高　雪

摘要苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL，E.C4.3.1.5)是催化苯丙烷代謝途徑第一步反應的酶，也是這個途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，對植物具有非常重要的生理意義。綜述了苯丙氨酸解氨酶的存在與分布、基本特性、生理代謝意義、抗病以及基因表達與調(diào)控等，為PAL在植物抗病的應用上提供基礎數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞苯丙氨酸解氨酶；生理作用；抗逆境；基因表達與調(diào)控

中圖分類號S661.1文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)01-0030-04

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL，E.C4.3.1.5)催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸，是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，也是苯丙氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。莽草酸途徑產(chǎn)生的莽草酸通過分枝酸、預苯酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用生成苯丙氨酸，從而進入苯丙烷類代謝途徑，苯丙烷類代謝可生成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物可進一步轉(zhuǎn)化為香豆素、綠原酸，也可以形成CoA酯，再進一步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素、黃酮、異黃酮、生物堿、苯甲酸酯糖苷等次生代謝產(chǎn)物[1，2]。一切含苯丙烷骨架的物質(zhì)都由該代謝途徑直接或間接生成。在生物次生物質(zhì)代謝中具有防紫外線傷害、抵抗病原體的侵害、保持花粉生活力及形成植物花青素等多種重要作用。該酶在不同組織中、不同的內(nèi)外因素調(diào)節(jié)下，含量水平及其基因表達的時空方式均有所不同。

1PAL的存在和分布

1961年Koukal和Conn首次在綠色植物大麥幼苗中發(fā)現(xiàn)了PAL，并進行了分離純化[3]。隨著研究的深入，該酶已被固定化，用于工業(yè)化生產(chǎn)苯丙氨酸。至今，PAL已在所有綠色植物中發(fā)現(xiàn)，在真菌、細菌、藻類中也有存在。不同植物中PAL活性不同，在同一株植物的不同組織部位，PAL活性也不同。一般越嫩的部位PAL活性越高，如楊樹的幼葉、頂芽、幼莖中PAL活性最高，而老莖和成熟葉中PAL則較低[4]。

在細胞水平上，植物PAL主要分布在表皮下的細胞和維管組織細胞中；在亞細胞水平上，PAL定位于細胞質(zhì)和一些細胞器上，如葉綠體、白色體、線粒體、過氧化酶體、乙醛酸體等。Nakushima等進行了PAL的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)細胞間質(zhì)部分PAL活性最高，電子顯微鏡觀察顯示，PAL分散在細胞的基質(zhì)中，定位在高爾基體囊泡和次生壁加厚層中[5]。

2PAL的基本特性

PAL是一種胞內(nèi)誘導酶，酶蛋白是一種含有4個相同亞單位的寡聚體，氨基酸組成隨不同來源而異，如水稻PAL氨基酸組成中酸性氨基酸成分低于小麥、玉米和馬鈴薯，而中性及堿性氨基酸成分則高于后三者[6]。在酶活性部位具有脫氫丙氨?；挠H電中心。酶蛋白分子量一般在220～330 KDa，但不同來源稍有差異，如馬鈴薯PAL分子量為330KDa，玉米為306KDa，小麥和水稻PAL分子量分別為280KDa和230KDa[1]。不同來源的PAL最適pH值在8.0～9.5。如甘薯PAL最適pH值為8.5～9.5，水稻為9.2，小麥為8.8，與其氨基酸組成相一致[7]。

該酶的動力學曲線不符合米氏方程，不規(guī)則，具有別構(gòu)酶的特征。大多數(shù)PAL的米氏常數(shù)(Km)在0.3×10^-4～1.5×10^-2mmoL/L，水稻PAL的Km為5.94×10^-4mmoL/L；而小麥PAL的Km有2個，分別為0.625×10^-4 mmoL/L和3.1×10^-4mmoL/L[1，6]。

