孫海濤，楊 玲，齊力旺，李萬(wàn)峰*

(1. 林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

日本落葉松（Larix kaempferi(Lamb.) Carr.）為松科（Pinaceae）落葉松屬（Larix）喬木，廣泛分布于溫帶和寒溫帶等地區(qū)。它是我國(guó)重要的用材樹(shù)種，具有早期速生、病蟲(chóng)害少、輪伐期短、成林快、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)?；谟行苑敝车穆淙~松傳統(tǒng)育種存在優(yōu)良性狀難以保持、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題極大地限制著日本落葉松優(yōu)異種質(zhì)資源的大規(guī)模利用。和扦插、嫁接相比，日本落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)具有遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、繁殖系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前最有潛力的無(wú)性繁殖技術(shù)，受到越來(lái)越多的關(guān)注[1-6]。

體細(xì)胞胚胎發(fā)生（Somatic embryogenesis）是指體細(xì)胞經(jīng)歷脫分化并在體外形成類(lèi)似胚胎的胚狀體，這一過(guò)程與合子胚的發(fā)育過(guò)程有許多相似之處[7-8]。在1987 年von Aderkas 以雜種落葉松（L.ecidua×L.leptolepis）雌配子體為外植體誘導(dǎo)出胚性愈傷，但未獲得再生植株[9]。Klimaszewska以歐日雜種落葉松（Larix×eurolepis）未成熟種子為外植體，成功培育出再生植株[10]。此后體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)在多種雜種落葉松[11-12]、華北落葉松（L.gmeliniivar.principis-rupprechtii(Mayr) Pilger）、西伯利亞落葉松（L.sibiricaLedeb.）[13-14]、長(zhǎng)白落葉松（L.olgensisHenry）[15-16]和日本落葉松[17-18]等落葉松中都得以應(yīng)用并取得一定的進(jìn)展，但依然存在一些問(wèn)題亟待解決，比如胚狀體萌發(fā)率和成苗轉(zhuǎn)化率低等，這些問(wèn)題限制了日本落葉松體胚發(fā)生技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。

在萌發(fā)培養(yǎng)前對(duì)胚狀體進(jìn)行干化處理是解決上述問(wèn)題的一種可行的方法。干化處理可以將“形態(tài)成熟”的胚狀體轉(zhuǎn)化成“生理成熟”的胚狀體，從而促進(jìn)萌發(fā)[19-20]。這在云杉屬（Picea）體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)體系中得到很好的應(yīng)用，被認(rèn)為是體細(xì)胞胚成功萌發(fā)的先決條件[21-22]，但在日本落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)體系中尚未見(jiàn)到過(guò)相關(guān)的研究和應(yīng)用報(bào)道。

本研究以日本落葉松胚狀體為材料，觀察并統(tǒng)計(jì)不同類(lèi)別胚狀體的萌發(fā)情況，探究干化處理對(duì)日本落葉松胚狀體萌發(fā)的影響，旨在提高日本落葉松胚狀體的萌發(fā)率，促進(jìn)日本落葉松高效穩(wěn)定再生體系的建立，為日本落葉松良種繁育和規(guī)?；瘧?yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)以日本落葉松C6 細(xì)胞系為材料，所用到的增殖培養(yǎng)基、成熟培養(yǎng)基和萌發(fā)培養(yǎng)基均參考齊力旺的方法[23]。培養(yǎng)基pH 為5.8，121 ℃高壓滅菌后，在無(wú)菌環(huán)境下分裝備用。增殖培養(yǎng)和成熟培養(yǎng)在暗環(huán)境（溫度22 ℃）下進(jìn)行，萌發(fā)培養(yǎng)先在暗環(huán)境下進(jìn)行3 d，之后在光環(huán)境（溫度24 ±2 ℃，光照14 h，光照強(qiáng)度1 000 lx）下進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 胚狀體形態(tài)分類(lèi) 胚性愈傷組織成熟培養(yǎng)45 d 后，隨機(jī)選取100 個(gè)胚狀體，根據(jù)子葉數(shù)量和胚軸形態(tài)進(jìn)行形態(tài)分類(lèi)，顯微鏡下觀察、分類(lèi)、拍照，統(tǒng)計(jì)不同類(lèi)別胚狀體的發(fā)生頻率。成熟培養(yǎng)共進(jìn)行4 次，共分析400 個(gè)胚狀體。

