李艷華　高恒強　李　鵬　張延強

【摘要】 目的 調(diào)查我院2005年臨床分離多重耐藥銅綠假單胞菌(PA)的耐藥性分析并探討其耐藥基因的存在狀況。方法 對31株臨床分離的銅綠假單胞菌用紙片擴散法檢測其藥敏表型，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測β-內(nèi)酰胺酶編碼基因和外膜通道蛋白OprD2基因，并與相關(guān)藥敏表型比較。結(jié)果 31株銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的耐藥率為48．4%~100%；β-內(nèi)酰胺酶編碼基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的檢出率分別為6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未檢出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，檢出率為100%。結(jié)論 本院多重耐藥銅綠假單胞菌對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素的耐藥主要與外膜通道蛋白OprD2基因缺失有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】銅綠假單胞菌；多重耐藥；β-內(nèi)酰胺酶；聚合酶鏈反應(yīng)；基因型

Study on the resistant genes of β-lactam antibiotics of the multi-drug resistant mechanism of pseudomonas aeruginosa

LI Yan-hua，GAO Heng-qiang，LI Peng，et al.Peoples Hospital of Liaocheng,Shandong Province 252000，China

【Abstract】 Objective To survey the distribution of aminoglycoside-modifying enzyme genes in multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa isolated in our hospital in 2005．Methods The antibiotic susceptibility of 31 different antibiotics of P.aeruginosa was tested by K-B method，and 31 multi-drug resistant strains were screened;β-lactamase genes and the outer membrane protein OprD2 gene were detected by polymerase chain reaction(PCR).Results Resistant rates of 31 strains of P.aeruginas against 16 kinds of antibiotic ranged from 48．4%to 100%;the detection rate of β-lactamase gene PER，VIM，DHA，IMP，TEM and OXA-10 was 6．4%，3．2%，3．2%，3．2%，3．2%and 3．2%respectively，and none of the 31 strains possessed genes of GES，SHV and VER，31 isolate of PA lost the outer membrane protein OprD2 gene.Conclusion Resistance to β-lactam compounds in P.aeruginas of our hospital is related to lost the outer membrane protein.

【Key words】Pseudomonas aeruginosa; Multidrug resistance; β-Lactamases; Polymerase chain reaction; Genes

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是一種重要的條件致病菌，常常引起呼吸道感染、菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、燒傷感染和囊性纖維化繼發(fā)感染等多種疾病。2002年全國細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)調(diào)查顯示：PA的分離率為10．3%，僅次于大腸埃希菌而居第二位^[1]。由于臨床上抗生素的大量使用，銅綠假單胞菌呈現(xiàn)出天然或獲得性多重耐藥性(multidrug resistance，MDR)，給治療造成困難。近年來，銅綠假單胞菌對3、4代頭孢和亞胺培南在內(nèi)的多種β內(nèi)酰胺類抗生素及氨基糖苷類抗生素耐藥率一直處于一個比較高的水平，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢^[1-3]。為了解臨床分離多重耐藥的PA中耐藥情況，收集了本院2005年1~12月臨床分離的31株P(guān)A，對其進行耐藥性的檢測，并采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測其耐藥相關(guān)基因，結(jié)果報告如下。

1 材料

1．1 菌株 來源于本院2005年1~12月臨床分離的多重耐藥銅綠假單胞菌(MDRP)31株。所有標(biāo)本均采用法國生物梅里埃公司細菌鑒定儀鑒定菌種。

1．2 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1．3 MH培養(yǎng)基 采用英國Oxoid公司產(chǎn)品。

1．4 抗生素及藥敏紙片 頭孢他啶(30 μg/片，CAZ)、頭孢曲松(30 μg/片，CRO)、亞胺培南(10 μg/片，IMP)、克拉維酸(2 mmol/L，CA)、氯唑西林(2 mmol/L)、美羅培南(10 μg/片，MER)、2-巰基丙酸紙片均購自英國Oxoid公司。

1．5 微生物鑒定系統(tǒng) VITEK-32法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1．6 儀器 DNA擴增儀為美國PE公司產(chǎn)品。

