摘 要：隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖逐漸從散養(yǎng)和農(nóng)戶向規(guī)?；s化發(fā)展，養(yǎng)殖場對于精液的需求量越來越大，對于精液品質(zhì)的要求越來越高，對于精液的保存技術(shù)要求也同樣越來越高。在過去的幾十年里，使用凍融精液進(jìn)行人工授精在國內(nèi)畜牧生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。因此，本文對精液冷凍保存技術(shù)及其原理、精液的特點(diǎn)、公羊的精液冷凍保存及影響因素作一綜述。

關(guān)鍵詞：公羊；精液；冷凍保存

在全球范圍內(nèi)，當(dāng)前人類對動(dòng)物蛋白的需求不斷增長，這導(dǎo)致在畜牧飼養(yǎng)和管理方面要盡可能地高效生產(chǎn)。面對不斷增長的全球人口，提高動(dòng)物食品生產(chǎn)的效率、增加羊肉生產(chǎn)量和可持續(xù)性至關(guān)重要，因此，提高羊的生育率對于解決這一問題至關(guān)重要。人工授精和精液冷凍保存技術(shù)對所生產(chǎn)羊的數(shù)量和質(zhì)量有相當(dāng)大的有利影響?？茖W(xué)家最初在17世紀(jì)引入了精液冷凍保存技術(shù)。精液冷凍保存技術(shù)是畜牧育種的有力工具，目前已經(jīng)做出了一些努力來提高不同反芻動(dòng)物的精子冷凍保存效率。因此，研究公羊的精液冷凍保存技術(shù)對于精液的保存和精子存活率具有重要的意義，對于公羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展也具有積極的促進(jìn)作用。

1 精液冷凍保存技術(shù)

精液的冷凍保存是保持人和動(dòng)物生育能力的重要生殖技術(shù)。精液冷凍保存技術(shù)指的是將經(jīng)過一定條件處理的新鮮精液儲存于超低溫度環(huán)境（干冰、液氮等）下以延長精子存活時(shí)間的技術(shù)，在這一過程中，精子的代謝會(huì)幾乎完全停止并進(jìn)入休眠狀態(tài)，當(dāng)溫度回升時(shí)，精子又可以恢復(fù)代謝水平并具備受精能力[1]。精液冷凍保存技術(shù)的基本原理是在超低溫環(huán)境下，儲存于冷凍保護(hù)劑的精液會(huì)發(fā)生凝固形成不規(guī)則的玻璃樣固體，保持精液液態(tài)時(shí)正常的分子和離子分布，對精子細(xì)胞起到保護(hù)作用。精液冷凍保存中的結(jié)晶態(tài)會(huì)對精子造成不可逆的傷害，對細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器造成不可逆的機(jī)械性損傷，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但當(dāng)溫度迅速降到玻璃態(tài)時(shí)可以避免結(jié)晶態(tài)對精子造成的不可逆損傷[2]。精液冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用不僅能夠保證精子的長期儲存、維持受精能力、方便精液運(yùn)輸，還可以提高優(yōu)秀種公畜精子的利用率，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。在冷卻和冷凍階段，細(xì)胞暴露于以下壓力源：代謝解耦、能量損失、膜相變、細(xì)胞骨架失穩(wěn)、自由基或活性氧（ROS）的產(chǎn)生，所有這些壓力源都有可能對精子造成傷害。

2 公羊精液的特點(diǎn)

成年公羊的睪丸重量在120～150 g之間，公羊的精液由精清和精子構(gòu)成，其1次射精量可達(dá)0.2～2.4 mL，精子活力一般為50%～90%，密度約為20億～30億/mL，公羊的射精量、射精密度、精子活力等通常會(huì)受到公羊品種、采精時(shí)間、采精月份等因素的影響。新鮮的精液通常呈乳白色，精子分為頭、頸、尾3個(gè)部分，頭部為橢圓形，尾部細(xì)長，正常的精子整體結(jié)構(gòu)完整、活力較強(qiáng)、大多呈直線運(yùn)動(dòng)，而異常的精子會(huì)出現(xiàn)中段卷曲、雙尾、線粒體鞘脫落、尾部缺失等情況[3]。