1.2.2 胚狀體萌發(fā) 重新選取300 個(gè)胚狀體進(jìn)行分類(lèi)與萌發(fā)培養(yǎng)。2 個(gè)月后統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)情況。觀察到子葉伸長(zhǎng)、胚軸生長(zhǎng)和胚根伸長(zhǎng)，分別用“√”標(biāo)記，反之，用“ × ”標(biāo)記，培養(yǎng)條件同上。

1.2.3 干化處理對(duì)胚狀體萌發(fā)和形態(tài)的影響 類(lèi)型Ⅰ胚狀體采用“濾紙容器法”進(jìn)行干化處理[24]。處理時(shí)，用鑷子將胚狀體平鋪在有3 層干濾紙（70 mm）的塑料培養(yǎng)皿（90 mm × 20 mm）中，隨后再將無(wú)蓋的塑料培養(yǎng)皿放在裝有15 mL 去離子水的玻璃培養(yǎng)皿（180 mm × 31 mm）中；玻璃培養(yǎng)皿用封口膜封口，隨后放置在光環(huán)境下（溫度24 ± 2 ℃，光照14 h，光照強(qiáng)度1 000 lx）。干濾紙、培養(yǎng)皿和去離子水在使用前進(jìn)行高壓滅菌。干化處理分別進(jìn)行0、7、14、21 和28 d。每次處理后取180 個(gè)胚狀體放入萌發(fā)培養(yǎng)基中，每皿60 個(gè)，重復(fù)3 次，30 d 后統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)情況。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)以子葉和胚軸伸長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)出作為胚狀體萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)。

式中：y 為胚狀體萌發(fā)率，n 為萌發(fā)的胚狀體數(shù)量，N 為參與萌發(fā)培養(yǎng)的胚狀體數(shù)量。采用軟件IBM SPSS Statistics19.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本落葉松胚狀體的形態(tài)和分類(lèi)

日本落葉松C6 胚性愈傷組織經(jīng)過(guò)成熟培養(yǎng)后產(chǎn)生形態(tài)各異的胚狀體。進(jìn)一步觀察和分析后，胚狀體可分為10 種類(lèi)型（圖1、表1），其中類(lèi)型I 發(fā)生頻率最高，達(dá)到56.75%；類(lèi)型Ⅲ、類(lèi)型Ⅵ發(fā)生頻率分別為12.75%、13.25%，僅次于類(lèi)型I；其余類(lèi)型的發(fā)生頻率較低，都不足5%。

表1 日本落葉松胚狀體的形態(tài)和分類(lèi)Table 1 Morphology and classification of Larix kaempferi embryoids

圖1 日本落葉松胚狀體的形態(tài)和分類(lèi)Fig. 1 Morphology and classification of Larix kaempferi embryoids

2.2 未干化處理的胚狀體萌發(fā)情況統(tǒng)計(jì)分析

在萌發(fā)培養(yǎng)基上，隨機(jī)挑選的淡黃色胚狀體先在暗環(huán)境下培養(yǎng)3 d，之后在光環(huán)境下培養(yǎng)。7 d左右觀察到胚狀體發(fā)生膨大，子葉變綠。12 d 左右子葉變成翠綠色、胚軸伸長(zhǎng)。隨后，部分胚狀體長(zhǎng)出紅色根尖（圖2）。

圖2 不同類(lèi)型日本落葉松胚狀體的萌發(fā)情況Fig. 2 Germination of different types of Larix kaempferi embryoids

類(lèi)型Ⅰ胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)5 d 后，子葉由黃變綠，胚狀體開(kāi)始膨大；10 d 后子葉變成翠綠色，子葉和胚軸伸長(zhǎng)，基部產(chǎn)生微小的紅色根尖（圖2A），萌發(fā)率為4.48%。類(lèi)型Ⅹ的胚狀體在萌發(fā)培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)慢慢褐化死亡。其它8 種類(lèi)型的胚狀體都表現(xiàn)出子葉伸長(zhǎng)，部分胚狀體有胚軸生長(zhǎng)，但均未見(jiàn)胚根生長(zhǎng)（表2，圖2B）。

