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[摘要]以紫花苜蓿無菌苗的莖段為外植體，通過正交試驗，得到了以改良SH(SH大量元素+B5微量元素)+2,4-D1.5mg／L+KT1.0mg／L，蔗糖濃度為3％的培養(yǎng)基為最佳的脫分化培養(yǎng)基，最佳的胚狀體培養(yǎng)基為改良SH+KT0.5mg／L．蔗糖濃度為2％，并建立了紫花苜蓿的高效再生體系，為后續(xù)外源基因的導入奠定了良好的基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]紫花苜蓿胚狀體再生體系石蠟切片

隨著生命科學的發(fā)展，利用植物生物反應(yīng)器即通過基因工程途徑，以常見的農(nóng)作物作為“化學工廠”，通過大規(guī)模種植生產(chǎn)具有高經(jīng)濟附加值的醫(yī)用蛋白、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂類及其它一些次生代謝產(chǎn)物等生物制劑的方法，越來越受到全世界各國科學家的重視，新功能基因的分離、克隆手段逐步完善，很多功能性狀很好的基因被分離、克隆，但是目前受體系統(tǒng)高效再生體系不是十分理想，直接制約著生物反應(yīng)器的發(fā)展。本文介紹了紫花苜蓿的高效再生體系建立的方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)無菌苗的莖段，紫花苜蓿種子由吉林農(nóng)業(yè)大學生物技術(shù)學院提供。

1.2試驗方法

1.2.1愈傷組織的誘導：將飽滿的紫花苜蓿種子在滅菌蒸餾水中浸泡40分鐘后，用0.1％HgCl₂溶液消毒20分鐘，無菌水洗3-5次，接種在1／2MS培養(yǎng)基上，置于(23±2)℃下培養(yǎng)。光照強度為15001x，光照周期為12小時光照12小時黑暗。培養(yǎng)6天左右，待植株長至4～5厘米時取出植株，將莖段切成5毫米左右的小段接種到脫分化培養(yǎng)基上，進行愈傷組織的誘導，先在相同的激素條件下從MS、B5、N6、改良SH和white這5種基本培養(yǎng)基中篩選出最適合紫花苜蓿脫分化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再以這種培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選出最適合的激素種類與濃度的組合，從而確定最佳的脫分化培養(yǎng)基，為此本試驗決定采用設(shè)計一個4因素5水平的正交試驗，并通過SPSSl2.0分析以確定最佳的激素組合和濃度，各因素及相應(yīng)水平(詳見表1)。

1.2.2胚狀體的獲得：將使用上述方法培養(yǎng)的外植體材料培養(yǎng)25天左右，轉(zhuǎn)入胚狀體培養(yǎng)基中，同樣以正交試驗的方法來確定最佳的激素濃度與種類的組合。根據(jù)前面的試驗，設(shè)計3因素5水平的正交試驗，各因素及相應(yīng)水平(詳見表2)。

1.2.3再生植株：將剝離后，接到1／2MS上進行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)15天左右，大部胚狀體可長出不定芽及4～5條粗根。煉苗，打開瓶蓋室溫放2天，小心取出幼苗用自來水將根部的培養(yǎng)基洗掉，再移至花盆中(蛭石：營養(yǎng)土：灰土=1:1:1)培養(yǎng)，即可獲得再生植株。

1.2.4石蠟切片的制作

FAA固定液配方：福爾馬林5mL，冰醋酸5mL.70％酒精90mL。

蘇木精染色劑配方：0.5g蘇木色精+10m195％酒精+90ml蒸餾水+2滴H₂O₂。

取不同發(fā)育階段的愈傷組織，F(xiàn)AA固定1～2天→30％酒精過夜→50％酒精2小時→75％酒精2小時→85％酒精3小時→95％酒精3小時→純酒精2小時兩次→1／2純酒精+1／2二甲苯過夜→純二甲苯2小時兩次→加碎蠟(不斷加入)→45℃烘箱放置過夜(直到碎蠟達飽和為止)→60℃烘箱放置4小時→過純蠟3小時兩次→包埋→修蠟塊→切片機切片→梅氏蛋白粘片→烘干備用。

