李松波　金衛(wèi)東　王　雋　張愛芳

摘 要：流式細(xì)胞術(shù)是一種綜合應(yīng)用光學(xué)、流體力學(xué)、電子計(jì)算機(jī)、細(xì)胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科技術(shù),對高速流動(dòng)的細(xì)胞或亞細(xì)胞進(jìn)行快速定量測定和分析的方法。用它不僅可以來對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，還可以對細(xì)胞的混合物進(jìn)行細(xì)胞類型的分析研究，并同時(shí)測定細(xì)胞的多個(gè)參數(shù),如測定細(xì)胞的特征(形態(tài)、膜電位等)和細(xì)胞內(nèi)pH,細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)含量、表面受體、Ca2+等。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的靈敏度、精密度大大超越了傳統(tǒng)的技術(shù)，因此廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)等許多領(lǐng)域。主要綜述流式細(xì)胞術(shù)在體育科研中的應(yīng)用并討論它在應(yīng)用中的局限性和面臨的挑戰(zhàn)。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞術(shù);免疫功能;細(xì)胞凋亡;綜述

中圖分類號(hào)：G804.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1007-3612(2008)08-1102-03

Application of Flow Cytometry in Sports Research

LI Song-bo1, JIN Wei-dong2, WANG Jun3, ZHANG Ai-fang1

(1.Beijing Sport University, Beijing 100084, China; 2.Hebei University of Technology, Langfang 065000, Hebei China;

3.Capital Institute of Physical Education, Beijing 100084, China）

Abstract:Flow cytometry is a method for rapidly analyzing large numbers of cells individually using light fluorescence and integrating optics, fluidics, electronics, and computer technology. Now it is a powerful tool for characterizing the composition of complex cell populations. Flow cytometric assays have been developed to determine both cellular characteristics such as size, membrane potential, and intracellular pH

and the levels of cellular components such as DNA, protein, surface receptors, and calcium. The accuracy and precision of this technology for describing and enumerating cells exceeds traditional methods. With its high sensitivity and specificity, the flow cytometric has become the preferred method for the lineage assignment and maturational analysis of m alignant cells in acute leukemia and lymphoma。Flow cytometry has revolutionized the field of immunology, in both the basic science and clinical settings, as well as having been instrumental to new and exciting areas of discovery such as stem cell biology and detecting microorganisms in environmental samples. This review focuses primarily on the use of flow cytometry in sport research area. Finally, a discussion of the challenges and limitations of the method is presented along with a future outlook.

Key words: flow cytometry; immune function; apoptosis; review

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，簡稱FCM）是上世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù),它是利用流式細(xì)胞儀測量在液流中細(xì)胞或顆粒懸液中的標(biāo)記物熒光強(qiáng)度并進(jìn)行多參數(shù)的快速定量分析和分選的技術(shù)。已經(jīng)在細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用；并已廣泛應(yīng)用于體育科研領(lǐng)域中，主要有運(yùn)動(dòng)與免疫功能、運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞凋亡和運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的蛋白產(chǎn)物免疫標(biāo)記的檢測等方面。

1 FCM基本原理

FCM的基本原理是將待測樣本的細(xì)胞懸液，在鞘液的包圍和約束下，使細(xì)胞排成單列由流動(dòng)室噴嘴高速噴出，形成細(xì)胞液柱，當(dāng)液柱通過檢測區(qū)，在入射的激光束照射下產(chǎn)生前向散射光(FCS)和側(cè)向散射光(SSC)，它們分別反映細(xì)胞的大小和顆粒度，根據(jù)這些特性可將細(xì)胞分類。同時(shí)經(jīng)一種或幾種特殊熒光標(biāo)記的樣本細(xì)胞，在激光束的激發(fā)下產(chǎn)生特定熒光，該熒光信號(hào)可被光學(xué)系統(tǒng)檢測并輸送到數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 FCM在體育科研中的應(yīng)用

