劉琪等

摘要：采用中性蛋白酶對海馬粉進行酶解獲得酶解液，并對酶解液的抗氧化活性、抑菌活性和抗疲勞活性進行了測定。實驗結(jié)果表明，海馬酶解液對DPPH的清除率為：雄海馬45.2%，雌海馬36%；清除羥自由基率為：雄海馬81.7%，雌海馬80.0%；超氧陰離子清除率為：雄海馬46.0%，雌海馬34.4%。海馬酶解液同時具有抑菌活性，通過濾紙片法可以看出海馬酶解液對大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌和變形桿菌的抑制性比較強，而對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑制性較弱。海馬酶解液還具有抗疲勞活性，通過小鼠負重游泳實驗檢測海馬中性蛋白酶酶解液的抗疲勞活性，實驗組游泳時間平均為143 min，而對照組的游泳時間為91 min，相比之下實驗組比對照組高出52 min。進一步的研究結(jié)果還表明，海馬酶解液具有增加小鼠游泳耐力、增加小鼠血清中SOD活力、降低血清中MDA和尿素以及降低血乳酸的作用。

關(guān)鍵詞：海馬；中性蛋白酶；抗氧化活性；抑菌活性；抗疲勞活性

利用海洋生物資源進行藥物開發(fā)的系統(tǒng)研究始于20世紀60年代。70-80年代開始了大規(guī)模篩選，并發(fā)現(xiàn)了多種有生物活性的化合物，到20世紀90年代，則有多個海洋生物新藥進入臨床實驗。海馬（Hippocampus）作為刺魚目海龍科動物，還是一種具有較高經(jīng)濟價值的名貴中藥，具有強身健體、補腎壯陽、舒筋活絡(luò)、消炎止痛、鎮(zhèn)靜安神、止咳平喘等藥用功能，在中藥經(jīng)典著作中均有記載，歐洲從18世紀就已經(jīng)開始將海馬入藥。海馬中含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、微量元素及高碳多烯不飽和脂肪酸；具有抗癌作用、性激素樣作用、抗疲勞作用和提高機體免疫力、提高心肌細胞的收縮功能等，有待在食品、醫(yī)藥等方面進行研究開發(fā)[1]。

目前，市場上有許多關(guān)于海馬壯陽功效的產(chǎn)品，如泌陽春海馬膠囊，實驗表明具有明顯提高機體性功能的藥理作用[1]。但是關(guān)于海馬的抗氧化活性和抗疲勞活性報道的較少，報道較多的是海馬的性激素樣作用，例如用5種海馬的乙醇提取物，研究表明，灌服5種海馬的乙醇提取物后，雄性小鼠的精子數(shù)和精子成活率增加，但對正常小鼠的性腺和性器官幾乎無影響。

本實驗先利用中性蛋白酶對海馬進行酶解，對海馬酶解液進行抗氧化活性、抑菌活性和抗疲勞活性分別進行了測定。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

1.1.1試劑與材料海馬（克氏海馬）為雌、雄海馬，均購自大連美羅大藥房；硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸溶液、冰醋酸均為分析純；中性蛋白酶（250 g，Beijing Solarbio）；乙腈（色譜純，百靈威科技有限公司）； N，N-二甲基甲酰胺（分析純，天津博迪化工股份有限公司）。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus），變形桿菌（Bacterium Proteus），枯草桿菌（Bacillus Subtilis），大腸桿菌（Escherichia coli），產(chǎn)氣桿菌（clostridium perfingens）均來自大連海洋大學(xué)食品工程學(xué)院微生物實驗室；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（生產(chǎn)批號20130406）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（生產(chǎn)批號20130406）、尿素氮（BUN）測定試劑盒（生產(chǎn)批號20130410）、乳酸（LD）測定試劑盒（生產(chǎn)批號20130417） 購于南京建成生物研究所。DPPH，濃H2SO4，Tris-HCl緩沖溶液，95%乙醇，水楊酸，鹽酸，鄰苯三酚，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，中性蛋白酶，胰蛋白酶酶解，牛肉膏，瓊脂，無水乙醇，氯化鈉，葡萄糖，鹽酸，氫氧化鈉等均為分析純，20只昆明小鼠（清潔級，大連醫(yī)科大學(xué)提供），PBS緩沖液，鼠糧，木屑，鉛絲。緩沖溶液和實驗室用水均用Milli-Q凈化處理器制備。

