郝曉艷　郭樹(shù)忠

角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor,KGF)是由間質(zhì)細(xì)胞分泌的，通過(guò)旁分泌途徑刺激上皮增殖的細(xì)胞因子。研究表明KGF在組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著很重要的作用，這些作用主要是KGF通過(guò)加強(qiáng)上皮屏障功能完成，包括促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移、分化、存活等。重組人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子Palifermin已由FDA批準(zhǔn)用于治療放化療導(dǎo)致的嚴(yán)重口腔粘膜炎。本文將對(duì)KGF的生物學(xué)特性、表達(dá)調(diào)控、生物學(xué)功能、及重組KGF的研究和應(yīng)用進(jìn)行討論。

1KGF的生物學(xué)特性

角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）是1989 年由Rubin 等[1]首先從人胚胎肺成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)液中分離出來(lái)的單鏈多肽，分子量為26～28 kDa。KGF 的cDNA 編碼194個(gè)氨基酸，包含一分泌所需的信號(hào)肽和N端的糖基化位點(diǎn)。重組人KGF（recombinant human KGF,rhKGF）在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生分子量21kDa的活性蛋白，rhKGF與天然的KGF分子量的差異主要是因?yàn)椴溉閯?dòng)物中表達(dá)的KGF進(jìn)行了糖基化修飾，但這種翻譯后的修飾對(duì)于其生物活性不是必需的，而且rhKGF的活性約是從成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中分離得到的天然KGF的10倍?；蛐蛄蟹治霰砻鱇GF從屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)家族,也稱(chēng)FGF7。KGF與FGF1、FGF2相比，同源序列大約位于KGF編碼區(qū)羧基端的2/3處。在這個(gè)同源序列區(qū)，KGF與其它成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員約有30%～45%的同源性。除人胚胎肺成纖維細(xì)胞表達(dá)KGF外，很多組織的間質(zhì)細(xì)胞都可表達(dá)KGF，比如成年人的肺、皮膚、乳腺、胃、膀胱及前列腺等。最先一直認(rèn)為上皮細(xì)胞不表達(dá)KGF,后來(lái)的一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)KGF除主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞外，一些上皮細(xì)胞也可表達(dá)KGF,如豬子宮內(nèi)膜上皮、培養(yǎng)的牛卵巢上皮、及晶狀體上皮細(xì)胞。此外皮膚、胃腸道、陰道內(nèi)活化的細(xì)胞也可表達(dá)KGF，而內(nèi)皮內(nèi)或淋巴結(jié)內(nèi)的細(xì)胞和細(xì)胞均檢測(cè)不到KGF的表達(dá)，而從胸腺分離的T細(xì)胞可表達(dá)KGF，CD3-、CD4－、CD8－的胸腺細(xì)胞未檢測(cè)出表達(dá)KGF，但CD4+、CD8+的胸腺細(xì)胞可表達(dá)KGF[2]。血管平滑肌細(xì)胞如猴子宮螺旋動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、培養(yǎng)的人隱靜脈、髂動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞也可表達(dá)有活性的KGF。KGF在黑色素細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)也可表達(dá)。KGF可作用于鼠上皮細(xì)胞、人乳腺上皮細(xì)胞、猴氣管上皮細(xì)胞、人角質(zhì)細(xì)胞、鼠和人前列腺上皮細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞、2型肺泡細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞和牛卵巢顆粒細(xì)胞。KFG對(duì)成纖維細(xì)胞、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，黑色素細(xì)胞沒(méi)有作用。一直以來(lái)認(rèn)為KGF與其他FGF不同的是KGF的靶細(xì)胞僅為上皮細(xì)胞，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)也可促進(jìn)角膜及小血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而在這些細(xì)胞不能檢測(cè)到其特異性受體FGF2b的表達(dá)，所以KGF是否是通過(guò)其他高親和受體作用于血管內(nèi)皮，還有待進(jìn)一步研究。