2.1 運(yùn)動(dòng)與外周血白細(xì)胞的免疫表型分析 細(xì)胞免疫表型的研究是FCM應(yīng)用最成熟的領(lǐng)域之一。運(yùn)動(dòng)影響外周血白細(xì)胞的免疫表型的研究基本集中在T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究較早的細(xì)胞上。大量研究表明T淋巴細(xì)胞在不同的CD4和CD8群中，表面標(biāo)記與功能的關(guān)系存在普遍的規(guī)律，這也正是利用T淋巴細(xì)胞的免疫表型來分析其功能的理論基礎(chǔ)。運(yùn)動(dòng)對T淋巴細(xì)胞的影響研究很多。研究發(fā)現(xiàn)，一次比賽或訓(xùn)練前、即刻、和之后24 h CD³⁺、CD⁴⁺、CD⁸⁺和CD¹⁹⁺等一般會(huì)有一個(gè)升高、降低并恢復(fù)的過程^［1］,長時(shí)間大強(qiáng)度訓(xùn)練會(huì)導(dǎo)致外周血CD⁴⁺比例下降，CD⁸⁺比例上升，CD⁴⁺/CD⁸⁺比值下降，NK細(xì)胞活性下降^［2］。其中，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度是影響運(yùn)動(dòng)過程中NK細(xì)胞變化的關(guān)鍵因素,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度愈大NK細(xì)胞的變化愈明顯,主要表現(xiàn)為外周血NK細(xì)胞數(shù)量與功能的下降^［3］。近幾年研究表明，高原訓(xùn)練及低氧暴露可抑制機(jī)體免疫功能^［4］。王恬等研究發(fā)現(xiàn)不同的模擬低氧訓(xùn)練過程中,淋巴細(xì)胞及其亞群(CD³⁺、CD⁴⁺、CD⁸⁺T)的變化總體趨向較為一致,但變化程度有所差異。低氧訓(xùn)練第4周、第5周, HiHiLo組NKT(Natural killer T)細(xì)胞下降幅度更大；低氧訓(xùn)練第5周CD³⁺、CD⁴⁺均呈上升趨勢,但LoHi組上升更明顯^［5］。

運(yùn)用FCM研究營養(yǎng)補(bǔ)劑調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的免疫功能抑制時(shí)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)員通過長期低劑量口服補(bǔ)充谷氨酰胺、補(bǔ)充牛初乳、服用黃芪多糖和牛膝多糖能有效防止訓(xùn)練期后CD⁴⁺/CD⁸⁺比值的下降，抑制淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少和活化T細(xì)胞數(shù)量的下降^［6］。

可見利用FCM監(jiān)測T淋巴細(xì)胞變化的幅度可以反映運(yùn)動(dòng)員的疲勞程度，對訓(xùn)練的適應(yīng)及恢復(fù)情況；所以，在大負(fù)荷訓(xùn)練期必須重視運(yùn)動(dòng)員免疫機(jī)能的變化，積極采取措施預(yù)防疾病的發(fā)生、發(fā)展。

2.2 運(yùn)動(dòng)對紅細(xì)胞的影響分析 FCM在紅細(xì)胞中的最大應(yīng)用價(jià)值是其能檢測少量紅細(xì)胞群體。朱榮等研究HiHiLo對足球運(yùn)動(dòng)員紅細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)HiHiLo和LoLo均可下調(diào)人體紅細(xì)胞CD58、CD59（熒光強(qiáng)度）表達(dá), HiHiLo影響紅細(xì)胞CD58表達(dá)下降較LoLo有更明顯趨勢，從而影響紅細(xì)胞對T淋巴細(xì)胞免疫的調(diào)控^［7］。HiLo實(shí)驗(yàn)中靈芝多糖可以明顯影響紅細(xì)胞CD35數(shù)量的表達(dá),并且可以調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)員紅細(xì)胞繼發(fā)性免疫低下的現(xiàn)象。曹建民等研究表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠紅細(xì)胞膜轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量明顯增加,且與血清鐵呈高度相關(guān),說明紅細(xì)胞膜轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量能更為準(zhǔn)確地反映紅細(xì)胞內(nèi)和機(jī)體鐵代謝狀況，同時(shí)發(fā)現(xiàn)抗貧血鐵制劑復(fù)合營養(yǎng)補(bǔ)劑的干預(yù)能顯著降低紅細(xì)胞膜轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量^［8］。

