楊晶晶等

摘要：對(duì)全鱗型黃金鯽和線鱗型黃金鯽的mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，并檢測(cè)了兩種類型黃金鯽肌肉的GPI和LDH同工酶。1尾黃金鯽（全鱗型）獲得了堿基排列順序清晰的1348 bp的片段，2尾黃金鯽（全鱗型）尾為1351 bp，3尾黃金鯽（均為線鱗型）為1349 bp。應(yīng)用MEGA6.0軟件與GenBank上的3個(gè)鯉魚(yú)（KC292935、KC292936和X61010.1）和3個(gè)鯽魚(yú)（KC292946、KC292947和KC292948）相應(yīng)區(qū)段比較結(jié)果表明，6尾黃金鯽與鯉魚(yú)和鯽魚(yú)的遺傳距分別為0.011和0.095，鯉魚(yú)與鯽魚(yú)的遺傳距為0.097。GPI與LDH兩種同工酶譜顯示兩種類型黃金鯽均具有來(lái)自鯉鯽雙方的遺傳物質(zhì)。結(jié)果表明，全鱗型與線鱗型黃金鯽均符合母本為鯉魚(yú)、父本為鯽魚(yú)的遺傳特征，推測(cè)線鱗型黃金鯽母本鱗被的基因型應(yīng)為SSNn、SsNn或ssNn，父本應(yīng)為SSnn，線鱗型黃金鯽鱗被的基因型應(yīng)為SSNn或SsNn。

關(guān)鍵詞：黃金鯽；鱗被；基因型；mtDNA；堿基序列；同工酶

黃金鯽為國(guó)家級(jí)天津市換新水產(chǎn)良種場(chǎng)培育的以框鱗鏡鯉為母本、紅鯽為父本的雜交種，2007年被國(guó)家認(rèn)定為養(yǎng)殖新品種（品種登記號(hào)：GS02-001-2007）。魚(yú)體背部及兩側(cè)呈淺黃色，腹部銀灰色，體被全鱗，鱗片中等大小，側(cè)線鱗31～34枚[1-2]。2013年11月份在天津市兩個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的黃金鯽中發(fā)現(xiàn)有線鱗型個(gè)體（90尾中有6尾線鱗型個(gè)體，占6.67%）。

鯉魚(yú)中依據(jù)鱗被特征可以分為鱗鯉（scaled carp）、線鱗鏡鯉（linear mirror carp）、散鱗鏡鯉（scattered mirror carp）和革鯉（leather carp）或裸鯉（nude carp）共四種類型，其中線鱗鏡鯉和裸鯉均含有N基因，而樓允東認(rèn)為在我國(guó)用于雜交的鯉魚(yú)品種不包括線鱗鏡鯉和革鯉[3-4]。至今在我國(guó)鯉鯽雜交子代中沒(méi)有關(guān)于線鱗型個(gè)體的報(bào)導(dǎo)。mtDNA為母性遺傳，其D-loop以及COⅠ等區(qū)段的序列分析可以作為種類鑒別的DNA條形碼[5-10]。同工酶可以有效鑒別鯉鯽雜交種[11-14]。

為探討線鱗型個(gè)體是否屬于黃金鯽，是否具有黃金鯽的遺傳結(jié)構(gòu)，鱗被遺傳特點(diǎn)如何，本研究以3尾全鱗型黃金鯽以及3尾線鱗型個(gè)體（以下也稱為黃金鯽）為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，與GenBank上的鯉魚(yú)、鯽魚(yú)的相應(yīng)區(qū)段進(jìn)行了序列比較。同時(shí)檢測(cè)了兩種類型黃金鯽肌肉的GPI和LDH同工酶。以期為黃金鯽的種質(zhì)鑒定以及鯉、鯽魚(yú)遺傳育種工作提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)魚(yú)

于2013年11月從天津市某魚(yú)類養(yǎng)殖場(chǎng)采集3尾全鱗型黃金鯽以及3尾線鱗型黃金鯽（圖1、表1）。鮮活狀態(tài)下剪取大小約1.0 cm×0.5 cm的鰭條用于DNA提取，-20 ℃冷凍保存魚(yú)體用于同工酶的檢測(cè)。

1.2DNA的提取、mtDNA D-loop及鄰近區(qū)段PCR擴(kuò)增

用苯酚-氯仿抽提法從鰭條提取總基因組DNA，4 ℃下保存?zhèn)溆肹15]。以提取的DNA為模板，使用L15923和H1067引物對(duì)每尾試驗(yàn)魚(yú)的mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，兩個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)分別位于tRNAThr和12S rRNA 編碼區(qū)上。將PCR產(chǎn)物委托深圳華大基因科技有限公司純化并測(cè)序，得到的序列依據(jù)峰圖進(jìn)行確認(rèn)[9]。

1.3DNA序列分析

使用MEGA6.0軟件對(duì)6個(gè)黃金鯽序列、GenBank上的3個(gè)鯉魚(yú)序列（KC292935、KC292936和X61010.1）和3個(gè)鯽魚(yú)序列（KC292946、KC292947和KC292948）進(jìn)行比對(duì)分析，計(jì)算6尾黃金鯽與鯉魚(yú)、鯽魚(yú)的遺傳距，構(gòu)建NJ樹(shù)[16]。