3 精液冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用

精液的冷凍保存對牲畜的生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量具有重要的積極影響，優(yōu)良種公畜的精子通過使用精液冷凍保存和人工授精技術(shù)，可以為世界各地成千上萬的母畜進(jìn)行授精。在不同的動(dòng)物物種中，特別是在反芻動(dòng)物中，已經(jīng)描述了精液冷凍保存技術(shù)的各種保護(hù)劑和冷凍程序，以盡量減少冷凍保存對精子活力、形態(tài)、質(zhì)膜、頂體的有害影響。精子對冷凍保存的反應(yīng)在同一物種的個(gè)體雄性以及不同物種之間有所不同，一般來說，與其他物種相比，小型反芻動(dòng)物的精子對冷凍保存極為敏感。此外，公羊精液的冷凍保存非常具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗懈邼舛鹊闹久?，該成分可能與冷凍保存稀釋劑的常見成分（如卵黃）相互作用。由于公羊精液的這種特殊成分，需要特別注意解凍后精子參數(shù)。

4 公羊精液的保存

4.1 短期保存

精液的短期保存包括常溫保存和低溫保存兩種方法。常溫保存常適用于精液采集后立即進(jìn)行人工授精的情況，要求間隔時(shí)間比較短暫，需及時(shí)進(jìn)行人工授精[4]。精子的主要營養(yǎng)物質(zhì)來源于精清，通過糖降解和精子呼吸利用果糖和有機(jī)酸產(chǎn)生ATP以滿足精子活力所需能量及維持精子其他生理活動(dòng)，未經(jīng)稀釋的精液，在體外很快就會(huì)因?yàn)槟芰亢慕甙l(fā)生死亡。精液低溫保存是一種較簡單、保存效果相對較好的短期保存精液的方法。低溫保存需要在添加稀釋液后將精液從體溫緩慢下降到5 ℃的平衡狀態(tài)，該方法保存時(shí)間可達(dá)24～48 h，該保存方法需要公畜在采精后立即用稀釋液進(jìn)行稀釋，隨后保存在0～5 ℃環(huán)境中。該方法雖然添加稀釋液，但也會(huì)對精子的存活率產(chǎn)生影響。

4.2 長期保存

精液的長期保存通常采用超低溫冷凍保存技術(shù)，一般包括以下幾個(gè)步驟：精液稀釋、添加冷凍保護(hù)劑、降溫凍結(jié)及解凍。在精液中添加配制好的稀釋液既能夠增加精液的容量，還能延長保存時(shí)間，稀釋液由特定的組分配制而成，其主要的作用就是為精子存活提供營養(yǎng)物質(zhì)，維持適宜的pH值、滲透壓和電解質(zhì)平衡，增強(qiáng)精子的抗性。添加冷凍保護(hù)劑可以保護(hù)精子在冷卻和冷凍過程中免受低溫?fù)p傷。

5 公羊精液冷凍保存技術(shù)的影響因素

5.1 精液采集

精液采集的目的是從每次射精中獲得最大量的精子細(xì)胞。在小反芻動(dòng)物中，精液主要通過人工陰道（AV）或電射精（EE）方法收集。通常情況下AV采集精液是綿羊的首選方法，AV精液采集方法更簡單、更合適，產(chǎn)生的精液質(zhì)量與自然精液相當(dāng)。但是AV采集精液適用于性欲良好的公羊，并且需要事先進(jìn)行AV射精訓(xùn)練。然而，EE方法消除了對公羊訓(xùn)練的需要，能夠快速促進(jìn)射精，最重要的是，也可以收集受傷或性欲弱的優(yōu)良種公羊的精子，但該方法也會(huì)存在一些缺點(diǎn)，違背動(dòng)物福利的要求，對動(dòng)物造成壓力。與EE方法相比，AV法在公羊精液采集中產(chǎn)生的精液量、精子濃度、精子總數(shù)、正常精子百分比和波動(dòng)率略高。精液采集方法對精清的成分以及精子的體積和特征都會(huì)有影響，綿羊中AV收集的精子比EE收集的精子更能抵抗冷休克[5]。因此，在進(jìn)行精液冷凍保存時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的精液采集方法。

