賈 杰

檢測血清中腎綜合征出血熱(EHF)特異性抗體的方法較多，但大都用間接免疫熒光法(IFAT)。本文在IFAT的基礎上，加用第二熒光抗體(第三抗體)染色的方法——雙重免疫熒光法，檢測病人血清中EHF抗體，同時與IFAT比較，結果表明，雙重熒光法檢測EHF抗體敏感性高于常規(guī)法，特異性可靠，值得提倡應用，現(xiàn)介紹如下。

1材料與方法

1.1材料

EHF細胞抗原片、EHFV抗原和FITC—羊抗人IgG(1:4稀釋)均由浙江省疾病預防控制中心提供，批號分別為20060520、20060819和20060515。FITC—豬抗羊IgG為北京生物制品研究所產品，批號20060912，工作稀釋度1:40。EHF病人陽性血清34份，其中23份為本市病人血清；另11份由天臺縣疾病預防控制中心贈送；本市疑似病人血清21份。

1.2方法

IFAT法按參考文獻方法進行。雙重熒光法參照張龍興等所介紹方法進行。方法為：①待檢血清置56℃水浴滅活30min。②將已滅活血清從1:20開始連續(xù)2倍稀釋至1:2 560(稀釋液為pH 7.2 0.01M/LPBS)。

③將各稀釋度血清5μL按順序分別滴加抗原片孔內，37℃濕盒30min。④用pH為7.2 0.01M/L PBS振蕩輕洗2次(3～5min/次)，再用蒸餾水漂洗1次，吹干加FITC—羊抗人IgG，37℃濕盒30min。⑤取出后依照步驟④震洗，吹干后加FITC—豬抗羊IgG，37℃濕盒30min。⑥同前步驟PBS復洗吹干，用9:1甘油PBS封片后在熒光顯微鏡下檢查。結果判斷同參考文獻。

1.3阻斷試驗方法

將待檢血清與4單位EHFV抗原等量混勻，置37℃作用2h后，按1.2方法中②～⑥步驟進行測定。

2結果

2.1雙重熒光法的重復性和特異性

本次對34份EHF陽性血清、19份傷寒病人血清、16份麻疹病人血清和30份正常人血清在不同時間內重復測定3次。34份EHF陽性血清中僅1份有1次抗體下降1個滴度，其余33份陽性血清抗體滴度均一致。其他病種病人血清和正常人血清標本3次檢測均未出現(xiàn)假陽性，并對3份1:20滴度的血清作阻斷試驗，結果均為陰性，表明雙重熒光法檢測抗—EHF抗體良好的特異性和重復性，見表1。

2.2雙重熒光法和IFAT兩法結果比較

在對34份EHF陽性標本做雙重熒光試驗的同時用IFAT法進行比較。雙重法檢出的最低滴度為1:20(3例)，最高滴度為1:1280，幾何平均滴度為1:192。IFAT法測出最低滴度為1:20，最高滴度為1:640，幾何平均滴度為1:85。從兩法最低檢出滴度看，敏感性似乎相似，但在陽性數(shù)上雙重熒光法為3例，IFAT為5例，說明有2例IFAT法的敏感度較雙重熒光法低，再從1:40稀釋陽性例數(shù)上分析，雙重法較IFAT法高出2例，這其中可能包含了IFAT法1:20中的2例，但有1例IFAT法滴度高于雙重熒光法。兩法檢測抗體幾何均數(shù)經t檢驗差異有統(tǒng)計學意義(t=3.269，P＜0.01)，見表2。

2.3兩種熒光法檢測EHF疑似病人血清中抗體

用兩法同時對21例疑似病人血清進行檢測，雙重熒光法陽性檢出率為76.19％，而IFAT法為66.67％，前者較后者高8.52％。兩法陽性一致者14例，均陰性5例。而雙重熒光法陽性、IFAT法陰性者2例，未見IFAT法陽性而雙重熒光法陰性的例數(shù)。兩法檢出結果按確切概率法計算，P=0.002，差異有統(tǒng)計學意義。見表3：

3討論

雙重熒光法應用于EHF樣本的檢測，本實驗進行初步應用和探討。結果表明，雙重熒光法在抗體滴度敏感性和陽性檢出率上分別較IFAT法高2～8倍和8.52％，兩法檢測敏感度有統(tǒng)計學差異(P=0.01)。而從對2例雙重熒光法陽性、IFAT法陰性的樣本的阻斷試驗、30例正常人樣本的檢測結果中，顯示了雙重熒光法的可靠特異性。顯然雙重熒光法對一些臨界弱陽性標本可提高陽性檢出率，彌補IFAT法對這些標本的漏檢，對EHF的早期診斷、流行病學調查研究有重要價值。雙重免疫熒光法在EHF抗體的檢測中值得進一步研究和應用。