表2 日本落葉松胚狀體的萌發(fā)情況Table 2 Germination of Larix kaempferi embryoids

2.3 干化處理對(duì)胚狀體萌發(fā)的影響

在萌發(fā)培養(yǎng)過(guò)程中，僅類(lèi)型Ⅰ胚狀體表現(xiàn)出完整的萌發(fā)性狀，因此用類(lèi)型Ⅰ胚狀體進(jìn)行干化處理。與未干化處理的胚狀體相比，干化處理7、14、21 和28 d 的胚狀體萌發(fā)率均有增加，其中干化處理14 d 的胚狀體萌發(fā)率最高，達(dá)到69.43%（表3，圖3），說(shuō)明干化處理可以顯著促進(jìn)胚狀體萌發(fā)。

表3 干化對(duì)日本落葉松胚狀體萌發(fā)的影響Table 3 Effect of desiccation on the germination of Larix kaempferi embryoids

圖3 干化對(duì)日本落葉松胚狀體形態(tài)和萌發(fā)的影響Fig. 3 Effects of desiccation on morphology and germination of Larix kaempferi embryoids

2.4 胚狀體對(duì)干化處理的響應(yīng)

在干化處理過(guò)程中，胚狀體的顏色有兩種變化，一種是子葉、胚軸變綠，胚根變紅（圖4A），另一種是子葉、胚軸顏色無(wú)明顯變化，胚根微微變紅（圖4B、C）。參考粗枝云杉胚狀體干化處理后的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[24]，將子葉和胚軸變綠、胚根變紅的日本落葉松胚狀體稱(chēng)為有干化響應(yīng)的胚狀體，將另外一種胚狀體稱(chēng)為無(wú)干化響應(yīng)的胚狀體。

圖4 日本落葉松胚狀體的干化響應(yīng)Fig. 4 Desiccation response of Larix kaempferi embryoids

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，有干化響應(yīng)的胚狀體更易萌發(fā)。所有經(jīng)過(guò)干化處理的720 個(gè)胚狀體中，有干化響應(yīng)的胚狀體共有649 個(gè)（90.1%），其中有317 個(gè)（48.8%）萌發(fā)；無(wú)干化響應(yīng)的胚狀體共有71 個(gè)，但僅有11 個(gè)（15.5%）萌發(fā)。干化處理14 d，有干化響應(yīng)的胚狀體162 個(gè)（90%），其中122 個(gè)（75.3%）萌發(fā)，而無(wú)干化響應(yīng)的胚狀體18 個(gè)（10%），只有3 個(gè)（16.7%）萌發(fā)（表4）。因此，可以將干化響應(yīng)作為挑選胚狀體進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)的依據(jù)。

表4 干化響應(yīng)與胚狀體萌發(fā)Table 4 Desiccation response and germination of somatic embryos

3 討論

在日本落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中，胚性愈傷組織經(jīng)歷增殖培養(yǎng)和成熟培養(yǎng)后會(huì)產(chǎn)生形態(tài)各異的胚狀體，這些胚狀體的萌發(fā)能力存在差異。齊力旺[23]在研究華北落葉松過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，子葉數(shù)量少、胚軸短的胚狀體都難以萌發(fā)。李哲馨等對(duì)日本落葉松胚狀體按照子葉數(shù)量進(jìn)行了分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)子葉數(shù)量多于或等于4 個(gè)的胚狀體的萌發(fā)率高于其它類(lèi)別的胚狀體[25]。上述工作表明，先對(duì)胚狀體進(jìn)行分類(lèi)而后進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)有助于提高萌發(fā)率和工作效率。本研究首先按照子葉數(shù)量和胚軸形態(tài)對(duì)日本落葉松胚狀體進(jìn)行了更為細(xì)致的分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)它們可以分為10 種類(lèi)型；隨后進(jìn)行了萌發(fā)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)僅有類(lèi)型I 胚狀體可以萌發(fā)，萌發(fā)率為4.48%，其余類(lèi)型胚狀體都難以萌發(fā)。以往對(duì)胚狀體進(jìn)行分類(lèi)多以子葉數(shù)量為依據(jù)[25-27]，本研究以子葉數(shù)量和胚軸形態(tài)作為分類(lèi)的依據(jù)，使分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)更加細(xì)化與完善。

