賀蘭芝孟雅坤　韓延忠　張振芳　尹萍　桑秀秀　肖小河　柏兆方

[摘要] 探討木犀草素（luteolin，Lut）對(duì)對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）誘導(dǎo)的L02肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。CCK8法檢測(cè)Lut對(duì)L02細(xì)胞活性的影響；篩選APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷的濃度及作用時(shí)間；細(xì)胞形態(tài)學(xué)、CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析Lut對(duì)APAP誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡的影響；比色法檢測(cè)細(xì)胞上清液中丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽（GSH）及超氧化物歧化酶（SOD）活性；RTPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax，Bcl2，caspase3的表達(dá)。結(jié)果顯示Lut在2.5～40 μmol·L-1不影響L02細(xì)胞活性；12 mmol·L-1 APAP作用于L02細(xì)胞12 h可用于建立肝細(xì)胞損傷模型。與模型組相比，Lut組細(xì)胞狀態(tài)明顯改善，胞體增大，貼壁能力恢復(fù)明顯；細(xì)胞凋亡率明顯下降；MDA含量顯著下降（P<0.05或P<0.01），GSH和SOD活性顯著提高（P<0.05或P<0.01），同時(shí)能夠上調(diào)Bcl2及下調(diào)Bax，caspase3 mRNA的表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。該實(shí)驗(yàn)證明了Lut對(duì)APAP誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 木犀草素； 對(duì)乙酰氨基酚； L02細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； 細(xì)胞凋亡

Protective effects of luteolin against acetaminopheninduced

damage in L02 liver cells

HE Lanzhi1，3， MENG Yakun2，3， HAN Yanzhong3， ZHANG Zhenfang3，

YIN Ping2，3， SANG Xiuxiu3， XIAO Xiaohe3*， BAI Zhaofang3*

（1. School of Pharmacy， Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410208， China；

2. School of Pharmacy， Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China；

3. China Military Institute of Chinese Medicine， 302 Military Hospital， Beijing 100039， China）

[Abstract] This paper was aimed to investigate the protective effects of luteolin （Lut） against acetaminophen（APAP）induced damage in L02 liver cells. CCK8 was used to detect the cell activation of L02 cells treated by different Lut. The concentration and time of APAP induced L02 cell damage was screened. The effect of Lut on APAP induced apoptosis of L02 cells was detected by cell morphological observation， CCK8 assay and flow cytometry. The contents of MDA， GSH and SOD activity in cell supernatant were detected by colorimetric assay. The expression of apoptosisrelated genes Bax， Bcl2 and caspase3 was detected by RTPCR. The results showed that Lut in 2.540 μmol·L-1 range does not affect the activity of L02 cells； 12 mmol·L-1 APAP incubated with L02 cell 12 h to establish damage model. Compared with the model group， the cell status of Lut group was significantly improved， the cell body was increased， the adherence ability was recovered， and the apoptosis rate was obviously decreased. MDA content decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， GSH and SOD activity significantly increased （P<0.05， P<0.01）， at the same time， it could upregulate expression of Bcl2 mRNA and downregulate the expression of Bax and caspase3 mRNA. In conclusion，Lut has protective effect on APAP induced L02 cell injury， and its mechanism may be related to the reduction of oxidative stress and inhibition of apoptosis.

[Key words] luteolin； acetaminophen； L02 cells； oxydatve stress； apoptosis

doi：10.4268/cjcmm20162224

對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是一種常見的解熱鎮(zhèn)痛藥，APAP在治療劑量下安全，但過量使用會(huì)造成急性肝損傷[1]。APAP過量服用在許多國(guó)家已成為故意或意外死亡的原因之一[23]。目前，有證據(jù)證實(shí)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激是APAP引起急性肝損傷的重要生物學(xué)機(jī)制之一[47]，因此，探討能夠有效預(yù)防或緩解APAP引起的急性肝損傷途徑具有積極的臨床意義。

木犀草素（luteolin，Lut）屬于黃酮類化合物，主要存在于菊花、忍冬花、金銀花、紫蘇葉等植物中，近年研究表明木犀草素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用[811]。本文通過預(yù)防性給藥，研究給藥后氧化應(yīng)激損傷相關(guān)生理指標(biāo)變化，探討Lut的細(xì)胞保護(hù)和抗凋亡作用，為對(duì)乙酰氨基酚肝損傷的防治提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 正常人肝細(xì)胞株（L02）為本實(shí)驗(yàn)室保存。用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2且飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 DMEM（高糖）培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自GIBCO公司；Cell Counting Kit8 （CCK8）購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；木犀草素（luteolin，Lut）、五味子乙素（schizandrin B，Sch B）均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；APAP購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；AnnexinVFITC/PI試劑盒購(gòu)自Sigma公司；谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scienfitic公司；Bax，Bcl2，caspase3引物均購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀（ BioTek Synergy H1 H1MFD，美國(guó)）；DMIL HC型倒置相差顯微鏡（Leica，德國(guó)）；流式細(xì)胞儀（BD FACS Canto Ⅱ）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) L02細(xì)胞培養(yǎng)按照常規(guī)培養(yǎng)的方法，含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素的DMEM（高糖）培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 CCK8檢測(cè)Lut對(duì)L02細(xì)胞活性的影響 將L02細(xì)胞以7×104個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL，接種12 h細(xì)胞全部貼壁后，分別給予0，2.5，5，10，20，40，80，160 μmol·L-1的Lut，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后CCK8檢測(cè)L02細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。細(xì)胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%，式中Ac為對(duì)照孔吸光度，As為實(shí)驗(yàn)孔吸光度，Ab為空白孔吸光度。