1.1.2儀器與設(shè)備Milli-Q超純水凈化儀（Millipore公司，美國）。高速多功能粉碎機（上海冰都有限公司）。Pb-10型pH計（德國賽得利斯Sartorius）。TGL-16M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。消化爐（Buchi Digestion Unit K-424），蒸餾儀（Buchi Distillation Unit K-350）。SP-752紫外分光光度計（上海光譜有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），YXQ-SG42-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺（SW-CJ-1F），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

1.2海馬樣品的制備及溶液配制方法

將海馬雌雄分開，剪碎，用高速粉碎機將其粉碎，得到雌雄海馬粉末樣品，碎屑，稱重，將其裝入棕色廣口瓶中，備用。

準確稱取0.500 0 g的海馬粉末，加入配制好的磷酸鹽緩沖溶液100 mL，加入一定量的酶，在水浴鍋里反應(yīng)一定時間，反應(yīng)完后放入100 ℃的水浴鍋中滅酶10 min，等冷卻到室溫后將酶解液過0.45 μm濾膜過濾，4 ℃冰箱中保存，作為樣品儲備液備用。

1.3海馬中蛋白質(zhì)以及灰分含量的測定

1.3.1海馬中蛋白質(zhì)含量的測定將海馬樣品進行消化：將樣品進行分組，雄海馬粉末，雄海馬碎屑，雌海馬粉末，雌海馬碎屑。分別準確稱取海馬樣品0.500 0 g，小心移入干燥潔凈的500 mL消化管，然后加入研細的硫酸銅0.500 0 g，硫酸鉀10.000 0 g和濃硫酸20 mL，空白組除了不加樣品外其他和實驗組一樣，輕輕搖勻后放入電路中加熱，至液體變?yōu)樗{綠色透明后停止。

樣品的蒸餾與滴定：分別將消化完全的消化液冷卻后，完全轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。準確移取消化稀釋液10 mL于蒸餾儀內(nèi)的消化管中，再加入10 mL，400 g/L氫氧化鈉溶液使其呈強堿性。蒸餾儀中的冷凝管下端預(yù)先插入盛有10 mL，40 g/L硼酸吸收液的液面下，吸收液中帶有混合指示劑，蒸餾5 min后停止。餾出液用0.1 mol/L HCl標準溶液滴定至微紅色為終點。同時做空白試驗。

結(jié)果計算：海馬種中蛋白質(zhì)的含量按下式計算：

1.3.2海馬中灰分含量的測定分別準確稱取雄海馬粉末、碎屑各1 g，雌海馬粉末、碎屑各1 g于已知質(zhì)量的坩堝中，經(jīng)預(yù)處理后的海馬置于調(diào)溫電爐上以小火加熱使試樣充分碳化至無煙為止。將碳化好裝有試樣的坩堝用坩堝鉗移至高溫爐中，在（550±25）℃下灼燒4 h，待高溫爐爐溫降至200 ℃以下后取出坩堝，冷卻至室溫。

結(jié)果計算：海馬中灰分的含量按下式計算：

1.4海馬酶解液的活性研究

1.4.1海馬酶解液抗氧化活性的研究海馬酶解液清除DPPH的能力：準確量取2 mL海馬酶解液，然后加入2 mL所配制的DPPH溶液并混合均勻后，25 ℃水浴反應(yīng)30 min，移入比色皿中517 nm測其吸光度Ai，同時測定2 mL樣液加入2 mL乙醇25 ℃水浴反應(yīng)30 min后的吸光度Aj，2 mL的DPPH加2 mL的乙醇25 ℃反應(yīng)30 min的吸光度A0。則海馬酶解液的DPPH清除率按下式計算：