3PAL對植物生理代謝的意義

植物的代謝分為初級代謝和次級代謝。植物的次級代謝有多條途徑，苯丙烷類代謝途徑是其中很重要的一條。苯丙烷類途徑生成的黃酮、異黃酮、生物堿等次生代謝產(chǎn)物在植物的生長發(fā)育過程中起著重要的作用，所以PAL對植物的生理意義非常重大(見圖1)。

3.1在木質(zhì)化中的作用

在植物的木質(zhì)化組織中含有較高的PAL活性。Nakashima等用分離的百日草葉肉細胞研究了苯丙烷類代謝酶類與木質(zhì)素、管狀分子形成和細胞分化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在百日草細胞分化過程中，木質(zhì)素的合成及管狀分子形成與PAL活性的增加成正相關(guān)，細胞溶質(zhì)中的PAL活性在木質(zhì)化之前迅速上升，微粒體和細胞壁的PAL活性在木質(zhì)化期間快速增加[5]。

3.2在植物色素形成過程中的作用

花色素是植物花朵、果實和葉片顏色的重要組成部分，花色素等的合成可由苯丙烷類產(chǎn)物反香豆酰CoA經(jīng)過類黃酮途徑生成，該過程與PAL密切相關(guān)。如莧紅素是中央種子目植物所特有的色素，當用白光、藍光或紅光照射尾穗莧黃化苗后，發(fā)現(xiàn)PAL活性均有不同程度地上升，并有莧紅素的積累[8]。有人通過調(diào)節(jié)PAL合成基因的表達，有效地改變了矮牽牛、煙草和菊花的花色[9]。因此，利用分子生物學技術(shù)有可能改變蘋果等果樹果實的色澤。

3.3在植物根瘤形成中的作用

苯丙烷類代謝產(chǎn)物經(jīng)類黃酮途徑可產(chǎn)生黃酮類化合物，這些化合物對根瘤菌有趨化作用，有些類黃酮化合物還可作為根瘤菌結(jié)瘤基因的誘導物質(zhì)[10]。這些黃酮類物質(zhì)的含量與PAL活性存在著密切的關(guān)系，在根瘤菌的形成過程中常伴隨著PAL活性逐漸增強。

4PAL在植物抗逆境中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，許多植物在遭受寒冷、機械損傷、微生物侵染等逆境時，植物的防衛(wèi)系統(tǒng)特別是苯丙烷類代謝被激活，PAL活性迅速上升。如柑橘果實受機械損傷后，果皮中PAL的活性明顯高于對照，且pal2、pal6基因的表達比對照明顯增強[11]。因此，PAL活性可作為植物抗逆境能力的一個生理指標。

4.1PAL在植物抗病中的作用

PAL活性與植物抗病性密切相關(guān)，其活性可作為衡量植物抗病性的生化指標之一。植物感染病原菌后PAL活性明顯升高，并表現(xiàn)出規(guī)律性的變化，即在侵染的最初幾小時，酶活性上升滯緩，隨后急劇上升，酶活高峰一般出現(xiàn)在侵染后的12～48ｈ，之后迅速下降。受病原物侵染后，不同抗性的品種(系)間PAL活性有明顯差異，抗病品系誘導產(chǎn)生的PAL活性遠高于感病品系，且PAL活性越大，品種(系)抗病性越強。如張淑珍等在對疫霉根腐病菌毒素脅迫下不同大豆抗感品種PAL活性的研究中發(fā)現(xiàn)，抗病大豆品種的根、莖和葉中PAL活性在病程的大部分階段都高于對照[12]。PAL參與植物抗病的機制和作用主要有如下幾點。