2.3 運(yùn)動(dòng)對網(wǎng)織紅細(xì)胞的影響分析 前已述及，由于激光束可射入細(xì)胞內(nèi)，因而可進(jìn)行紅細(xì)胞內(nèi)容物的分析，網(wǎng)織紅細(xì)胞漿內(nèi)含有一定量的 RNA，經(jīng)染色后可顯示網(wǎng)織結(jié)構(gòu)且其形式與 RNA 含量有關(guān)。這樣用FCM測定網(wǎng)織紅細(xì)胞,根據(jù)熒光強(qiáng)度將其分為低、中、高(LFR,MFR, HFR)三種熒光類型；幼稚網(wǎng)織紅細(xì)胞有最強(qiáng)的熒光，多為MFR，HFR；較成熟的熒光強(qiáng)度弱，為LFR。在造血受到刺激，幼稚的從骨髓釋放入外周血MFR, HFR顯著增高，即未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞指數(shù)(IRF)顯著增高^［9］，往往提示紅細(xì)胞生成開始。所以此方法可及時(shí)的反映骨髓的造血狀況,其在監(jiān)測紅細(xì)胞生成和破壞,監(jiān)測體內(nèi)鐵的存儲(chǔ)形式和利用情況,及補(bǔ)充鐵劑的效果時(shí),均可提供及時(shí)可靠的信息，對運(yùn)動(dòng)性貧血的診斷、鑒別診斷和療效觀察有重要意義。

運(yùn)用FCM研究不同項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員網(wǎng)織紅細(xì)胞參數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn), 表現(xiàn)性項(xiàng)群運(yùn)動(dòng)員LFR最高，而RET%和MFR比例卻顯著低于耐力性項(xiàng)群、速度力量性項(xiàng)群和對抗性項(xiàng)群。提示表現(xiàn)性項(xiàng)群網(wǎng)織紅增生活性較低。4個(gè)項(xiàng)群中,對抗性項(xiàng)群運(yùn)動(dòng)員Hb最低,網(wǎng)織紅細(xì)胞參數(shù)中CHr及網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白量濃度（HDWr）顯著低于其它項(xiàng)群運(yùn)動(dòng)員^［10］。

許多研究表明低氧訓(xùn)練時(shí)的Hb的變化與RET有很高的相關(guān)性^［11］。劉媛媛等研究了13名國家女子中長跑隊(duì)運(yùn)動(dòng)員RET在26d的低氧訓(xùn)練的變化發(fā)現(xiàn)， HiHiLo組的IRF、RMI以及Hb、RET%的增加幅度均高于LoHi組同時(shí)段各指標(biāo)；并且受檢網(wǎng)織紅細(xì)胞參數(shù)反映骨髓紅系增生的敏感性依次為IRF=RMI>RPI=RET%和RET%>Hb^［12］。張春麗等還發(fā)現(xiàn)模擬HiLo的大鼠高強(qiáng)度定量負(fù)荷組與極限負(fù)荷組的RET%顯著低于常氧組。兩氧環(huán)境中,高強(qiáng)度定量負(fù)荷組RET%顯著低于運(yùn)動(dòng)后40h安靜組^［13］。但Ashenden M J等對澳大利亞國家女自行車運(yùn)動(dòng)員為期70d的高住(海拔高度2 650 m)低練的研究結(jié)果表明,對RET和Hb沒有顯著意義^［14］。Lundby等對8名運(yùn)動(dòng)員模擬高原(4 100 m)的低氧艙中為期14d的間歇性低氧訓(xùn)練后,RET還包括EPO、Hb和HCT無明顯改變^［15］。產(chǎn)生這種不同的研究結(jié)果，除有運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目自身的因素外，研究時(shí)還要考慮網(wǎng)織紅細(xì)胞變化先于Hb的特點(diǎn)。因?yàn)橛腥藙?dòng)態(tài)觀察顯示HFP(早期網(wǎng)織紅細(xì)胞)比率的升高可早于Hb變化3～5 d，早于MCV變化5～7 d^［16］。