2KGF表達(dá)的調(diào)控

巨噬細(xì)胞和多形核粒細(xì)胞分泌大量的致炎因子IL-1和IL-6，IL-1和IL-6能促進(jìn)成纖維細(xì)胞內(nèi)KGF基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成。角質(zhì)細(xì)胞本身分泌IL-1通過(guò)c-Jun和c-JunB轉(zhuǎn)錄因子刺激成纖維細(xì)胞表達(dá)KGF和GM-CSF，然后KGF和GM-CSF通過(guò)旁分泌的方式刺激角質(zhì)細(xì)胞增值和分化[3]。角質(zhì)細(xì)胞分泌的甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白也可刺激成纖維細(xì)胞表達(dá)KGF，然后KGF又通過(guò)旁分泌的方式促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化。局部出血導(dǎo)致血小板浸潤(rùn)，釋放一系列生長(zhǎng)因子，包括血小板源衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和表皮生長(zhǎng)因子，后者又刺激成纖維細(xì)胞表達(dá)KGF，通過(guò)KGF脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染鼠急性傷口發(fā)現(xiàn)PDGF表達(dá)水平與對(duì)照組相比沒(méi)有變化，這也進(jìn)一步證實(shí)了PDGF在組織損傷修復(fù)過(guò)程中位于KGF信號(hào)的上游[4]。此外TNF- 也可刺激成纖維細(xì)胞表達(dá)KGF。性甾體類(lèi)激素可通過(guò)作用于間質(zhì)細(xì)胞，使KGF的表達(dá)量上調(diào)來(lái)影響精囊、前列腺、子宮內(nèi)膜的上皮，雄激素刺激成年鼠前列腺的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)KGF，也可刺激正常人前列腺間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)FGF-10，黃體酮和雌激素也能使KGF表達(dá)上調(diào)。糖皮質(zhì)激素對(duì)KGF的表達(dá)起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，地塞米松可減少KGF基因的轉(zhuǎn)錄以及減弱KGF轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

3KGF的生物學(xué)功能

KGF表達(dá)量上調(diào)見(jiàn)于鼠和人全層皮膚損傷、膀胱手術(shù)損傷、化療藥物導(dǎo)致的肝損傷、新生兔缺氧性肺損傷、博來(lái)霉素導(dǎo)致的急性肺損傷，人炎癥性腸病以及銀屑病。而在所有這些疾病中，上皮細(xì)胞均表達(dá)了KGF的特異性受體FGFR2b，這就提示KGF參與了各種上皮的保護(hù)和修復(fù)過(guò)程。KGF脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染鼠急性傷口后再上皮化加速、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、KGF、FGF、VEGF和Ⅳ型膠原表達(dá)增加。Jeschke等[5]也證實(shí)了這一結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)IGF-1和KGFcDNA共轉(zhuǎn)染后VEGF表達(dá)量高于單一轉(zhuǎn)染，血管新生作用也可增強(qiáng)。KGF脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后PDGF的表達(dá)無(wú)差異，而 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的表達(dá)減少( GF-)，已知PDGF與傷口周?chē)缙谘装Y反應(yīng)有關(guān)，TGF- 可促進(jìn)Ⅰ型膠原的合成，從而導(dǎo)致瘢痕的發(fā)生。所以KGFcDNA治療促進(jìn)再上皮化但同時(shí)即不加重炎癥反應(yīng)也不促進(jìn)瘢痕形成。