2.3 APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞肝損傷模型的建立 將濃度為7×104個(gè)/mL的L02細(xì)胞接種到96孔板，每孔100 μL，接種12 h細(xì)胞全部貼壁后，設(shè)0，6，12，18，24，30 mmol·L-1濃度梯度的APAP進(jìn)行造模，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別在造模3，6，12，24，48 h后棄上清液，用CCK8檢測(cè)L02細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

2.4 Lut對(duì)APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷的影響 實(shí)驗(yàn)分6組，分別是對(duì)照組、模型組（APAP，12 mmol·L-1）、3個(gè)實(shí)驗(yàn)組（Lut，濃度分別為2.5，5，10 μmol·L-1）和陽(yáng)性對(duì)照組（五味子乙素[12]，Sch B，5 μmol·L-1）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L02細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為7×104個(gè)/mL，接種于96孔板中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組更換為相應(yīng)的含藥培養(yǎng)液，對(duì)照組和模型組更換新的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，除對(duì)照組外，其余各組加入APAP 12 mmol·L-1造模，造模12 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)后棄上清液，用CCK8檢測(cè)L02細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

2.5 AnnexinV FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將L02細(xì)胞按照1×105個(gè)/mL 接種到6孔板中，每孔2 mL，分組、給藥及造模同2.4項(xiàng)，造模12 h后，將L02細(xì)胞消化下來，按照Annexin VFITC/PI說明書方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)L02細(xì)胞凋亡情況。

2.6 培養(yǎng)液MDA，GSH及SOD水平的檢測(cè) 將L02細(xì)胞按照1×105個(gè)/mL 接種到6孔板中，分組、給藥及造模同2.4項(xiàng)，造模12 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中MDA含量、GSH及SOD活性。

2.7 RTPCR檢測(cè)Bcl2，Bax和caspase3 mRNA表達(dá) 分組、加藥及造模同2.2項(xiàng)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。造模12 h后收集細(xì)胞，應(yīng)用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以βactin為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)細(xì)胞中Bcl2，Bax和caspase3 mRNA的表達(dá)量。Bcl2，Bax和caspase3 引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0應(yīng)用軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CCK8檢測(cè)Lut對(duì)L02細(xì)胞活性的影響 為了尋找合適的Lut反應(yīng)濃度，本實(shí)驗(yàn)考察了Lut（2.5，5，10，20，40，80，160 μmol·L-1） 對(duì)L02細(xì)胞活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)Lut濃度在2.5，5，10 μmol·L-1時(shí)活性最強(qiáng)，故本實(shí)驗(yàn)采用2.5，5，10 μmol·L-1的濃度梯度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，見圖1。

3.2 APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷模型的建立 本研究首先考察APAP濃度和刺激時(shí)間對(duì)L02細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果顯示隨著APAP濃度的增加，L02細(xì)胞的存活率逐漸降低；隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，相同APAP濃度下的L02細(xì)胞的存活率逐漸降低。綜合考慮造模時(shí)間和造模濃度，以IC50為原則，實(shí)驗(yàn)中12 mmol·L-1APAP造模12 h的抑制率為（49.64±3.30）%，因此，本研究選擇造模時(shí)間為12 h和造模濃度為12 mmol·L-1的APAP進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，見圖2。

3.3 Lut對(duì)APAP誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷的影響 形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好、背景清晰，細(xì)胞貼壁牢固，單個(gè)細(xì)胞呈扁平的梭形，透明度大、遮光性均勻；模型組（APAP，12 mmol·L-1）細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，細(xì)胞數(shù)量減少，胞體縮小呈圓形。與模型組相比，Lut組和陽(yáng)性藥五味子乙素（Sch B）中的細(xì)胞狀態(tài)明顯改善，貼壁能力恢復(fù)明顯，胞體增大，多數(shù)細(xì)胞呈梭形。從L02細(xì)胞形態(tài)變化上可見，Lut 在一定程度上可顯著減輕APAP的損傷作用，提高細(xì)胞存活率，表明Lut對(duì)APAP損傷的L02細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，見圖3。

CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組中細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01），約為對(duì)照組的50%，Lut組（2.5，5，10 μmol·L-1）和Sch B組細(xì)胞活力較模型組均有升高的趨勢(shì)（P<0.05或P<0.01），尤以10 μmol·L-1 Lut組效果最為明顯，表明Lut對(duì)于APAP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，這與細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果一致，見圖3。