2.4 運(yùn)動(dòng)與血小板相關(guān)免疫球蛋白和血小板微粒膜蛋白分析 血小板功能變化是血栓形成的病理過程的重要因素。FCM已經(jīng)成為檢測血小板功能狀態(tài)的重要實(shí)驗(yàn)手段,因?yàn)樗兄趨^(qū)分血小板病理學(xué)形態(tài)變化和膜蛋白分析；可以研究不同誘導(dǎo)劑作用下、剪切力誘導(dǎo)下血小板活化時(shí)其鈣離子濃度的變化，檢測活化血小板，血小板缺陷性、減少性疾?。粰z測網(wǎng)織血小板（RP）可用于發(fā)生栓塞的危險(xiǎn)性判斷。

運(yùn)動(dòng)作為一種預(yù)防高血壓患者血栓性疾病發(fā)生的手段,已為人們所接受并在實(shí)踐中廣泛應(yīng)用, 竇麗等研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)行10周中等強(qiáng)度的游泳運(yùn)動(dòng)能提高高血壓大鼠血小板內(nèi)NOS活性,增加血小板NO的釋放,提高血小板內(nèi)cGMP水平來抑制血小板的聚集,對防治高血壓血栓性疾病有重要的作用^［17］。研究還有長期規(guī)則游泳運(yùn)動(dòng)對Wistar大鼠血小板L-Arg轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,結(jié)果表明,適宜運(yùn)動(dòng)可提高血小板L-Arg（L-精氨酸）轉(zhuǎn)運(yùn)率,據(jù)此推測運(yùn)動(dòng)可通過增加L-Arg的轉(zhuǎn)運(yùn),促進(jìn)血小板NO的合成和釋放,以負(fù)反饋方式抑制血小板的聚集,從而對預(yù)防血管栓塞性疾病有積極的作用^［18］。研究表明早期康復(fù)訓(xùn)練可下調(diào)急性腦梗死（ACI）早期血小板活化及血小板胞漿內(nèi)-α粒膜上糖蛋白CD62P的表達(dá)^［19］。

2.5 用于細(xì)胞凋亡的檢測 細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序性的死亡。近年來研究多用FCM來檢測細(xì)胞凋亡，包括凋亡DNA的檢測、細(xì)胞質(zhì)膜的完整性、線粒體跨膜電位、溶酶體質(zhì)子泵、蛋白質(zhì)和DNA含量、光的散射、DNA的原位降解、細(xì)胞凋亡的定量測定等。FCM常用于凋亡檢測的方法有Caspase-3、Annexin V和DNA斷裂片段的分析等方法，其中Annexin V聯(lián)合PI法是一種新的較為理想的檢測方法。

FCM在運(yùn)動(dòng)與淋巴細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用。大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)不影響淋巴細(xì)胞的凋亡^［20］；有趣的是有研究發(fā)現(xiàn)，中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以降低心理應(yīng)激導(dǎo)致的大鼠外周血淋巴細(xì)胞凋亡量，降低心理應(yīng)激對大鼠機(jī)體免疫功能的危害^［21］。大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)后血液中淋巴細(xì)胞的凋亡，王安利較全面地研究了不同負(fù)荷對小鼠淋巴細(xì)胞凋亡的影響， 發(fā)現(xiàn) 6月齡小鼠、12月齡小鼠淋巴細(xì)胞凋亡的發(fā)生率由高到低，其排列順序依次是，負(fù)重運(yùn)動(dòng)組>一次性力竭運(yùn)動(dòng)組>對照組>無負(fù)重組^［22］。

FCM在運(yùn)動(dòng)與骨骼肌細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用。Biral等研究發(fā)現(xiàn)成年小鼠經(jīng)過12 h的鋼籠內(nèi)自發(fā)跑后，運(yùn)動(dòng)后即刻肌細(xì)胞凋亡率最高，6 h后稍微有所下降，96 h后凋亡率大幅度下降^［23］。越來越多的證據(jù)表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致的肌肉細(xì)胞凋亡有一定的時(shí)相性和矛盾性,運(yùn)動(dòng)可以導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞凋亡,但是運(yùn)動(dòng)本身對已經(jīng)凋亡骨骼肌細(xì)胞可能具有清除作用或?qū)磳⒌蛲龅墓趋兰〖?xì)胞有恢復(fù)作用，這兩種作用結(jié)果之間調(diào)控失衡，可能是造成骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷原因之一，說明運(yùn)動(dòng)影響骨骼肌細(xì)胞的凋亡具有雙向性^［24］。