促有絲分裂作用：KGF可促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成，如人和鼠角質(zhì)細(xì)胞、猴支氣管上皮細(xì)胞、人和鼠前列腺上皮細(xì)胞，鼠肝細(xì)胞、Ⅱ型肺泡細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞和牛卵巢顆粒細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因與KGF的促有絲分裂作用相關(guān)，如c-myc、c-fos，這二者是多種細(xì)胞分化所必需的最初應(yīng)答基因。除此之外，還發(fā)現(xiàn)一些調(diào)控核酸合成的關(guān)鍵酶的基因，如腺苷酸琥珀酸裂解酶，以及嘌呤從頭合成和旁路合成的相關(guān)酶，添加KGF后，這些酶在HaCaT角質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)，提示KGF與核酸的合成有關(guān)，為DNA的復(fù)制和RNA的合成提供足夠原料。另一個(gè)通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)與KGF促進(jìn)DNA合成有關(guān)的基因是與酵母同源的CHL-1基因，這個(gè)基因編碼能使染色體分離的解螺旋酶。而且KGF 可誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞表達(dá) 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-，后者是另一種上皮促有絲分裂源，這就放大了KGF促上皮細(xì)胞的有絲分裂作用。

促進(jìn)細(xì)胞遷移作用：KGF可通過(guò)劑量依賴(lài)性促進(jìn)正常人角質(zhì)細(xì)胞的遷移，該作用可被KGF中和抗體抑制。KGF作用于角質(zhì)細(xì)胞使得角質(zhì)細(xì)胞對(duì)膠原和纖維連接蛋白的粘附能力增強(qiáng)，這便有利于角質(zhì)細(xì)胞在這些基質(zhì)上的遷移。KGF在體外實(shí)驗(yàn)中也可誘導(dǎo)Ⅱ型肺泡細(xì)胞的遷移。在再上皮化過(guò)程中，角質(zhì)細(xì)胞先脫離基底膜然后開(kāi)始遷移，再上皮化過(guò)程還需降解傷口周?chē)哪獕K、真皮及肉芽組織。多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)參與了這一過(guò)程。KGF可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞合成MMP-1，KGF也可直接誘導(dǎo)MMP-9、MMP-10、MMP-13以及尿激酶型纖維蛋白溶解酶原激活質(zhì)。這些提示KGF調(diào)控著傷口愈合組織重塑過(guò)程中酶的表達(dá)[6]。

調(diào)控細(xì)胞分化作用：KGF通過(guò)誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞終末分化的標(biāo)記分子來(lái)促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的分化，如誘導(dǎo)整合素的表達(dá)，延遲角蛋白和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的表達(dá)。GF也可影響肺上皮細(xì)胞的分化，在肺受到損傷后，Ⅱ型肺泡細(xì)胞分化成Ⅰ型肺泡細(xì)胞參與氣體交換。Ⅱ型肺泡細(xì)胞與KGF一同培養(yǎng)時(shí)，可長(zhǎng)時(shí)間保持Ⅱ型肺泡細(xì)胞的形態(tài)，誘導(dǎo)成Ⅰ型肺泡細(xì)胞的時(shí)間也延長(zhǎng)，Qiao等[7]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)KGF通過(guò)激活c-Jun轉(zhuǎn)錄因子來(lái)維持Ⅱ型肺泡細(xì)胞形態(tài)。重組KGF可誘導(dǎo)胃腸道內(nèi)分泌粘蛋白的杯狀細(xì)胞的分化。KGF也可促進(jìn)胰腺外分泌細(xì)胞分化成導(dǎo)管上皮細(xì)胞。

3.4 抗調(diào)亡作用：KGF可使放線菌D和腫瘤壞死因子TNF誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡減少。在全腸外營(yíng)養(yǎng)的小鼠模型，胃腸道上皮細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重凋亡，給予KGF后可減少細(xì)胞凋亡以及增加抗凋亡蛋白Bal-2的表達(dá)[8]。在肺，KGF不僅刺激Ⅱ型肺泡細(xì)胞增殖，同時(shí)維持其形態(tài)，防止其凋亡以及分化成Ⅰ型肺泡細(xì)胞。KGF也可抑制缺氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，可能是通過(guò)抑制凋亡介導(dǎo)分子的表達(dá)，如p53、p21、Bax和Bcl-x。上文提到黃體酮可刺激KGF的表達(dá)，Slayden等[9]發(fā)現(xiàn)外源的KGF可抑制黃體期基底層細(xì)胞的凋亡，這對(duì)螺旋動(dòng)脈的營(yíng)養(yǎng)供給起重要影響。

