀察根瘤菌的產(chǎn)酸產(chǎn)堿屬性，通過盆栽進行花生的回結(jié)瘤試驗［23］，檢驗這些菌株與花生共生結(jié)瘤的能力。

1.5.2 分子鑒定

提取根瘤菌基因組DNA，利用引物27F/1492R 進行16S rDNA擴增，采用DNA膠回收試劑盒，通過瓊脂糖凝膠電泳回收目標DNA片段［20］，送湖南擎科生物技術(shù)有限公司測序。所測序列經(jīng)校對、拼接后與NCBI（National Center for Biotechnology Information）GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬的序列進行BLAST比較。利用軟件MEGA 11.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用自舉法（Bootstrap）評估分支可信度，Bootstrap取樣值大于1 000［21］。

1.6 根瘤菌R3-2菌株耐酸性室內(nèi)評估

采用室內(nèi)評估法對根瘤菌的pH耐受性進行初步評估。將菌株在YM培養(yǎng)液中28℃、150 r/min培養(yǎng)5 d，發(fā)酵液采用無菌水進行稀釋，至菌液濃度為2～4 CFU/μL。取25 μL上述稀釋菌液涂布在不同pH值的耐酸培養(yǎng)皿上，每處理5個重復(fù)。28℃培養(yǎng)7 d，觀察菌株生長情況。

1.7 根瘤菌R3-2菌株對多種重金屬的抗性測定

將根瘤菌在YM培養(yǎng)液中28℃、150 r/min培養(yǎng)5～7 d，取100 μL培養(yǎng)液涂布于含不同濃度K2Cr2O7、CdCl2、ZnSO4?7H2O、MnSO4?H2O、CuSO4?5H2O、Pb（NO3）2 和CoCl3 的YMA培養(yǎng)基上，以不添加任何重金屬的YMA平板為對照，每處理3個重復(fù)，28℃培養(yǎng)5～7 d［24］。根據(jù)平板上根瘤菌有無生長來評估各金屬的最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.8 田間小區(qū)試驗

試驗在湖南省資興市州門司鎮(zhèn)燕窩村前臺組進行，土壤為細沙壤土，pH為5.1，有機質(zhì)為44 g/kg，全氮為2.06 g/kg，堿解氮為153.6 mg/kg，有效磷為14.7 mg/kg，緩效鉀為544 mg/kg，速效鉀為29 mg/kg。供試菌株是根瘤菌R3-2和對照菌株R6。試驗設(shè)7個處理，每處理3個重復(fù)，隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積20 m2，共21個小區(qū)，總面積420 m2。處理1：Con（常規(guī)施肥量施肥）；處理2：50%NR3（常規(guī)施肥量的50%施肥，根瘤菌R3拌種）；處理3：50%NR6（常規(guī)施肥量的50%施肥，根瘤菌R6拌種）；處理4：70%R3（常規(guī)施肥量的70%施肥，根瘤菌R3拌種）；處理5：70%NR6（常規(guī)施肥量的70%施肥，根瘤菌R6拌種）；處理6：100%NR3（常規(guī)施肥量施肥，根瘤菌R3拌種）；處理7：100%NR6（常規(guī)施肥量施肥，根瘤菌R6拌種）。常規(guī)施肥量的N、P、K用量水平一致，分別按N、P2O5、K2O計算含量為15%－15%－15%，總施用量按375 kg/hm2進行。同時，田土翻耕前按750 kg/hm2標準施用鈣鎂磷肥。2022年4月22日播種，點播，穴間距20～25 cm，每穴3粒，出苗后間苗，每穴定苗2株。播種前用菌劑拌種，根瘤菌水劑用量每畝100 mL，菌數(shù)2×108 CFU/mL，先將菌劑與適量細土混合加適量水拌種、晾干，即拌即用。試驗地的田間管理同一般大田。

花生成熟后，2022年8月18日收獲，每小區(qū)單打單收測產(chǎn)，同時每一處理按五點隨機法取樣5穴共10株，分別測定株均根瘤數(shù)、株均瘤干重、飽果率、莢果產(chǎn)量（kg/hm2）。