3.4 Lut 對(duì)L02細(xì)胞凋亡的影響 凋亡流式檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組（APAP，12 mmol·L-1）細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，Lut組（2.5，5，10 μmol·L-1）凋亡率顯著降低（P<0.05或P<0.01），其中10 μmol·L-1Lut組效果最為明顯，見圖4。結(jié)果表明，Lut可顯著抑制APAP誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡率=早期細(xì)胞凋亡率+晚期細(xì)胞凋亡率。

3.5 木犀草素對(duì)APAP誘導(dǎo)的L02細(xì)胞中MDA，GSH及SOD的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，APAP組MDA含量明顯升高，而GSH和SOD活性明顯降低（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比，不同濃度的Lut及Sch B可明顯降低MDA含量（P<0.05或P<0.01），同時(shí)明顯提高GSH和SOD活性（P<0.05或P<0.01），其中10 μmol·L-1 Lut組效果最為明顯，見表2。

3.6 Lut對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl2，Bax和caspase3表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，APAP組Bax和caspase3 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01），同時(shí)Bcl2 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01）；與模型組相比，Lut組Bax和caspase3 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05或P<0.01），同時(shí)Bcl2 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05或P<0.01），尤以10 μmol·L-1Lut組效果最為明顯，提示Lut具有明顯的抑制L02細(xì)胞凋亡的作用，見表3。

4 討論

近年研究表明Lut具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種作用。本研究通過建立APAP誘導(dǎo)的肝損傷模型，探討Lut對(duì)APAP誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。APAP 誘導(dǎo)建立的肝損傷模型是目前較為常用的肝損傷模型，此模型造模時(shí)間短、易復(fù)制、穩(wěn)定性好，是篩選保肝藥物的理想模型[1315]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APAP（12 mmol·L-1）能明顯抑制L02細(xì)胞活性，Lut干預(yù)后，與模型組比較，L02細(xì)胞活性明顯改善，其中10 μmol·L-1 Lut的藥效最為明顯。

氧化應(yīng)激在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中起著重要作用[16]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其高低常?？梢苑从持|(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD是平衡機(jī)體氧化與抗氧化的關(guān)鍵酶，能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD活性也是判斷細(xì)胞損傷程度的相關(guān)指標(biāo)。GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，清除體內(nèi)的超氧離子及其他自由基，防止肝細(xì)胞損傷。GSH 是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，其水平的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。因而本實(shí)驗(yàn)測(cè)定三者水平來反映細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。本研究顯示，與模型組相比，Lut組氧化指標(biāo)MDA含量明顯降低，抗氧化指標(biāo)GSH和SOD活性則顯著提高（P<0.05或P<0.01），研究初步表明木犀草素可通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)而達(dá)到抑制APAP誘導(dǎo)的肝損傷。

氧化應(yīng)激損傷可以引起細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，細(xì)胞數(shù)量減少，胞體縮小呈圓形；而Lut組細(xì)胞狀態(tài)較模型組明顯改善，貼壁能力恢復(fù)明顯，胞體增大。CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組中細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.01），而Lut組（2.5，5，10 μmol·L-1）的細(xì)胞活力較模型組均有升高的趨勢(shì)（P<0.05或P<0.01），尤以10 μmol·L-1 Lut組效果最為明顯。凋亡流式結(jié)果表明，APAP可明顯誘導(dǎo)L02細(xì)胞凋亡，Lut預(yù)給藥后的各組細(xì)胞凋亡數(shù)量與模型組相比明顯減少（P<0.05或P<0.01），以上結(jié)果表明Lut能夠抑制APAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是一種由多種基因參與調(diào)控的程序性死亡的過程，現(xiàn)已知多種基因與細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，包括Bcl2家族基因（Bcl2，Bclxl，Bax，Bad等），p53，F(xiàn)as，F(xiàn)asL等都參與了凋亡的調(diào)控[17]。Bcl2家族基因能抑制或激活凋亡，其中Bax和Bad等基因可促進(jìn)凋亡，而Bcl2和Bclxl等基因能抑制細(xì)胞凋亡[18]，Bax則通過抑制Bcl2的活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。caspase3屬于半胱氨酸蛋白酶家族一員，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。caspase3表達(dá)的增加、激活是外源性的死亡受體途徑和內(nèi)源性的線粒體途徑凋亡信號(hào)通路共同的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此是凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶[20]。RTPCR結(jié)果顯示，木犀草素是通過下調(diào)Bax和caspase3 mRNA及促進(jìn)Bcl2 mRNA的表達(dá)而抑制APAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，木犀草素通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)其對(duì)APAP誘導(dǎo)的L02細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。其機(jī)制可能與抑制脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)GSH和SOD活性，同時(shí)下調(diào)Bax和caspase3 mRNA及上調(diào)Bcl2 mRNA的表達(dá)有關(guān)，但詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

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[責(zé)任編輯 張燕]