海馬酶解液清除羥自由基的能力：準確量取海馬酶解液2 mL，然后加入3 mmol/L的FeSO4 2 mL，6 mmol/L的水楊酸-乙醇2 mL，最后加入質(zhì)量分數(shù)為3.75%的雙氧水2 mL啟動反應(yīng)，在37 ℃反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm下測吸光度，考慮到樣本本身的吸光度Ai，取蒸餾水2 mL，3 mmol/L的FeSO4 2 mL，6 mmol/L的水楊酸-乙醇2 mL和樣液2 mL作為本底吸收Aj， 取蒸餾水2 mL，3 mmol/L的FeSO4 2 mL，6 mmol/L的水楊酸-乙醇2 mL，最后加入質(zhì)量分數(shù)為3.75%的雙氧水2 mL啟動反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)30 min的吸光度A0。則海馬酶解液對羥基自由基的清除率按下式計算：

1.4.2海馬酶解液的抑菌活性

培養(yǎng)基的制作：取牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，水1 L，調(diào)pH值到7.0～7.2之間，加熱融化，然后在121 ℃滅菌20 min后備用。

菌懸液的配制：從經(jīng)過活化的菌體斜面上挑取一環(huán)菌體接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基上，放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別吸取各供試液0.5 mL，加入無菌水稀釋，備用。

平涂法接種：在無菌操作臺里，將融化好的培養(yǎng)基均勻的倒在平板上，等培養(yǎng)基冷卻好后，在培養(yǎng)皿的底部用記號筆劃出均勻的區(qū)域，點燃酒精燈，將三角玻璃棒進行滅菌，在將酒精燈旁分別用移液槍取出100 μL的五種菌懸液，用三角玻璃棒將菌懸液均勻的涂布在培養(yǎng)基上。

濾紙片法測海馬酶解液的抑菌活性：經(jīng)平涂接種發(fā)后，當(dāng)培養(yǎng)基上的菌懸液完全滲透到培養(yǎng)基上時，用無菌鑷子將小濾紙片輕輕的貼在平板上，濾紙片一旦貼上就不可拿起，然后取酶解液樣品和75%乙醇（作為陽性對照）各10 μL滴在濾紙片上，每個平板貼6張濾紙片，一張為空白對照，每張濾紙片的間距不得少于24 mm。待干后將放有樣品的培養(yǎng)皿倒過來放在恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈的大小。

1.4.3海馬酶解液的抗疲勞活性實驗動物的飼養(yǎng)與給藥：昆明種小鼠20只，體重18～22 g。隨機分為兩組，分組后飼養(yǎng)觀察3 d，剔除不合格個體后按小鼠體重平均分為兩組給藥，空白對照組灌胃PBS緩沖液0.2 mL/d，陽性對照組灌胃中性蛋白酶的海馬酶解液0.2 mL/d。連續(xù)灌胃15 d，實驗期間小鼠自由攝食飲水。

酶解液對小鼠游泳時間的影響以及體內(nèi)指標的變化：給藥第15 d后，末次灌胃半小時后進行負重游泳實驗。小鼠負重為小鼠體重5%的鉛絲，將兩組小鼠分別放入兩個水溫（25±1） ℃、水深40 cm的水槽中同時游泳，記錄小鼠從入水至運動疲勞發(fā)生時的游泳時間。以小鼠頭部沒入水面以下7 s不再上浮判定為疲勞。

1.4.3.1小鼠血清SOD和MDA的測定小鼠連續(xù)灌胃15 d，在末次灌胃30 min后，小鼠自由游泳5 min后取出，斷頭取血。血樣置冰箱靜置后，3 500 r/min離心10 min，取上清液，分別按照SOD測定試劑盒MDA測定試劑盒說明書方法測定實驗組和對照組血清中SOD和MDA含量。

1.4.3.2小鼠肌乳酸、血清尿素含量的計算取斷頭取血的血樣，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按照LD測定試劑盒說明書方法測定LD。按照BUN測定試劑盒說明書方法測定斷頭取血所得的血清中BUN含量。