1.9 試驗設(shè)計與統(tǒng)計分析

采用隨機區(qū)組的試驗設(shè)計，試驗結(jié)果采用新復(fù)極差多重比較法（Duncan’s new multiple range test，MRT）［25］。所有數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS statistics 17.0軟件完成［26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)盆栽篩選結(jié)果

2.1.1 總結(jié)瘤數(shù)

對分離的野生根瘤菌進行盆栽回接試驗，檢驗這些菌株與花生共生結(jié)瘤的能力。首先考察了總平均結(jié)瘤數(shù)，由表 1、圖1可知，兩種花生品種接種不同根瘤菌菌株后均能有效結(jié)瘤，不同菌株在同一品種上的總平均結(jié)瘤數(shù)存在差異，且不同菌株在兩種花生上的總平均結(jié)瘤數(shù)的排列順序呈現(xiàn)相同的趨勢，結(jié)瘤數(shù)由低到高依次為R9-7-2、R9-7-1、R3-2、R4-6、R6、R1-3、R7、R8-3。其中R8-3在常寧花生和安化花生兩個品種上的結(jié)瘤數(shù)最高，分別為173.0±8.7和201.3±34.5，顯著高于其他菌株，其次為菌株R7，在兩個品種上的結(jié)瘤數(shù)分別達到133.3±23.5和135.3±24.0，顯著高于除R8-3之外的其他菌株，表明這兩株菌在這兩個品種上的結(jié)瘤能力最強。其他菌株之間的結(jié)瘤數(shù)部分有顯著差異，且兩種不同的花生品種上的差異性也不一致。

2.1.2 地上部分干重

花生地上部分干重是間接反映固氮能力的指標，為此我們測定了所有盆栽試驗各處理組的地上部分干重。結(jié)果如表2、圖1a所示，不同花生接種不同菌株后地上部分干重差異很大。各處理組常寧花生的地上部分干重從小到大依次為Con、R9-7-2、R9-7-1、R7、R8-3、R1-3、R6、R3-2、R4-6，而安化花生的不同處理組地上部分干重從小到大依次為R8-3、R7、Con、R9-7-1、R9-7-2、R1-3、R4-6、R6、R3-2。對比結(jié)瘤數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)瘤能力強的菌株并未表現(xiàn)出相應(yīng)的高固氮能力，具體表現(xiàn)在R8-3、R7總結(jié)瘤數(shù)遠高于其他菌株（圖1b），而相對應(yīng)兩個花生品種的地上部分干重卻都不是最高的，甚至R7菌株在安化花生上接種后地上部分干重居于所有菌株的最低水平。而R4-6、R6、R3-2三個菌株，卻在兩種花生品種的地上部分干重上都表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。商業(yè)菌株R6作為東北地區(qū)的優(yōu)勢菌株，也在此次室內(nèi)盆栽試驗中表現(xiàn)了優(yōu)良的固氮性能。因此，通過地上部分干重，初步確定有潛力的優(yōu)勢菌株為R4-6、R3-2。

2.2 根瘤菌R3-2菌株鑒定

在盆栽回接試驗的基礎(chǔ)上，選擇1株固氮優(yōu)勢菌株R3-2進行菌種鑒定試驗。

首先對根瘤菌R3-2進行形態(tài)鑒定，結(jié)果如圖2所示，菌體細胞呈桿狀、不直，革蘭氏染色陰性，菌體大小為（0.5～0.9）μm×（1.2～3.0）μm。在YMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后菌落圓形，凸起，半透明，乳白色，直徑1～2 mm， 好氧生長，在添加BTB的YMA培養(yǎng)基上產(chǎn)堿。

以菌株R3-2基因組DNA為模板，利用引物27F/1492R對其16S rDNA基因序列進行擴增和測序，獲得了長度為1 366 bp的序列，并提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫，基因登錄號為PP956620。在NCBI數(shù)據(jù)庫中經(jīng)過BLAST比對后，結(jié)果表明，該菌株的16S rDNA序列與日本慢生根瘤菌（B. japonicum）序列的相似度為99.71%。進一步選擇部分相似度較高菌株的16S rDNA序列，利用MEGA 11.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果表明，菌株R3-2與多株日本慢生根瘤菌（B. japonicum）聚類在一起，處于一個分支， 初步將該菌鑒定為日本慢生根瘤菌（B. japonicum）。