5.2 精液稀釋劑

稀釋劑是用于增加射精量和盡可能長時(shí)間保持精子繁殖能力的介質(zhì)，精液稀釋劑作為提供營養(yǎng)物質(zhì)的來源，可以保護(hù)細(xì)胞免受溫度相關(guān)的損傷，防止pH值變化，抑制細(xì)菌生長，并在保存過程中保護(hù)精子細(xì)胞。精液稀釋是用適當(dāng)?shù)南♂寗┌匆?guī)定的比例進(jìn)行，以確保用于授精的精液體積在每次劑量中有足夠的精子，有高生育能力而不丟失細(xì)胞。稀釋劑應(yīng)具有低鹽效應(yīng)、低緩沖濃度、低溫效應(yīng)、良好的陽離子相互作用、較高的離子強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性等特點(diǎn)。稀釋劑成分也會(huì)影響精子質(zhì)量和保持精子受精能力的有效時(shí)間。公羊常用精液的稀釋劑包括檸檬酸鹽、卵黃和葡萄糖或果糖等單糖以及基于二糖、三糖、復(fù)合多糖和甘油的各種冷凍稀釋劑。在精液稀釋時(shí)，使用甘油讓精子平衡數(shù)小時(shí)可以提高解凍后精子的運(yùn)動(dòng)能力和生育能力。除此之外，還會(huì)在稀釋劑中加入特定的成分，例如，使用大豆卵磷脂代替可以避免微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。在稀釋劑中添加海藻糖或棉子糖可提高其冷凍保護(hù)活性。

5.3 冷凍保護(hù)劑

添加冷凍保護(hù)劑是精液冷凍保存成功的關(guān)鍵因素。精子周圍的環(huán)境是冷凍保存的精子維持其功能完整性的一個(gè)關(guān)鍵因素，在進(jìn)行精液冷凍保存時(shí)，必須為精子提供足夠的能量、適宜的pH值、滲透壓和離子強(qiáng)度條件，最大限度地減少導(dǎo)致精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷的物理變化。在大多數(shù)物種中，精子冷凍保存液由緩沖液（Tris）、非滲透性冷凍保護(hù)劑（海藻糖、葡聚糖、乳糖）、可滲透性冷凍保護(hù)劑（甘油）、能量來源（葡萄糖）和其他添加劑（抗生素、維生素和抗氧化劑）組成。冷凍保護(hù)劑可防止溫度降低時(shí)形成冰晶，并最大限度地減少冷休克的影響，冷休克的發(fā)生最終會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能改變。甘油作為一種有效的冷凍保護(hù)劑，具有細(xì)胞外效應(yīng)，可以很好地保持精子功能和DNA完整性，可以防止精子冷休克，保持精子的運(yùn)動(dòng)能力，防止頂體酶丟失，并保持其線粒體膜完整。有研究表明，在精液稀釋劑中添加維生素、黃芩素、綠原酸、白藜蘆醇等抗氧化劑可以提高凍融后公羊精子細(xì)胞的漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)性和染色質(zhì)完整性，提高冷凍精液的能量代謝，降低凋亡率[6]。因此，在進(jìn)行公羊精液冷凍保存時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況加入不同的抗氧化劑等保護(hù)劑。

5.4 精液解凍

解凍是凍結(jié)的逆轉(zhuǎn)過程，在這一過程中精液由固態(tài)轉(zhuǎn)化為正常的液態(tài)。冷凍保存方法和隨后的解凍都會(huì)對精子細(xì)胞的存活產(chǎn)生影響。精子質(zhì)量在冷凍和解凍過程中會(huì)受到損害，因?yàn)榫蛹?xì)胞會(huì)暴露在兩個(gè)關(guān)鍵溫度區(qū)：一是在冷卻至-196 ℃期間，二是在解凍時(shí)。升溫階段（解凍）對精子的生存至關(guān)重要，與精液凍融過程中冷凍期間的初始冷卻階段一樣重要，當(dāng)精子快速解凍時(shí)，它們會(huì)在短時(shí)間內(nèi)暴露在濃縮的溶質(zhì)和冷凍保護(hù)劑中，細(xì)胞內(nèi)外平衡的恢復(fù)速度比緩慢解凍時(shí)要快。與緩慢解凍（35 ℃，12 s）相比，快速解凍（70 ℃，5 s）可提高解凍后精子的活力和膜完整性。因此，為了獲得最佳的精子細(xì)胞存活率，必須根據(jù)不同的冷凍速率調(diào)整精液解凍速率[7]。

結(jié)語

關(guān)于公羊精液的保存，由于綿羊、山羊等的品種不同，其精液的許多生理學(xué)特性不同，精液體外保存及維持活力需要的條件也不同，因此，在精液冷凍保存技術(shù)研究發(fā)展過程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況采取不同的措施以增強(qiáng)精子抗凍能力?？傊趯?shí)際生產(chǎn)中應(yīng)建立規(guī)范的冷凍—解凍技術(shù)，努力研發(fā)更高效的冷凍保護(hù)劑，克服精液冷凍保存過程中的困難，提高凍精品質(zhì)，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。

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