馬慧軍　田　燕　劉　雯　李　鈾　趙　廣　楊慶琪

[摘要]目的：建立人表皮黑素細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)的體外模型，觀察α-促黑素以及煙酰胺對(duì)黑素在兩細(xì)胞間傳遞的影響。方法：分別培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞，接種黑素細(xì)胞48h后再將HaCaT細(xì)胞以1∶2的比例與黑素細(xì)胞共培養(yǎng)，分別以不同濃度的α-促黑素和煙酰胺干預(yù)共培養(yǎng)的細(xì)胞9天，F(xiàn)ontana-Masson 銀染法觀察共培養(yǎng)模型中黑素顆粒在兩細(xì)胞間傳遞的情況。結(jié)果：培養(yǎng)3天即可觀察到約20%HaCaT細(xì)胞核周圍出現(xiàn)從鄰近黑素細(xì)胞傳遞來(lái)的黑素顆粒，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)陽(yáng)性染色HaCaT細(xì)胞比例逐漸增多，第7天達(dá)到高峰（約80%），α-促黑素以及煙酰胺分別以濃度依賴方式促進(jìn)/抑制了黑素顆粒在兩細(xì)胞間的傳遞。結(jié)論：成功建立了人表皮黑素細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)體外模型，為大規(guī)模篩選促/抑黑素傳遞的藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]黑素細(xì)胞；共培養(yǎng)；HaCaT細(xì)胞；黑素傳遞

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2009）02-0188-03

Establishment of the co-culture model of human melanocyte and HaCaT cell in vitro

MA Hui-jun, TIAN Yan, LIU Wen, LI You, ZHAO Guang,YANG Qing-qi

(Department of Dermatology, The Airforce General Hospital of PLA, Beijing 100142,China)

Abstract:ObjectiveTo establish an in vitro model of melanocyte and HaCaT cell co-culture model, and measured the melanin transfer effects induced by α-MSH and niacinamide using the model.MethodsHuman epidermal melanocyte was co-culture with HaCaT cell as 1∶2 ratio after 48 h of melanocyte first seeding on the dishes. Then melanin transfer was observed with Fontana-Masson method byα-MSH and niacinamide after 1,3,5,7,9 day of co-culture separately . ResultsAbout 20% HaCaT cells that have positive melanin stain around nuclear were observed after 3 day's co-culture. With the time developed, the ratio of positive melanin stained HaCaT cell is increasing and reached its peak (80%) at the 7th day. In our model, the dose-dependent inhibitory and facilitative effects were observed respectively in niacinamide and α-MSH treated group.ConclusionsThe in vitro model of epidermal melanocyte and HaCaT cell co-culture system was successfully established and it offers a new, suitable, reliable and easy tool for the clinical evaluation of melanin transfer modulators.

Key words：melanocyte; co-culture; HaCaT cell; melanosome transfer

表皮中的黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用共同組成了表皮黑素單元，起著重要的調(diào)節(jié)皮膚顏色、防止紫外線輻射的作用。目前研究表明，人皮膚顏色主要受色素沉著過(guò)程的影響，除黑素細(xì)胞生成黑素外，黑素小體從黑素細(xì)胞向周圍角質(zhì)形成細(xì)胞的廣泛傳遞過(guò)程在皮膚顏色調(diào)節(jié)中起著更為重要的作用[1]。目前黑素傳遞的研究多采用鼠系的瘤細(xì)胞或正常人表皮黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)完成，但這兩種共培養(yǎng)方法均有各自的局限性，限制了該方法在藥物篩選中的廣泛應(yīng)用[2]。HaCaT細(xì)胞是成人皮膚中分離的一種永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞株，具有正常角質(zhì)形成細(xì)胞所應(yīng)有的特性，常用來(lái)替代人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究[3]。筆者通過(guò)不斷的摸索和比較，將人表皮黑素細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞進(jìn)行了共同培養(yǎng)，并觀察了α-促黑素（α-MSH）、煙酰胺對(duì)該共培養(yǎng)模型黑素傳遞的影響，為大規(guī)模篩選促/抑黑素傳遞的藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本：正常人表皮黑素細(xì)胞來(lái)源于空軍總醫(yī)院泌尿外科門診行包皮環(huán)切術(shù)的青少年（10～19歲，平均14.4歲）包皮；HaCaT細(xì)胞購(gòu)自上海滬尚生物科技有限公司。