4.1.1參與植保素的合成。植保素是參與植物防御反應的重要生理活性物質(zhì)之一，主要包括酚類植保素(綠原酸、香豆素和兒茶酚等)、異黃酮類植保素(豌豆素、菜豆素、大豆素、苜蓿黃素等)和萜烯類植保素，它們能直接防止病原物的生長發(fā)育和侵染。其中，前兩類都是苯丙烷類代謝的直接或間接產(chǎn)物，其生成量與PAL活性成正相關(guān)[1]。當用PAL抑制劑Ｌ-2-氨氧基-3-苯丙酸和α-氨氧基-乙酸處理植物幼苗，植物體內(nèi)植保素合成和累積受到抑制[13]。

4.1.2參與木質(zhì)素的合成。木質(zhì)素可加強細胞壁，增加組織木質(zhì)化程度，形成病原菌入侵的機械屏障，木質(zhì)素的合成也來自苯丙烷類代謝途徑中的苯丙氨酸。PAL是這條途徑的第一個也是最重要的酶。研究表明，在植物-病原物互作中，PAL參與木質(zhì)素合成和累積。如棉花受枯萎病菌侵染后，隨著PAL活性提高， 出現(xiàn)木質(zhì)素的積累。PAL受抑制，木質(zhì)素合成亦受到抑制[14]；不同抗病性的杉木接種炭疽菌后，PAL比活力均上升，且抗病性強的杉木PAL比活力比抗病性弱的杉木高[15]。

4.1.3參與酚類物質(zhì)的合成。酚類化合物也是苯丙烷類代謝產(chǎn)物。PAL活性增高與酚類物質(zhì)的合成亦有一致性。如感染灰霉病的黃瓜組織中，伴隨PAL活性升高，總酚積累[16]；在用多糖組分處理后，提高紅豆杉中酚類物質(zhì)和可溶性蛋白含量的同時，過氧化物酶和PAL的活性也被激活[17]。

4.2PAL與植物抗蟲性的關(guān)系

關(guān)于PAL參與植物抗蟲方面的研究報道較少，但關(guān)于苯丙烷類代謝途徑與植物抗蟲性的報道已有很多，主要集中在這一代謝途徑的產(chǎn)物(木質(zhì)素、植保素)與植物抗蟲性的關(guān)系方面。木質(zhì)素的積累，可使細胞壁加厚，成為食草類動物取食的機械障礙，而植保素對草食性昆蟲具有毒害作用和趨避作用，這些化合物的生成與PAL含量存在著間接的關(guān)系。許多試驗證明，PAL活性高低與植物的抗蟲性有很大關(guān)系，如吳龍火等在研究5種山羊草對禾谷縊管蚜取食的誘導性抗性機理時發(fā)現(xiàn)，PAL酶活提高率與蚜蟲取食誘導有關(guān)[18]。而且食草類動物的取食也可誘導PAL活性升高[19]。

5植物PAL基因的表達與調(diào)控

5.1植物PAL基因的克隆

完整的Rhodotorula toroloides PAL基因序列已有報道(Genebank/M18261)。1987年，Anson等從R.toruloides中克隆出了PAL基因，測得了其核苷酸全長序列，發(fā)現(xiàn)R.toruloides PAL基因有6個內(nèi)含子，結(jié)構(gòu)基因上游有一段富含C+T的序列，這與脈孢菌(Neurospora)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的某些基因具有相似性，而在S.cerevisiae中這段富含C+T序列在一些高表達基因的轉(zhuǎn)錄中具有重要的作用[20]。這提示PAL基因中這段富含C+T序列對表達的意義，有利于PAL基因工程菌的構(gòu)建。同時，Anson歸納出了編碼R.toruloides PAL基因的密碼子的使用頻率[20]。這對從cDNA(DNA)中擴增PAL基因時設計PCR引物具有重要的參考價值。迄今為止，對植物PAL基因的研究最多，已有多種植物的PAL基因序列已經(jīng)測定并公布在GeneBank中。

5.2植物PAL基因的表達調(diào)控

對苯丙烷類代謝途徑的調(diào)控包括酶的內(nèi)部調(diào)節(jié)和外界因子調(diào)控兩個方面。它們的表達受發(fā)育和環(huán)境信號的調(diào)節(jié)，具有嚴格的組織時間特異性[1]。