1．7 PCR檢測試劑盒 由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

2 方法

2．1 細菌培養(yǎng)、鑒定和保存 細菌培養(yǎng)根據(jù)臨床檢驗操作規(guī)程按常規(guī)方法進行，采用VITEK-32全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果；將細菌接種于半固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后置-80℃冰箱保存，以備進行分子學(xué)檢測。

2．2 抗生素敏感試驗 采用紙片擴散法(K-B法)，結(jié)果根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)2004年版標(biāo)準(zhǔn)進行判斷。

2．3 PCR擴增模板制備 挑取菌落置入含100 μl生理鹽水的0．5 ml離心管內(nèi)，15 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，去上清。加0．05%非離子去污劑NP40 50 μl、200 ng/ml的蛋白酶K 2 μl混勻，55℃水浴1 h，然后95℃水浴5 min，最后10 000轉(zhuǎn)/min離心30 s，取上清做PCR擴增的模板。

2．4 基因檢測 均為PCR法。PCR擴增產(chǎn)物>500bp熱循環(huán)參數(shù)均為：93℃預(yù)變性2 min，然后93℃60 s→55℃60 s→72℃60 s，循環(huán)35個周期，最后一個72℃延長至5 min，其余均為：93℃預(yù)變性2 min，然后93℃30 s→55℃30 s→72℃60 s，循環(huán)35個周期，最后一個72℃延長至5 min。各種靶基因的目的產(chǎn)物長度見表1。

2．5 擴增產(chǎn)物檢測 擴增產(chǎn)物在1．5%瓊脂糖凝膠(含0．5 μg/ml溴化乙錠)120 V電泳30~40 min，全自動凝膠圖像成像儀觀察，出現(xiàn)與陽性模板分子量相同的條帶即為陽性，PCR檢測陽性對照DNA，由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所微生物DNA收集與保存室提供，擴增條件同上。

3 結(jié)果

3．1 藥敏試驗結(jié)果 31株銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的藥敏率見表2。

3．2 基因檢測結(jié)果 β內(nèi)酰胺酶編碼基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的檢出率分別為6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未檢出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，檢出率為100%。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，PA對β內(nèi)酰胺類抗生素存在多種耐藥機制，如外膜滲透性降低、泵出機制、由染色體編碼持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶^[4]以及能水解卡巴培能碳氫酶烯的金屬酶等。IMP是目前用于治療革蘭陰性桿菌感染具有最強抑菌效能的抗生素，對產(chǎn)ESBLs及AmpC酶的革蘭陰性桿菌均有效。IMP耐藥的PA在臨床上具有更大的危險性^[5]。

近年來隨著研究的深入，國內(nèi)外學(xué)者在PA菌臨床分離株中發(fā)現(xiàn)了多種β內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶基因如TEM^[6]、SHV^[6，7]、OXA^[8]、VEB-1、PER^[8，9]、GES、持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶、IMP^[10]、VIM^[11]、SPM^[12]等。在我國上海、杭州、石家莊、溫州相繼發(fā)現(xiàn)了VEB-1、OXA-10、IMP、PER-1、TEM-1、SHV基因^{[6，8，10]}。這些基因所表達的產(chǎn)物可以水解青霉素類、頭孢菌素類、單酰胺類和碳青霉烯類抗生素。

本組菌株中，表型耐亞胺培南的共31株(占100%)，其中外膜通道蛋白OprD2基因缺失為100%；VIM、IPM基因各發(fā)現(xiàn)1株，各占3．2%。PA對亞胺培南耐藥的主要原因為產(chǎn)IMP、VIM、SPM、GIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶、GES-2型β-內(nèi)酰胺酶和外膜蛋白OprD2缺失等。β內(nèi)酰胺類抗生素對PA的作用靶位是細菌內(nèi)膜上的PBP2，該類藥物要達到其作用靶位必須首先經(jīng)過外膜通道進入周漿間隙。如果菌株外膜蛋白通道減少或缺失，藥物難以到達其作用靶位，細菌將產(chǎn)生耐藥。因此，OprD2被認(rèn)為是亞胺培南擴散的通道^[11]。VIM、IMP是金屬β-內(nèi)酰胺酶，可快速水解青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗菌藥物。通過本組實驗研究可以表明PA對亞胺培南耐藥的主要原因是特異性通道OprD2缺失引起外膜通透性降低，從而阻礙抗菌藥物進入菌體內(nèi)到達細菌作用靶位。