制作好的切片自然干燥數(shù)天后就可進行脫蠟、染色。步驟如下：二甲苯脫蠟10分鐘兩次→1／2二甲苯+1／2酒精10分鐘→純酒精10分鐘兩次→95％酒精5分鐘→85％酒精5分鐘→70％酒精5分鐘→50％酒精5分鐘→30％酒精5分鐘→蒸餾水1分鐘→4％鐵礬溶液1小時→蒸餾水5分鐘→0.5％蘇木精染色30～40分鐘→餾水沖洗→4％鐵礬溶液浸泡2分鐘→50％酒精5分鐘→70％酒精5分鐘→85％酒精5分鐘→95％酒精5分鐘→純酒精10分鐘兩次→二甲苯10分鐘兩次→中性樹膠封片→烘箱烘干(溫度不可過高)→石蠟切片照相觀察。

2結(jié)果與分析

2.1最佳培養(yǎng)基的確定

由表3可知，最適合紫花苜蓿脫分化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為改良的SH培養(yǎng)基，即SH無機物+MS有機物。

2.2脫分化培養(yǎng)基中激素濃度與種類的最佳組合：本試驗以紫花苜蓿無菌苗的新生莖段為外植體，根據(jù)正交設(shè)計表在同一基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加相應(yīng)的激素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫分化發(fā)生的時間和發(fā)生率均有所不同，試驗結(jié)果經(jīng)SPSS12.0統(tǒng)計軟件的LSD分析，以愈傷組織的誘導率為考察指標表明，改良SH+2,4-D1.5Smg／L+KT1.0mg／L，蔗糖濃度為3％的培養(yǎng)基應(yīng)該為最佳的脫分化培養(yǎng)基。為驗證試驗的準確性隨機選擇正交試驗中的3組培養(yǎng)基與最佳培養(yǎng)基進行比較實驗，(詳見表4)中的數(shù)據(jù)表明改良SH+2,4-D1.5mg／L+KT1.0mg／L蔗糖濃度為3％的培養(yǎng)基確為最佳的脫分化培養(yǎng)基。

試驗發(fā)現(xiàn)在不添加2,4-D，蔗糖濃度為2％時，愈傷組織生長狀態(tài)較好，有時還能分化出同時具有根和芽的小植株。

試驗結(jié)果經(jīng)SPSS12.0統(tǒng)計軟件的LSD分析表明，以胚狀體的形成為考察指標，2,4-D的影響達到顯著水平(P＜0.05)，KT、蔗糖的影響未達到顯著水平(P＞0.05)，且蔗糖作用大于KT作用，即3種影響因素對胚狀體形成的影響程度依次為2,4-D＞蔗糖＞KT，表明2A-D和蔗糖是影響紫花苜蓿胚狀體形成的重要影響因子。故而可知最佳的胚狀體培養(yǎng)基應(yīng)為：改良SH+KT0.5mg／L，蔗糖濃度為2％。

3小結(jié)

3.1培養(yǎng)基的影響：在試驗中發(fā)現(xiàn)改良SH培養(yǎng)基最適宜于紫花苜蓿脫分化，其它培養(yǎng)基雖然也可以使紫花苜蓿脫分化，但是脫分化的時間和比率均遠不如改良SH，可見不同的養(yǎng)分組成的培養(yǎng)基對紫花苜蓿脫分化的誘導影響很大。

3.2激素的影響：在紫花苜蓿組織培養(yǎng)中常使用的生長素有2,4-D、NAA、IAA、IBA等，通常認為2,4-D是體細胞胚再生的關(guān)鍵激素；常用的細胞分裂素主要有KT、BA，其作用是促進細胞分裂，促進芽的分化等。本試驗也充分證實了這一觀點。

3.3胚性愈傷組織的細胞學觀察

3.4體細胞胚發(fā)生各個階段的細胞學觀察

通過試驗確定了外源基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)高效再生體系建立的相關(guān)數(shù)據(jù)，建立了以紫花苜蓿為材料的外源基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)高效再生體系。培養(yǎng)出了大量的胚狀體，為后續(xù)外源基因的導人奠定了良好的基礎(chǔ)，為植物生物反應(yīng)器的發(fā)展提供條件。附圖為紫花苜蓿外源基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)高效再生體系建立的全過程。