1.4同工酶電泳

使用水平式淀粉凝膠電泳法（緩沖液為C-APM）檢測(cè)試驗(yàn)魚(yú)背部肌肉的葡萄糖磷酸異構(gòu)酶（GPI）和乳酸脫氫酶（LDH），并與鯉、鯽對(duì)照。電泳及染色同鮑迪等采用的方法[14]。

2結(jié)果

2.1mtDNA D-loop 及其鄰近區(qū)段的PCR擴(kuò)增

對(duì)6尾黃金鯽的mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳均得到長(zhǎng)度大約為1600bp的DNA片段（圖2）。

2.2黃金鯽序列與GenBank中的鯉魚(yú)序列（KC292936）的比較

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、測(cè)序、峰圖確認(rèn)，獲得了堿基排列順序清晰的1348bp-1351 bp 的片段。與GenBank中的鯉魚(yú)序列（KC292936）進(jìn)行BLAST比對(duì)，有堿基插入現(xiàn)象，所得片段位于KC292936中的100至1447之間，包含部分tRNAThr、全部D-loop和部分tRNAPhe。6尾黃金鯽中1號(hào)和3號(hào)為1種單倍型、片段長(zhǎng)度為1351bp，2號(hào)為1種單倍型、片段長(zhǎng)度為1348bp，4號(hào)、5號(hào)和6號(hào)為1種單倍型、片段長(zhǎng)度為1349bp（表2）。

2.3黃金鯽與鯉、鯽的遺傳距離和系統(tǒng)樹(shù)

使用MEGA6.0對(duì)6尾黃金鯽和GenBank上的3個(gè)鯉魚(yú)序列和3個(gè)鯽魚(yú)序列進(jìn)行分析。6尾黃金鯽個(gè)體間、鯉魚(yú)3個(gè)序列間和鯽魚(yú)3個(gè)序列間的遺傳距分別為0.006、0.018和0.001。3尾全鱗型黃金鯽與3尾線鱗型黃金鯽、鯉及鯽的遺傳距分別為0.009、0.012和0.094，3尾線鱗型黃金鯽與鯉、鯽的遺傳距分別為0.010和0.096，鯉、鯽之間的遺傳距為0.097。12個(gè)序列間的NJ樹(shù)見(jiàn)圖3。

2.4同工酶

同工酶電泳分析結(jié)果表明全鱗型、線鱗型的GPI和LDH兩種同工酶均由來(lái)自于鯉、鯽雙方的遺傳物質(zhì)所支配（圖4）。

3討論

3.1線鱗型黃金鯽父母本的推測(cè)

線粒體DNA（mtDNA）為母性遺傳，其一些區(qū)段的RFLP或堿基序列可以用于物種的遺傳多樣性分析，也可以作為DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定[4-11]。本研究中得到的包含部分tRNAThr、全部D-loop和部分tRNAPhe 的DNA片段，3尾全鱗型黃金鯽與3尾線鱗型黃金鯽之間的遺傳距為0.009，3尾全鱗型黃金鯽和3尾線鱗型黃金鯽與GenBank中3個(gè)鯉魚(yú)序列的遺傳距分別為0.012和0.010，均小于2%，符合種內(nèi)遺傳特征[7-8，10]。由此可以認(rèn)為無(wú)論是全鱗型黃金鯽還是線鱗型黃金鯽，其母本均為鯉魚(yú)。同工酶是雜交種鑒別的有效手段之一[11-14]。全鱗型黃金鯽和線鱗型黃金鯽的葡萄糖磷酸變位酶（GPI）和乳酸脫氫酶（LDH）均具有鯉鯽雙方的遺傳物質(zhì)，符合鯉鯽雜交種的特性[11-12，14]。

3.2線鱗型黃金鯽鱗被基因型的推測(cè)

鯉魚(yú)鱗被是由S-s和N-n兩對(duì)基因控制，可分為四種類型，分別為鱗鯉（全鱗）（S-nn）、線鱗鏡鯉（S-Nn）、散鱗鏡鯉（ssnn）和革鯉（ssNn），NN個(gè)體不能存活[3-4]。歐鯽、丁鱥和鯉魚(yú)具有位于同源染色體上的同源基因，歐鯽與革鯉的雜交的子代中幾乎一半是全鱗型、一半是線鱗型，線鱗型鯉鯽雜種外形頗似線鱗鏡鯉[3]。由于鯉魚(yú)中NN個(gè)體不能存活，所以推測(cè)本研究中線鱗型黃金鯽母本鱗被的基因型應(yīng)為SSNn、SsNn或ssNn，這樣的母本與紅鯽雜交，理論上一半子代應(yīng)為全鱗型個(gè)體（SSnn或Ssnn）、另一半應(yīng)為線鱗型個(gè)體（SSNn或SsNn）。

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（收稿日期：2015-05-26）