3.5細(xì)胞保護(hù)作用：損傷使得KGF大量表達(dá)，并參與損傷組織的修復(fù)過(guò)程。而且KGF對(duì)外源致傷因子可能造成的細(xì)胞損傷具有防護(hù)作用。外源KGF可減輕高氧造成的肺損傷。氧化應(yīng)激最早效應(yīng)是細(xì)胞DNA鏈的斷裂，這將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)KGF可減少高氧導(dǎo)致的A549肺泡上皮細(xì)胞DNA鏈的斷裂。KGF也可防止體內(nèi)缺氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞死亡，它通過(guò)激活抗凋亡S6激酶、Akt信號(hào)旁路[10]。KGF可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)Nrf-2轉(zhuǎn)化因子的表達(dá)，而后者調(diào)控多種酶的表達(dá)，而這些酶對(duì)活性氧(ROS)具有解毒功能,皮膚損傷后巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)ROS水平很高，主要是防御入侵的細(xì)菌，但是ROS也破壞臨近細(xì)胞。因此KGF有效的細(xì)胞保護(hù)作用是通過(guò)加強(qiáng)對(duì)活性氧的解毒功能而實(shí)現(xiàn)的[11]。此外KGF也可同UVB一樣通過(guò)激活KGFR并誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生內(nèi)化，從而介導(dǎo)黑色素顆粒從黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角質(zhì)形成細(xì)胞，保護(hù)皮膚免于UVB的損傷[12]。

4重組KGF(rKGF)的研究

重組人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子Palifermin已由FDA批準(zhǔn)用于治療放化療導(dǎo)致的嚴(yán)重口腔粘膜炎，這就需要大量具有生物活性的rhKGF，但是rhKGF在細(xì)菌內(nèi)的產(chǎn)出率很低，有時(shí)甚至很難檢測(cè)到。研究者利用各種載體和宿主菌的多種不同的組合方式來(lái)表達(dá)KGF，以及嘗試KGF與谷胱甘肽(GST)融合表達(dá)，這雖然提高了KGF的表達(dá)量到3.2mg/L/OD600，但仍不及用同樣方法表達(dá)的FGF1、FGF2、FGF10的產(chǎn)量的1/10。后來(lái)研究者在培養(yǎng)基中加入10～100mM氯化鎂后，發(fā)現(xiàn)氯化鎂的用量在30mM時(shí)，GST-KGF融合蛋白在BL21(DE3)pLysS菌株的表達(dá)量最大，可達(dá)到17mg/L/OD600，而且氯化鎂的這種作用具有菌株特異性，氯化鎂不能提高在BL21(DE3)和DH5 菌株表達(dá)KGF的產(chǎn)量[13]。國(guó)內(nèi)游力[14]等應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，擴(kuò)增出KGFcDNA基因，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，重組蛋白約占菌體蛋白10％。

5臨床應(yīng)用

重組人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(palifermin)2004年由美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療白血病患者高劑量化療或者聯(lián)合放療導(dǎo)致的嚴(yán)重口腔粘膜炎，商品名Kepivance。Palifermin為靜脈注射劑，在抗癌治療開(kāi)始前后連續(xù)三天給藥，化療前后24h停藥，給藥劑量每天60mg/kg。Palifermin能減輕粘膜炎的嚴(yán)重程度和減少它的持續(xù)時(shí)間。Ellison等[15]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)palifermin不光通過(guò)對(duì)上皮細(xì)胞的保護(hù)作用改善粘膜炎，而且可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用來(lái)減少急性移植物抗宿主病的發(fā)生。