2.3 根瘤菌R3-2菌株耐酸性室內(nèi)評估

由于南方花生產(chǎn)區(qū)的土壤主要為酸性土壤，需要對花生根瘤菌對酸性的適應(yīng)性進行測定［17］。結(jié)果如圖4所示，R3-2具有一定的耐酸性能，在pH 為5.4至弱酸性的改良的Keyser和Munns培養(yǎng)基仍生長良好，但在pH為4.8的培養(yǎng)基上不能生長。

2.4 根瘤菌對多種重金屬的抗性測定

由于南方花生產(chǎn)區(qū)的部分土壤重金屬含量較高，需要對花生根瘤菌對重金屬的耐受性進行測定。結(jié)果如表3所示，R3-2對K2Cr2O7、CdCl2、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、Pb（NO3）2、CoCl3等多種重金屬都具有一定的抗性。

2.5 田間小區(qū)試驗

選取固氮和耐酸能力較強的R3-2菌株在其分離的田塊進行田間小區(qū)試驗，收獲后每處理組隨機取樣5穴共10株，分別測定根瘤數(shù)、瘤干重、地上部分干重、飽果率、莢果每公頃產(chǎn)量（kg/hm2）。結(jié)果如表4所示，在田間小區(qū)試驗中，R3-2菌株和商業(yè)菌株R6在不同施氮量的處理組中都能與花生正常結(jié)瘤，平均每株結(jié)瘤數(shù)量都維持在較高的水平［（129.0～198.7）個/株］，其中平均結(jié)瘤數(shù)最高的處理組為100R6組，達到（198.7±15.5）個/株。各處理組平均瘤干重雖然也呈現(xiàn)一定的差異性，但差異經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，不顯著。產(chǎn)量方面，3個不同施氮水平下接種R3-2菌株處理組的產(chǎn)量都高于接種商業(yè)菌株R6處理組。其中70R3組（70%施氮量接種R3-2處理組）花生產(chǎn)量最高，折合產(chǎn)量達到（2 722.3±196.67） kg/hm2，顯著高于70R6組（70%施氮量接種R6處理組）和其他處理組（Plt;0.05），該處理組比對照組Con增產(chǎn)28.54%，比70R6組增產(chǎn)14.20%；其次為100R3組（100%施氮量接種R3-2處理組），產(chǎn)量比對照組Con增加13.88%（Plt;0.05），比100R6組增產(chǎn)6.59%；50R3組（減氮50%后接種R3-2處理組）花生產(chǎn)量與對照組Con（100%施氮量）相當，比50R6組（減氮50%后接種R6處理組）產(chǎn)量高6.11%，其差異不顯著。

上述結(jié)果表明，R3-2菌株的增產(chǎn)性能優(yōu)于北方商業(yè)菌株R6，接種R3-2菌株能減少氮肥用量50%，在減少30%氮肥用量的情況下同時接種R3-2菌株能獲得較高的花生產(chǎn)量。