OXA、TEM、SHV、PER、GES陽性均可引起PA對β內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物的廣泛耐藥。本組菌株中PER的陽性率為6．4%，TEM、OXA-10的陽性率為3．2%，而GES、SHV基因未檢出，這些基因的陽性率與國內(nèi)其他地區(qū)的檢測結(jié)果有差別^{[6，8，10]}。導(dǎo)致此種結(jié)果出現(xiàn)的原因應(yīng)與本地區(qū)抗菌藥物的使用情況有密切關(guān)系。

總之，PA的耐藥機制極為復(fù)雜，它對某一類抗菌藥物的耐藥往往不是由單一因素造成，而常是幾種機制協(xié)同作用的結(jié)果；它對不同抗菌藥物的耐藥機制也不完全相同，并不斷有新的耐藥機制出現(xiàn)。即使是同一種菌不同地區(qū)、不同時期其耐藥性和耐藥基因狀況也不相同。本實驗結(jié)果證明聊城地區(qū)的PA對各類抗菌藥物均有不同程度的耐藥性，且耐藥基因陽性率較有報道的國內(nèi)其他地區(qū)高。OprD2基因缺失應(yīng)該是本組菌株耐藥的主要原因，此情況應(yīng)引起臨床醫(yī)生和院內(nèi)感染科的高度重視，但也不排除同時存在其他耐藥機制的可能，有待進一步研究。

參 考 文 獻

［1］ 馬越，李景云，張新妹，等.2002年臨床常見細菌耐藥性監(jiān)測.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2004，27（1）：38-45.［2］ 王輝，陳民鈞.1994~2001年中國重癥監(jiān)護病房非發(fā)酵糖細菌的耐藥變遷.中華醫(yī)學(xué)雜志,2003，83（5）：385-390.

［3］ 段建春，呂曉菊.革蘭氏陰性菌對氨基糖苷類抗生素耐藥機制的研究進展.中國抗生素雜志,2004，29（6）：329-331.

［4］ 蔣曉飛，倪語星.銅綠假單胞菌產(chǎn)生的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2001，21（S1）：6-8.

［5］ 李智山，鄧三季，楊燕，等.綠膿假單胞菌β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因研究.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2005，28（10）：1030-1033.

［6］ 李超，周鐵麗，馬鵬鵬，等.SHV、TEM基因介導(dǎo)的銅綠假單胞菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測.現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2003，15(10)：615-617.

［7］ Poirel L，Lebessi E，Castro M，et al.Nosocomial outbreak of extended-spectrum beta-lactamase SHV-5-producing isolates of Pseudomonas aeruginosa in Athens，Greece.Antimicrob Agents Chemother，2004,48:2277-2279.

［8］ 侯天文，尹曉林，陳興，等.綠膿假單胞菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型分布.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2003，26(9)：465-548.

［9］ Pagani L，Mantengoli E，Migliavacca R，et al.Multifocal detection of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa producing the PER-1 extended-spectrum beta-lactamase in Northern Italy.J Clin Microbiol，2004,42:2523-2529.

［10］ 呂火祥，孫明洪，劉建棟，等.協(xié)同法過篩檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶的研究.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2002，25(4)：232-235.

［11］ Ochs M M，McCusker M P，Bains M，et al.Negative regulation of the Pseudomonas aeruginosa outer membrane porin OprD selective for imipenem and basic amino acids.Antimicrob Agents Chemother,1999,43:1085-1090.

［12］ Poirel L，Magalhaes M，Lopes M，et al.Molecular analysis of metallo-beta-lactamase gene bla(SPM-1)-surrounding sequences from disseminated Pseudomonas aeruginosa isolates in Recife，Brazil.Antimicrob Agents Chemother，2004,48:1406-1409.