6總結(jié)與展望

KGF是一種多功能的生長(zhǎng)因子，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移、分化、存活、DNA修復(fù)以及誘導(dǎo)對(duì)活性氧具有解毒功能的酶的表達(dá)來(lái)加強(qiáng)上皮功能，從而保護(hù)上皮免于毒性物質(zhì)的損傷。但KGF的生物學(xué)性質(zhì)尚未全部了解，KGF主要通過(guò)與受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能，但在有的病理生理過(guò)程中，KGF表達(dá)的上調(diào)并不伴隨其受體的表達(dá)上調(diào)，提示KGF是不是通過(guò)其它途徑發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。Palifermin是首個(gè)應(yīng)用的改善放化療導(dǎo)致的嚴(yán)重口腔粘膜炎的藥物，隨著KGF作用機(jī)制的研究進(jìn)展，相信KGF的臨床應(yīng)用范圍會(huì)更加廣泛。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Rubin JS, Osada H, Finch PW, et al. Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86(3)：802-806.

[2]Erickson M, Morkowski S, Lehar S, et al. Regulation of thymic epithelium by keratinocyte growth factor[J]. Blood,2002, 100(9): 3269-3278.

[3]厲孟,張琳西,夏煒,等.角質(zhì)形成細(xì)胞源促成纖維細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2006,15(4):374-376.

[4]Pereira CT, Herndon DN, Rocker R, et al. Liposomal gene transfer of keratinocyte growth factor improves wound healing byaltering growth factor and collagen expression[J]. J Surg Res, 2007,139(2):222-228.

[5]Jeschke MG, Herndon DN. The combination of IGF-I and KGF cDNA improves dermal and epidermal regeneration by increased VEGF expression and neovascularization[J].Gene Ther,2007, 14(16):1235-1242.

[6]GaliacyS, Planus E, Lepetit H, et al. Keratinocyte growth factor promotes cell motility during alveolar epithelial repair in vitro[J]. Exp Cell Res, 2003,283(2):215-229.

[7]Qiao R, Yan W, Clavijo C, et al. Effects of KGF on alveolar epithelial cell transdifferentiation are mediated by JNK signaling[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2008,38(2):239-246.

[8]Wildhaber BE, Yang H, Teitelbaum DH. Total parenteral nutrition-induced apoptosis in mouse intestinal epithelium: modulation by keratinocyte growth factor[J]. J Surg Res,2003, 112(2):144-151.

[9]Slayden OD, Rubin JS. Lacey DL, et al. Effects of keratinocyte growth factor in the endometrium of rhesus macaques during the luteal-follicular transition[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2000, 85(1): 275-285.

[10]Ray P, Devaux Y, Stolz DB, et al. Inducible expression of keratinocyte growth factor(KGF) in mice inhibits lung epithelial cell death induced by hyperoxia[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(10): 6098-6103.

[11]Braun S, Hanselmann C, Gassmann MG, et al. Nrf-2 transcription factor,a novel target of keratinocyte growth factor action which regulates gene expression and inflammation in the healing skin wound[J]. Mol Cell Biol, 2002,22(15):5492-5505.

[12]Cardinali G, Ceccarelli S, Kovacs D, et al. Keratinocyte growth factor promotes melanosome transfer to keratinocytes[J]. J Invest Dermatol, 2005,125(6):1190-1199.

[13]Luo Y, Cho HH, Jones RB, et al. Improved production of recombinant fibroblast growth factor7(FGF7/KGF) from bacteria in high magnesium chloride[J]. Protein Expr Purif, 2004,33(2):326-331.

[14]游力，趙躍然，高春義，等.人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的克隆及表達(dá)[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2001,14（1）：21-23.

[15]Ellison CA, Makar BM, Wiseman JM, et al. Palifermin mediates immunoregulatory effects in addition to its cytoprotective effects in mice with acute graft-versus-host disease[J]. J Clin Immunol, 2008,28(5):600-615.

[收稿日期]2008-10-22[修回日期]2008-12-28

編輯/張惠娟