3 討論

3.1 花生根瘤菌在原生環(huán)境中的生物適應(yīng)性和競爭優(yōu)勢

為提高根瘤菌對本土環(huán)境的適應(yīng)性，本研究從湖南采集的花生根瘤中分離到了7株根瘤菌。分別以湖南地方花生品種安化小籽花生、常寧小籽花生為測試品種，通過溫室盆栽接種試驗進行篩選，7株根瘤菌均能在兩個花生品種上有效結(jié)瘤，其中R3-2、R4-6固氮能力最強。本研究通過實驗室內(nèi)栽培和田間小區(qū)試驗結(jié)果，表明菌株R3-2具有很好的耐酸、固氮、增產(chǎn)性能，還具有一定的重金屬抗性，是一株綜合性能優(yōu)良、能夠適應(yīng)我國南方酸性土壤花生栽培的優(yōu)良花生根瘤菌株。雖然室內(nèi)栽培試驗時選自東北的R6菌株與R3-2比較沒有顯著差異，但在酸性土壤的田間試驗中，R3-2優(yōu)勢凸顯，減氮30%后仍增產(chǎn)28.54%，同等情況下R6僅增產(chǎn)12.56%，甚至在減氮50%時接種R6出現(xiàn)減產(chǎn)（-4.82%），表明在原生環(huán)境下R3-2具有顯著的生物適應(yīng)性和競爭優(yōu)勢。這一結(jié)果和目前許多通過從本土分離根瘤菌提高對環(huán)境適應(yīng)性和競爭力的報道是一致的。例如，Jovino等［27］通過田間試驗證明，接種本土分離的Bradyrhizobium sp. ESA 123分別使豆莢和花生粒產(chǎn)量提高了9.3%～44.1%、14.5%～51.3%，比廣泛應(yīng)用的商業(yè)化菌種B. elkanii SEMIA 6144結(jié)瘤效果更好。El-Sherbeny等［14］施用植物殘體和本土慢生根瘤菌顯著提高了花生鮮重和干重、莢重和種子重及生物產(chǎn)量。杜普旋等［28］從廣東省本土分離篩選出了1株共生固氮性狀優(yōu)良的花生根瘤菌GDHS-5，屬于慢生根瘤菌屬，這個菌株具有廣譜結(jié)瘤性，田間試驗表明，接種GDHS-5分別使單株莢果數(shù)和產(chǎn)量顯著增加35.82%、9.92%。劉鵬［17］從福建不同酸性土壤種植區(qū)域的花生根瘤中分離到4株固氮效率較高的根瘤菌，田間試驗表明，接種根瘤菌后花生生物量分別提高了33.6%、37.7%、38.0%和27.1%，花生產(chǎn)量提高了24.7%～104.2%，增產(chǎn)最高的為FAMB12-6菌株。劉瑞瑞等［29］以采自河北省保定市淶水縣的花生根瘤為原材料，成功篩選出可與該種花生高效固氮的優(yōu)良菌株，接種Hbu074005菌株效果最佳，花生植株干質(zhì)量較對照組提高52.29%，其結(jié)瘤數(shù)、果穗數(shù)、植株株高等指標也明顯優(yōu)于對照組及其他處理，分別較對照組提高235.56%、112.00%、31.31%。與這些菌株相比，本研究分離的R3-2菌株是從湖南本土分離的耐酸能力強的菌株，能在pH為5.4的培養(yǎng)基上生長，同時還有耐受重金屬的性能，且由于該菌株分離自本地花生品種，其在原生環(huán)境中的田間應(yīng)用效果表現(xiàn)非常穩(wěn)定，對于湖南本地花生品種的高效種植具有較大的應(yīng)用潛力。

3.2 花生根瘤菌的種群多樣性

本研究從湖南地方品種中采集的花生根瘤中分離到優(yōu)異根瘤菌R3-2，通過16S rDNA基因測序及序列比對，初步鑒定為日本慢生根瘤菌（B. japonicum）。當前已報道從花生根瘤中分離到的根瘤菌具有一定的種群多樣性，如Chen等［30］調(diào)查了廣東省花生根瘤菌的多樣性和地理分布，分離到的216株在屬水平都屬于慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium），在種水平可以歸屬為22個種，其中占比高的14個種都為新種，還包括日本慢生根瘤菌（B. japonicum）、重氮慢生根瘤菌（B. diazoefficiens）、圓明園慢生根瘤菌（B. yuanmingense）、花生慢生根瘤菌（B. arachidis）、廣東慢生根瘤菌（B. guangdongense）、廣西慢生根瘤菌（B. guangxiense）、西表島慢生根瘤菌（B. iriomotense）和遼寧慢生根瘤菌（B. liaoningense）等8個已知種。Paudel等［31］從花生根瘤中分離到了一株慢生根瘤菌Lb8 初步鑒定為重氮慢生根瘤菌（B. diazoefficens），并證明水平基因轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)座子等DNA元件的插入為根瘤菌基因組帶來了可塑性。Bouznif等［32］嘗試研究來自不同地理區(qū)域的許多不同野生和栽培豆類物種相關(guān)的慢生根瘤菌的系統(tǒng)地理學(xué)，對67株來自花生的慢生根瘤菌基因組序列（絕大部分來自中國，1株來自印度）進行系統(tǒng)進化分析，表明從中國分離的花生根瘤菌跟非參考菌株聚在一類，說明這些菌株的來源還不清楚，但這些菌株跟大豆中分離的根瘤菌具有高度的相似性。Zhang等［33］從河南正陽采集的花生根瘤中分離、鑒定了3株慢生根瘤菌新種，定名為正陽慢生根瘤菌（B. zhengyangense sp. nov.）。Li等［34］從廣東采集的花生根瘤中分離鑒定了3個慢生根瘤菌新種 ，定名為南寧慢生根瘤菌（B. nanningense sp. nov.）、 廣州慢生根瘤菌（B. guangzhouense sp. nov.）和湛江慢生根瘤菌（B. zhanjiangense sp. nov.）。本研究從湖南本土分離出的花生根瘤菌的遺傳多樣性與上述研究結(jié)果相符，同時也表明慢生根瘤菌是與花生共生結(jié)瘤固氮的主要根瘤菌類群。