5.2.1植物體內(nèi)對PAL酶的內(nèi)部調(diào)節(jié)。PAL酶活性隨植物發(fā)育過程的推進而不斷變化。一般PAL酶活性最初較低或沒有，后上升到一個高峰后下降，達到高峰的時間不同植物有所不同，如水稻9d、小麥7d、胡蘿卜60h。植物體內(nèi)有一種內(nèi)源性抑制物質(zhì)(PAL-inhibitor， PAL-I)參與PAL活性的調(diào)節(jié)。從去胚乳的水稻黃化苗中提取并部分純化了PAL-I，它是非透析的蛋白質(zhì)，大部分活性可被蛋白酶破壞，具有熱穩(wěn)定性。動力學實驗表明，PAL-I對PAL的抑制是競爭性的。水稻PAL-I不僅能抑制水稻PAL，還能抑制從小麥、玉米、馬鈴薯中提取的PAL，但不能抑制水稻中提取的其他酶類，如多酚氧化酶[21]。研究還發(fā)現(xiàn)，單子葉植物幼苗胚乳中普遍存在PAL內(nèi)源抑制物質(zhì)的調(diào)節(jié)因子(PAL-inhibitor-regulator， PAL-IR)，去胚乳后，內(nèi)源抑制物質(zhì)增加，幼苗中PAL活性下降。目前認為胚乳對幼苗PAL活性的調(diào)節(jié)作用在禾本科植物中具有普遍意義，而雙子葉植物子葉對PAL的調(diào)節(jié)作用不具有普遍性，要比單子葉植物的胚乳復雜的多[1，21]。

PAL酶除自然降解、鈍化因子和調(diào)節(jié)因子外，還受其末端產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。酶抑制劑有許多種類，如肉桂酸、ρ-香豆酸、α-氨氧基乙酸和一些氨基酸如組氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等。不同來源的PAL對同一種類抑制劑的敏感性不同。如來源于大麥和紅酵母的PAL對硫氫基類抑制劑敏感，而來源于馬鈴薯、玉米、黑粉菌和鏈霉菌的則不敏感，這種對酶活性的抑制同酶活性部位脫氫丙氨?；膯适Ш蜏p少相伴隨，其機理可能是對脫氫丙氨酰殘基的修飾[7]。

5.2.2外界因子對PAL酶的調(diào)控。PAL是一種誘導酶，可受多種因素的誘導。低溫、機械損傷、光(白光、藍光、紅光、紫外光)、病原菌感染、毒素處理、昆蟲取食、礦質(zhì)營養(yǎng)、懸浮細胞的稀釋和外源植物激素等因素都可以在轉(zhuǎn)錄水平上誘導PAL基因的表達［22，23］。如用真菌誘導子接種歐芹葉細胞懸浮培養(yǎng)液，接種后6～8h，PAL mRNA在大范圍內(nèi)高度表達，且明顯高于對照；約12h后，PAL mRNA收縮到壞死斑周圍，并在此區(qū)域內(nèi)，PAL酶蛋白有所增加；接種25h，PAL mRNA表達基本恢復到原來水平，而PAL酶蛋白在壞死斑周圍被強烈地誘導合成[24]。

生長素(IAA)、激動素(BAP)和乙烯都可誘導植物PAL基因的表達，剌激效應乙烯＞IAA＞BAP。還有研究表明，赤霉素(GA3)也能誘導PAL活性的升高[1]。植物在生長發(fā)育過程中以及受病原菌及其誘導物和傷害等刺激時，PAL常伴隨內(nèi)源乙烯合成的增加而積累。如在西瓜果實發(fā)育中，PAL基因隨著乙烯生物合成基因的表達而表達[25]；馬鈴薯在用外源乙烯處理后，PAL mRNA的水平增加[26]。說明乙烯可能是植物PAL誘導表達的內(nèi)源信號分子。各種誘導因子間還存在著互作關(guān)系，如在切傷誘導甘薯塊根切片PAL活性增高時，IAA、BAP和乙烯處理能使PAL的活性再增加，BAP的效應還可被照光而增強[7]；在尾穗莧黃化苗PAL與莧紅素積累的相關(guān)性研究中，也觀察到光對BAP的刺激作用有增效現(xiàn)象[8]。