2結(jié)果與討論

2.1海馬中蛋白質(zhì)含量測定

海馬中蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果見表1，由結(jié)果可以看出雄海馬粉末蛋白質(zhì)含量為55.83%，雌海馬粉末的蛋白質(zhì)含量為49.00%。蛋白質(zhì)在人體含量的多少決定了物質(zhì)營養(yǎng)價值的高低的重要指標，從表中可以看出海馬蛋白質(zhì)含量高達52.42%，但是本實驗采用的蛋白質(zhì)含量的測定方法為凱氏定氮法，屬于元素分析的范疇，因此，從測定結(jié)果看蛋白質(zhì)含量較高，但是考慮到海馬體內(nèi)還含有其他的含氮生物分子，該結(jié)果只是作為隨后的氨基酸分析的依據(jù)。

2.2海馬中灰分含量測定

海馬中灰分含量測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，雌雄海馬的灰分分別為12.3%，12.6%。雌雄海馬的灰分含量相差不大，雌雄海馬灰分的平均含量為12.45%。

2.3海馬中性蛋白酶酶解液的活性研究

2.3.1海馬酶解液抗氧化活性

2.3.1.1海馬酶解液對DPPH的清除率從表3可以看出海馬酶解液對DPPH有一定的清除能力，其清除能力與多肽和水解的氨基酸有關(guān)。其中，雄海馬的中性蛋白酶酶解液對DPPH的平均清除率為45.2%；雌海馬的中性蛋白酶酶解液對DPPH的平均清除率為36.0%。

2.3.1.2海馬酶解液對羥基自由基的清除率通過表4可以看出海馬酶解液對·OH有顯著的清除效果。其中，雄海馬的中性蛋白酶酶解液對·OH的清除率為81.7%；雌海馬的中性蛋白酶酶解液對·OH的清除率為80.03%；可以看出，雄海馬酶解液對·OH的清除率要好于雌海馬酶解液。

2.3.1.3海馬酶解液對超氧陰離子自由基的清除率通過表5可以看出，海馬酶解對O2-有一定的清除能力。其中，雄海馬的中性蛋白酶酶解液對O2-的清除率為46.0%；雌海馬的中性蛋白酶酶解液對O2-的清除率為34.4%。通過比較表3-12兩組數(shù)據(jù)可以看出，雄海馬酶解液對O2-的清除率要高于雌海馬酶解液。

34.42.3.2抑菌活性實驗結(jié)果通過表6的數(shù)據(jù)可以看出，海馬酶解液對大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌和變形桿菌的抑制性比較強，而對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑制性不是很強。其中對變形桿菌抑制作用最強的是雄海馬的中性蛋白酶酶解液；對枯草桿菌抑制作用最強的是雄海馬的中性蛋白酶酶解液；對產(chǎn)氣桿菌的抑制，雌雄海馬的中性蛋白酶酶解液作用強度基本相同；對大腸桿菌的抑制作用最強的是雄海馬的中性蛋白酶酶解液；但是每一種樣品都不可能對所有菌種均有抑制作用，整體來看海馬中性蛋白酶酶解液有一定的抑菌活性，可以用于進一步的研究。

從上面四組表格可以看出這樣一個共性：雄海馬的抗氧化活性和抑菌活性均優(yōu)于雌海馬，原因可能是雄海馬有育兒的義務(wù)，體內(nèi)的優(yōu)質(zhì)蛋白要高與雌海馬。這與前面測得的雄海馬的蛋白質(zhì)含量高于雌海馬的結(jié)果是一致的。

2.3.3抗疲勞活性實驗結(jié)果灌服海馬酶解液對小鼠游泳時間的影響見表7，可以看出，連續(xù)灌服海馬酶解液15 d對小鼠的體重略有變化，但是不是很顯著。從表中可以看出，灌服海馬酶解液的實驗組小鼠的游泳時間達到143 min，極顯著高與對照組93 min。小鼠游泳時間的延長，表明海馬酶解液能延緩運動性疲勞出現(xiàn)的時間。但是僅憑運動時間還不足以說明海馬酶解液具有運動性抗疲勞的作用，還需要一些生化指標來說明。

2.3.3.1海馬酶解液對小鼠血清SOD、MDA的影響總超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）是一種新型的酶制劑，廣泛存在于需氧原核生物和真核生物中，能夠清除體內(nèi)的活性氧自由基。在機體代謝過程中會產(chǎn)生大量的活性氧和自由基，它可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物。如醛基、酮基、羥基以及新的氧自由基等?？梢姵趸锲缁笇C體起到保護免受損傷的作用。同時可測定丙二醛（Maleic Dialdehyde，MDA）的含量以此來反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。實驗結(jié)果見表8。