1.1.2試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基、MCDB153培養(yǎng)基、胰蛋白酶、角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（keratinocyte serum free medium, KSFM）均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，進(jìn)口胎牛血清（FCS）購(gòu)自?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司，左旋谷氨酰胺、分離酶（dispase）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)， 神經(jīng)生長(zhǎng)因子-β (NGF-β)，內(nèi)皮素 1(ET-1)，霍亂毒素（CT），α-MSH、煙酰胺(Vpp)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；分析純硝酸銀（常州市武進(jìn)廟橋第二化工有限公司），純氨水（天津市化學(xué)試劑一廠），25cm培養(yǎng)瓶、6孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）。CKX31-A12PHP倒置顯微鏡、BX51TF顯微鏡（Olympus公司），F(xiàn)orma-3111 CO2孵箱（鑫態(tài)國(guó)際貿(mào)易有限公司）

1.2 方法

1.2.1 原代黑素細(xì)胞的純化和培養(yǎng)：取包皮，碘伏消毒10 min，PBS洗滌3次，去除皮下組織，將包皮剪成1cm×1cm的小片，0.25%分離酶4℃放置12～16h，眼科鑷輕輕分離表真皮，用0.25%的胰酶37℃消化表皮5～10min，吹打成細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，PBS洗滌2次，參照以前的方法[4]稍加改良，用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素， 50nM CT，5ng/ml bFGF，10ng/ml NGF-β，20μg/ml ET-1的MCDB153培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，以4×105/ml的細(xì)胞密度接種到25cm的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。14～18天后待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合狀態(tài)時(shí)傳代，0.05%胰酶消化細(xì)胞5min，見(jiàn)黑素細(xì)胞收縮浮起，即可用含血清的培養(yǎng)基中和胰酶，離心收集細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)，取2～4代的表皮黑素細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每3～4天傳代1次。

1.2.3表皮黑素細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)：將已純化的表皮黑素細(xì)胞消化離心后以2×104/ml的細(xì)胞密度貼壁培養(yǎng)于已消毒的蓋玻片上，添加黑素細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后，將HaCaT細(xì)胞消化離心調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/ml，接種于已有黑素細(xì)胞生長(zhǎng)的蓋玻片上，更換培養(yǎng)基為KSFM(添加牛垂體浸出物，表皮生長(zhǎng)因子等），2天 換液1次，倒置顯微鏡下觀察共培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 色素調(diào)節(jié)劑干預(yù)：根據(jù)文獻(xiàn)[5]，分別選擇α-MSH( 10，50，100nM)以及煙酰胺(0.1，0.5，1mg/ml) 于共培養(yǎng)當(dāng)天添加入角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中，藥物連續(xù)干預(yù)3天，中間換含有藥液的培養(yǎng)基1次，未添加藥物的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，觀察黑素細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)黑素傳遞。

1.2.5 Fontana-masson 染色[6]：分別取經(jīng)藥物干預(yù)或無(wú)藥物干預(yù)（空白對(duì)照）1，3，5，7，9天后黏附有共培養(yǎng)細(xì)胞的蓋玻片，浸入PBS中5min，4%多聚甲醛固定20min，蒸餾水沖洗3次，入5%硝酸銀-氨水溶液中56℃避光孵育1h，蒸餾水沖洗，1%氯化金溶液10min加強(qiáng)著色，蒸餾水沖洗，入5%硫代硫酸鈉溶液還原3min，0.1%伊紅復(fù)染1min，水溶性封片劑封片，顯微鏡下觀察并攝片，計(jì)數(shù)在400倍光鏡下隨意15個(gè)視野中陽(yáng)性染色的HaCaT細(xì)胞總數(shù)。黑素傳遞量以處理組陽(yáng)性HaCaT細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組陽(yáng)性HaCaT細(xì)胞數(shù)×100%表示，每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)過(guò)程使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均以x±s表示。