5.3調(diào)控機理

PAL是由一個多基因家族控制，不同組織有多種PAL同工酶，分別定位于不同的組織細胞，控制不同的代謝途徑[1，7]。研究表明，植物PAL基因結(jié)構(gòu)的普遍特點是由小的多基因家族組成，在1組染色體中，含有1至多個PAL基因，并隨不同植物而異，基因內(nèi)一般含有1個內(nèi)含子。如菜豆基因組包含3 個PAL基因，即PAL1、PAL2、PAL3。它們都可在根部大量表達，而花瓣中PAL2大量表達，PAL1表達量很少，PAL3不表達；這3個PAL基因都能被機械損傷誘導，而PAL1和PAL2能被真菌細胞壁誘導因子所誘導。此外，在機械損傷的細胞和木質(zhì)部細胞都能檢測到PAL2的活性[27]。這與其生理功能一致，因為在木質(zhì)部的正常發(fā)育過程中，木質(zhì)部的形成也是從PAL所催化的反應開始的。植物細胞受傷時用于填補傷口的物質(zhì)的合成也需要PAL。

PAL多基因家族在表達上的差異是由于它們的啟動子所包含的順式作用元件不同而引起的。由順式作用元件和相應的轉(zhuǎn)錄因子共同作用，控制PAL基因在不同時間和組織中的表達。植物PAL基因啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中的表達調(diào)控也說明了這一點。有人將菜豆(PAL2、PAL3)、擬南芥(PAL1)等植物PAL基因的啟動子與β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-Glucuronidase，GUS)報告基因融合轉(zhuǎn)移到馬鈴薯、煙草、擬南芥中，通過檢測報告基因活性，來研究PAL啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中的表達調(diào)控模式及表達的細胞和組織特異性。他們發(fā)現(xiàn)用親和性的Pseudomonas solanacearum野生型菌株K60，或不親和性的無毒性突變株B1，接種含有擬南芥PAL1-GUS基因融合物的轉(zhuǎn)基因煙草植株，迅速誘導了GUS基因的大量表達[28]；將菜豆PAL2-GUS和PAL3-GUS轉(zhuǎn)入擬南芥、馬鈴薯和煙草中，其表達受環(huán)境刺激因子的誘導調(diào)控，也受轉(zhuǎn)基因植物發(fā)育階段調(diào)控，表現(xiàn)出不同的時空表達模式[28]。GUS表達的組織化學分析表明，菜豆PAL基因啟動子，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和煙草的特定細胞——機械損傷的細胞中表達，也可在發(fā)育中的木質(zhì)部(射線細胞)和花器中表達[29]。這些結(jié)果表明，PAL基因啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中的表達，也受病原菌、轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)育階段及其他環(huán)境因子的誘導調(diào)控。

6結(jié)語

PAL是植物次生代謝中一種非常重要的酶類，在植物的生長發(fā)育、抗病反應等過程中起著非常重要的作用。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，大量PAL基因的克隆、測序、結(jié)構(gòu)特點分析及時空表達模式的研究，將為在轉(zhuǎn)基因植物中大量、持久表達PAL酶，提高次生代謝產(chǎn)物的含量，增強植物對病害的廣譜持久抗性及其他農(nóng)藝性狀具有非常重要的作用。同時深入研究PAL基因啟動子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，不僅可以進一步闡明PAL基因的調(diào)控機理，還能為增強作物抗病性、作物的遺傳改良等研究開辟新的思路，具有廣闊的應用前景。

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