從表8的數(shù)據(jù)可知，實驗組小鼠血清中SOD活力比對照組高了13.5%。實驗組小鼠血清中MDA含量比對照組降低了42.53%。運動可以引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)從而產(chǎn)生自由基，自由基對肌肉細胞造成損害，從而產(chǎn)生疲勞。SOD酶能清除超氧陰離子自由基（O2-·），保護細胞免受損傷，因此能夠降低疲勞的程度。灌服海馬酶解液的小鼠血清中SOD含量明顯增加，因此有助于減少自由基的堆積，延緩疲勞。MDA是脂質(zhì)自由基氧化產(chǎn)物之一，它的高低間接反應(yīng)了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。灌服海馬酶解液的小鼠血清中MDA含量的減少，也表明海馬酶解液有助于降低自由基氧化過程，抵抗機體的疲勞。因此，灌服海馬酶解液的小鼠延緩了疲勞的出現(xiàn)。

2.3.3.2海馬酶解液對小鼠肌乳酸含量及血清尿素的影響尿素是人體內(nèi)蛋白代謝的主要終產(chǎn)物，它構(gòu)成了血液中絕大部分的非蛋白氮。血中尿素氮來源于肝臟，通過腎臟隨尿液排除體外。腎臟功能衰竭、腎炎、泌尿道梗阻等可使血液尿素氮含量升高。而乳酸含量越多，疲勞程度越重[2]。結(jié)果見表9。

從表9的數(shù)據(jù)可知，實驗組小鼠乳酸含量比對照組降低4.8%。實驗組小鼠血清尿素含量比對照組降低3.0%。動物劇烈運動后，無氧糖酵解過程產(chǎn)生的乳酸堆積，是產(chǎn)生疲勞的一個重要原因。灌服海馬酶解液的實驗組乳酸堆積程度小于對照組，提示海馬酶解液具有加速乳酸清除代謝的作用。血清中尿素含量隨著運動負荷的增加而增加，機體對負荷適應(yīng)能力越強，血清中尿素含量就越少。實驗結(jié)果表明，灌服海馬酶解液的實驗組血清中尿素含量低于對照組，表明海馬酶解液在一定程度上可以提高小鼠運動負荷能力，抵抗疲勞。

3結(jié)論

海馬的粉末經(jīng)過中性蛋白酶酶解后含有豐富的多肽和氨基酸，這些多肽和氨基酸具有抗氧化活性。實驗證明海馬酶解液對DPPH的清除率為：雄海馬45.2%，雌海馬36%；清除羥自由基率為：雄海馬81.7%，雌海馬80.0%；超氧陰離子清除率為：雄海馬46.0%，雌海馬34.4%。海馬酶解液同時具有抑菌活性。通過濾紙片法可以看出海馬酶解液對大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌和變形桿菌的抑制性比較強，而對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑制性不是很強。海馬酶解液還具有抗疲勞活性。通過小鼠負重游泳實驗檢測海馬中性蛋白酶酶解液的抗疲勞活性，實驗組游泳時間平均為143 min，而對照組的游泳時間為91 min，相比之下實驗組比對照組高出52 min。研究結(jié)果還表明了海馬酶解液具有增加小鼠游泳耐力、增加小鼠血清中SOD活力、降低血清中MDA和尿素以及降低血乳酸的作用。實驗結(jié)果表明，海馬可作為海洋藥物開發(fā)的潛在優(yōu)質(zhì)原料。

參考文獻：

[1]黃建設(shè)，龍麗娟. 海洋天然產(chǎn)物及其生理活性的研究進展[J].海洋通報，2001，20 （4）：83-90

[2] 李偉，于新瑩，佟長青，金橋，孔亮. 大鯢黏液酶解產(chǎn)物的制備及其抗疲勞作用研究[J].食品工業(yè)科技，2010，32（6）：146-149

（收稿日期：2015-05-14）