2結(jié)果

2.1表皮黑素細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)：表皮黑素細(xì)胞在本實(shí)驗(yàn)選用的培養(yǎng)基中多呈樹(shù)突狀生長(zhǎng)，每個(gè)細(xì)胞有2～4個(gè)突起，細(xì)胞增殖較快約18天傳1代；HaCaT細(xì)胞多呈鵝卵石樣或菱形生長(zhǎng)，具有緊密黏附生長(zhǎng)的特性，HaCaT細(xì)胞增殖快，約4天傳1代。

2.2 表皮黑素細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)在倒置顯微鏡下的形態(tài)：黑素細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)第1天始HaCaT逐漸增多，第9天達(dá)到融合狀態(tài)，而黑素細(xì)胞的數(shù)量未有增加，相反隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，黑素細(xì)胞數(shù)量有所減少，細(xì)胞間發(fā)生的接觸增多，黑素細(xì)胞胞體也變成多角狀，樹(shù)突逐漸延長(zhǎng)、突起增多，常有3～6個(gè)樹(shù)突與周圍多個(gè)HaCaT細(xì)胞發(fā)生接觸（圖1）。

2.2 Fontana-Masson 染色顯示黑素顆粒：共培養(yǎng)第1天，HaCaT細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯的黑素顆粒（圖2a），第3天可見(jiàn)20%的HaCaT細(xì)胞核周出現(xiàn)明顯黑素顆粒(圖2b)，第7天約80%的HaCaT細(xì)胞核周出現(xiàn)明顯黑素顆粒(圖2c)，繼續(xù)培養(yǎng)則未見(jiàn)含有黑素顆粒的HaCaT細(xì)胞比例明顯增加。

2.3 α-促黑素、煙酰胺對(duì)黑素傳遞的影響：共培養(yǎng)3天后，α-促黑素以濃度依賴方式促進(jìn)了黑素細(xì)胞內(nèi)黑素向HaCaT細(xì)胞內(nèi)的傳遞， 10、50、100 nMα-MSH分別使黑素傳遞量增加為130%、150%和165%；煙酰胺則以濃度依賴方式抑制了兩細(xì)胞間黑素的傳遞，0.1、0.5、1mg/ml煙酰胺分別使黑素傳遞量遞減為90%、83%、67%（圖3）。

3討論

黑素在黑素細(xì)胞體內(nèi)合成后以黑素小體的形式傳遞到周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞并在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)重新分布和降解，從而起到調(diào)節(jié)皮膚顏色、抑制紫外線輻射的作用，此過(guò)程被稱為黑素傳遞。黑素傳遞過(guò)程通過(guò)調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞中傳遞的黑素小體的大小、數(shù)量和分布從而影響著人的皮膚顏色[1]。目前，大多數(shù)的美白產(chǎn)品主要是是通過(guò)抑制黑素細(xì)胞內(nèi)的黑素合成來(lái)發(fā)揮作用的，僅發(fā)現(xiàn)極少數(shù)美白劑如煙酰胺等具有抑制黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)傳遞的作用。由于有關(guān)黑素傳遞的研究起步較晚，其確切的機(jī)制還遠(yuǎn)未被人們所認(rèn)識(shí)。