在萌發(fā)培養(yǎng)過(guò)程中，僅部分類(lèi)型Ⅰ胚狀體表現(xiàn)出完整的萌發(fā)性狀，子葉伸長(zhǎng)、變綠，胚軸伸長(zhǎng)，胚狀體下端長(zhǎng)出胚根，而其余類(lèi)型胚狀體未長(zhǎng)出胚根。推測(cè)部分類(lèi)型Ⅰ胚狀體的根端發(fā)育相對(duì)完善，而其它類(lèi)型胚狀體的根端發(fā)育異常。這些結(jié)果表明，胚狀體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性決定著它們是否可以萌發(fā)。研究結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明在萌發(fā)培養(yǎng)前對(duì)胚狀體進(jìn)行形態(tài)分類(lèi)，有助于挑選出適宜進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)的胚狀體。

胚狀體“生理成熟”是萌發(fā)的關(guān)鍵前提，而干化處理可以使胚狀體達(dá)到生理成熟、促進(jìn)其萌發(fā)[19-20]。Jing 等在云杉研究中發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)率隨著干化時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，干化處理14 d萌發(fā)率最高[28]。Maruyama等在日本黑松（Pinus thunberghiiParl.）和日本赤松（P.densifloraSiebold & Zucc.）研究中同樣發(fā)現(xiàn)，干化處理可以顯著提高萌發(fā)率[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)干化處理的類(lèi)型I 胚狀體萌發(fā)率為5.57%，而干化處理14 d 后萌發(fā)率提高了63.86%，說(shuō)明干化處理可以顯著提高日本落葉松類(lèi)型I 胚狀體的萌發(fā)率。由于未經(jīng)干化處理的其余類(lèi)型胚狀體萌發(fā)培養(yǎng)后未表現(xiàn)出完整的萌發(fā)性狀，本研究未對(duì)其進(jìn)行干化處理。因此，干化處理是否可以使這些胚狀體達(dá)到生理成熟，進(jìn)而促進(jìn)其萌發(fā)，還需進(jìn)一步確定。

即使是類(lèi)型I 胚狀體，在干化處理后也表現(xiàn)出不同的性狀。其中子葉、胚軸變綠，胚根變紅的胚狀體，被稱(chēng)為有干化響應(yīng)的胚狀體；子葉、胚軸顏色無(wú)明顯變化，胚根微微變紅的胚狀體，被稱(chēng)為未有干化響應(yīng)的胚狀體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，具有干化響應(yīng)的類(lèi)型I 胚狀體比無(wú)干化響應(yīng)的類(lèi)型I 胚狀體更易萌發(fā)，這與粗枝云杉胚狀體（Picea asperataMast）干化處理的研究結(jié)果一致[24]。據(jù)此，推測(cè)無(wú)干化響應(yīng)的類(lèi)型I 胚狀體根端發(fā)育不完善，而具有干化響應(yīng)的類(lèi)型I 胚狀體根端發(fā)育相對(duì)完善。由此可知，類(lèi)型I 胚狀體內(nèi)部結(jié)構(gòu)也存在差異，且這些差異可以通過(guò)干化響應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)。因此對(duì)類(lèi)型I 胚狀體進(jìn)行干化處理，有助于進(jìn)一步挑選更適宜進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)的胚狀體。

4 結(jié)論

基于上述研究結(jié)果，建議挑選子葉數(shù)量多于4、胚軸勻稱(chēng)的日本落葉松胚狀體進(jìn)行干化處理。干化處理14 d 的胚狀體萌發(fā)率提高了63.86%，且具有干化響應(yīng)的胚狀體更易萌發(fā)。研究結(jié)果有助于促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)在日本落葉松遺傳育種中的應(yīng)用，也為其它針葉樹(shù)繁育技術(shù)的研發(fā)和完善提供參考。