許多研究采用FCM檢測大鼠各組心肌、腎組織細(xì)胞和肝細(xì)胞凋亡率的變化發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞凋亡，且隨運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加而增加^［25］。金其貫等研究還發(fā)現(xiàn)力竭后即刻心肌細(xì)胞凋亡與腎細(xì)胞凋亡率即明顯升高; 之后的24 h之內(nèi),它們會(huì)有一個(gè)明顯升高然后降低的過程但仍明顯高于對照組^［26］。還有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充銀杏制劑、膽紅素可通過其抗氧化作用及影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而抑制大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)的肝、心肌細(xì)胞過度凋亡，從而發(fā)揮一定的保護(hù)作用^［27］。

總之，F(xiàn)CM不僅為細(xì)胞是否發(fā)生凋亡提供客觀證據(jù)，而且還能對細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量分析，并可從多方面證實(shí)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的區(qū)別，同時(shí)還能檢測同一群體的不同亞群細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞，并可進(jìn)行分選。

2.6 用于檢測與運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物 FCM在此方面的研究國內(nèi)未見報(bào)道，它的優(yōu)勢在于不必分離蛋白質(zhì)就可以對細(xì)胞膜表面、細(xì)胞漿中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析檢測。如近幾年的研究熱點(diǎn)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子（γ-INF、α-TNF）的分泌^［28］。Staats R等為了解劇烈運(yùn)動(dòng)后運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)NK細(xì)胞毒活性(NKCA)和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)抑制的原因,研究了淋巴細(xì)胞亞群改變和細(xì)胞內(nèi)穿孔素（PFR）基因表達(dá)改變的相關(guān)性,使用流式細(xì)胞儀對PFR進(jìn)行了分析。他們發(fā)現(xiàn):訓(xùn)練有素的運(yùn)動(dòng)員外周血中PFR的百分比相對較高,但在過度疲勞后PFR出現(xiàn)暫時(shí)性下降^［29］。

3 FCM在體育科研應(yīng)用中存在的問題

綜上所述，F(xiàn)CM以其快速、準(zhǔn)確、靈活、多參數(shù)同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn),已成為體育科研的重要方法之一。但其中也存在以下問題：1）聯(lián)用抗體對運(yùn)動(dòng)影響人體免疫細(xì)胞功能的組合設(shè)計(jì)處于初級(jí)階段。FCM對臨床白血病和淋巴瘤等疾病的診斷已有多種成熟的抗體“組合”方式；但關(guān)于運(yùn)動(dòng)對人體免疫細(xì)胞影響的研究還多停留在T細(xì)胞亞群水平，并沒有形成比較成熟的抗體組合（沒有系統(tǒng)的CD研究方案）。2）通常檢測的是外周血標(biāo)本，更應(yīng)考慮留取其他標(biāo)本（如骨髓、淋巴節(jié)、胸腔液、腹腔液或腦脊液）。因?yàn)檫@樣才有可能及時(shí)、準(zhǔn)確、全面地反映機(jī)體功能的變化，但這些樣本不易從健康個(gè)體獲取。3）應(yīng)加強(qiáng)研究不同訓(xùn)練負(fù)荷量和不同補(bǔ)劑對血小板功能、粒細(xì)胞功能的影響，為運(yùn)動(dòng)疾病的防治提供理論依據(jù)。4）加強(qiáng)質(zhì)量控制，一些FCM檢測技術(shù)在方法學(xué)和抗體選擇上還沒有統(tǒng)一,分析結(jié)果亦存在多種影響因素,如樣本與試劑準(zhǔn)備、免疫熒光染色方法、對照設(shè)置、流式細(xì)胞數(shù)據(jù)的獲取與分析等。只有充分了解這些影響因素,建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序并做好嚴(yán)格的質(zhì)控,才能保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。相信,隨著FCM的不斷發(fā)展完善,它將為體育的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究開創(chuàng)新局面。

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