以表皮中黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞或各自對(duì)應(yīng)的鼠瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)建立體外細(xì)胞模型是目前研究黑素傳遞的主要方法，但上述方法均存在一定的缺陷（如鼠源性的瘤細(xì)胞與人表皮細(xì)胞尚存在較大差異；原代人角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)增殖慢、不易純化、傳代易死亡等缺點(diǎn)），嚴(yán)重影響了該方法在大規(guī)模篩選黑素傳遞調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用[2]。因此需要建立一種簡(jiǎn)便、快捷、與人生理狀態(tài)最為接近的細(xì)胞模型來(lái)替代既往的細(xì)胞模型。我們?cè)谝郧俺晒兓囵B(yǎng)表皮黑素細(xì)胞的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)不斷的摸索和實(shí)踐，將原代培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，并應(yīng)用較為簡(jiǎn)便的Fontana-Masson銀染法對(duì)共培養(yǎng)后的細(xì)胞是否發(fā)生了黑素傳遞進(jìn)行了初步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)細(xì)胞在KSFM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)黑素細(xì)胞的比例逐漸減少而HaCaT細(xì)胞的比例逐漸增加，兩細(xì)胞間的聯(lián)系逐漸增多。與單獨(dú)培養(yǎng)的黑素細(xì)胞相比，共培養(yǎng)的黑素細(xì)胞胞體變成多角狀，樹(shù)突逐漸延長(zhǎng)、突起增多，常有3～6個(gè)突起與周圍HaCaT細(xì)胞發(fā)生接觸。提示共培養(yǎng)體系中HaCaT細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞接觸發(fā)揮對(duì)黑素細(xì)胞的調(diào)控作用，這與體內(nèi)情況相一致[7]。我們還發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3天后約20%的HaCaT細(xì)胞核周發(fā)現(xiàn)由黑素細(xì)胞傳遞來(lái)的黑素顆粒。共培養(yǎng)7天后黑素傳遞量達(dá)到飽和狀態(tài)（約80%），繼續(xù)培養(yǎng)則未見(jiàn)含有黑素顆粒的HaCaT細(xì)胞比例再增加。說(shuō)明黑素細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞間的黑素傳遞在細(xì)胞接觸后即可發(fā)生，當(dāng)兩細(xì)胞間的接觸達(dá)到完全狀態(tài)后，黑素傳遞也相應(yīng)達(dá)到飽和。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的敏感性，我們利用既往已經(jīng)證實(shí)的兩種黑素傳遞調(diào)節(jié)劑增殖α-MSH和煙酰胺對(duì)該模型進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)3天后，α-MSH以濃度依賴方式促進(jìn)了黑素細(xì)胞內(nèi)黑素向HaCaT細(xì)胞內(nèi)的傳遞，煙酰胺則以濃度依賴方式抑制了兩細(xì)胞間黑素的傳遞，與以往的研究結(jié)果基本一致[5]，從而說(shuō)明該共培養(yǎng)模型可很好的模擬人生理狀態(tài)下表皮黑素傳遞過(guò)程，從而替代原代表皮黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系，與后者相比本模型具有細(xì)胞來(lái)源充分、研究周期短、易于重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)。

值得一提的是，實(shí)驗(yàn)中我們選擇1∶2的黑素細(xì)胞與HaCaT接種比例主要是因?yàn)镠aCaT細(xì)胞在KSFM中增殖明顯快于黑素細(xì)胞，經(jīng)3～4天共培養(yǎng)后兩細(xì)胞間的比例達(dá)到1∶10，基本接近于生理狀態(tài)。另外，本實(shí)驗(yàn)所采用的Fontana-Masson銀染法由于其染色結(jié)果不易精細(xì)量化評(píng)價(jià)、敏感性也沒(méi)有免疫熒光雙標(biāo)法強(qiáng)[2,6]，因此只能作為黑素傳遞研究的粗篩試驗(yàn)。如果借助流式細(xì)胞儀則可進(jìn)一步獲得更為可靠、敏感、精細(xì)的評(píng)價(jià)方法，這將為今后更好的研究黑素傳遞的分子機(jī)制、大規(guī)模篩選調(diào)節(jié)黑素傳遞的新藥打下良好的基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2008-11-06[修回日期]2009-01-08

編輯/張惠娟