3.3 花生根瘤重量與植株產(chǎn)量的相關(guān)性

本研究在盆栽試驗中發(fā)現(xiàn)，R8-3的結(jié)瘤水平最高，但它處理后的花生地上部分干重卻低于其他結(jié)瘤水平中等的R3-2和R4-6，尤其是處理安化花生品種后，地上部分干重顯著低于R3-2和R4-6處理后的花生（Plt;0.01）。酸性田間土壤的田間小區(qū)試驗也發(fā)現(xiàn)，三種不同施氮水平下，北方商業(yè)化根瘤菌R6的根瘤干重均大于本土分離的R3-2，部分處理的根瘤數(shù)也大于R3-2處理，但是R3-2處理后的花生產(chǎn)量則均高于R6處理，尤其是在70%施氮量下，差異達到顯著水平（Plt;0.05）。這些結(jié)果說明，根瘤菌在花生上形成的根瘤數(shù)和根瘤重量與植株生長和產(chǎn)量不呈現(xiàn)正相關(guān)，該結(jié)果與前人報道的根瘤菌鮮重與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)［35］的結(jié)論不同。分析原因，可能是由于根瘤的產(chǎn)生需要消耗大量的能量和光合代謝產(chǎn)物，本土菌株R3-2在進化過程中與原生寄主形成了更優(yōu)的共生機制，對原生環(huán)境中的生長環(huán)境因素如光照強度、土壤氮濃度、溫濕度、土著微生物群落等更加適應(yīng)，能夠?qū)⒏龅闹亓靠刂圃诤侠淼乃?，表現(xiàn)了更好的根瘤生產(chǎn)經(jīng)濟性，而北方的R6菌株應(yīng)用到南方非原生環(huán)境中后，土壤更低的氮素水平、pH等因素，刺激菌株做出對環(huán)境的競爭性響應(yīng)，表現(xiàn)出根瘤超量，從而過多消耗寄主光合作用的產(chǎn)物，影響了寄主自身生長和花生生產(chǎn)。這些結(jié)果同時提示我們，優(yōu)異根瘤菌的評價標準不應(yīng)以結(jié)瘤數(shù)量和根瘤重量為主要衡量指標，而應(yīng)根據(jù)結(jié)瘤水平并結(jié)合產(chǎn)量指標來進行綜合評價。

綜上所述，我們從湖南本土花生中分離到了一株日本慢生根瘤菌R3-2，該菌株在原生環(huán)境中展現(xiàn)出了優(yōu)異的增產(chǎn)性能，具有很好的推廣應(yīng)用前景。該菌株的田間小區(qū)試驗?zāi)壳皟H在原生環(huán)境和原生寄主進行，后續(xù)將進一步研究和考察它在湖南其他地區(qū)和其他花生品種上是否有同樣的優(yōu)勢。

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收稿日期：2024-07-12；修回日期：2024-08-16。

基金項目：長沙市自然科學(xué)基金項目（kq2208130）；國家自然科學(xué)基金項目（32000047）；湖南省技術(shù)攻關(guān)“揭榜掛帥”項目（2021NK1040）。

作者簡介：陳海榮，高級農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)用微生物研究及開發(fā)。

*通信作者：劉宇波，高級工程師，主要從事農(nóng)用微生物研究及開發(fā)。E-mail： lyubo123@163.com。