方文成　崔紅俠　張傳平

[摘要]目的 檢測(cè)乳腺癌骨髓中CK-19mRNA的表達(dá),探討其在乳腺癌微轉(zhuǎn)移中的臨床意義。方法 采用RT-PCR方法檢測(cè)95例乳腺癌患者和15例乳腺良性疾病骨髓中CK-19mRNA的表達(dá)。結(jié)果 95例乳腺癌中,51例(53.7%)骨髓中檢測(cè)出CK-19mRNA的表達(dá)。CK-19mRNA陽(yáng)性表達(dá)率與乳腺癌臨床分期和腫瘤大小有關(guān)(P<0.05),而于月經(jīng)、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、ER、PR蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著性相關(guān)(P>0.05)。CK-19陽(yáng)性病人的局部復(fù)發(fā)率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率與CK-19陰性病人比較,差異有顯著意義(P<0.05)。結(jié)論 CK-19mRNA可作為乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移指標(biāo)之一,骨髓微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)能夠更好地指導(dǎo)臨床分期和評(píng)估預(yù)后。

[關(guān)鍵詞]乳腺癌;骨髓;微轉(zhuǎn)移;CK-19

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)]1004-8650(2009)10-014-02

乳腺癌是一種全身性惡性疾病,影響其預(yù)后的主要因素是全身轉(zhuǎn)移。骨髓內(nèi)血管為獨(dú)特的竇狀結(jié)構(gòu),有濃縮或使癌細(xì)胞停留的作用,因此骨髓是乳腺癌最容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的部位。研究發(fā)現(xiàn),約30%腋淋巴結(jié)陰性的乳腺癌患者術(shù)后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致死亡,其主要原因是淋巴結(jié)、骨髓及血液中微轉(zhuǎn)移灶的存在[1]。我們通過(guò)應(yīng)用RT-mRNA技術(shù),以細(xì)胞角蛋白19(Cytokeratin-19, CK-19)為標(biāo)志,檢測(cè)乳腺癌患者骨髓中的微轉(zhuǎn)移狀況,探討其在乳腺癌微轉(zhuǎn)移中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2002年6月-2007年10月在我科住院的乳腺癌患者95例,均為女性,平均年齡27-65歲,中位年齡48.5歲。其中Ⅰ期12例,Ⅱ期47例,Ⅲ期36例。腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性59例,陰性36例,絕經(jīng)前52例,絕經(jīng)后43例。所有患者均經(jīng)手術(shù)治療,術(shù)后病理類型:浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 61例,浸潤(rùn)性小葉癌23例,髓樣癌 7例,黏液腺癌4例。術(shù)前所有患者均未行放療、化療等治療,并經(jīng)胸部X線、B超、CT和骨掃描等檢查未發(fā)現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移灶。同期15例乳腺良性疾病作對(duì)照。

1.2 標(biāo)本采集

乳腺癌患者術(shù)中經(jīng)皮下抽取胸骨骨髓6-8ml,乳腺良性疾病經(jīng)皮膚抽取骨髓6-8ml,肝素抗凝后,用生理鹽水稀釋,然后淋巴細(xì)胞分離液離心,收集淋巴細(xì)胞層,PBS洗滌,加入Trizol試劑1ml,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RT-PCR擴(kuò)增:使用美國(guó)ABI公司AB15700型PCR擴(kuò)增儀,美國(guó)BIO-RAD公司PowerPac Basic型凝膠成像系統(tǒng)。骨髓中 RNA提取、cDNA合成、PCR試劑均由上海生工生物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)方法參考試劑說(shuō)明書。CK-19的上游引物為5'-AGGTGGATTCCGCTCGGGGCA-3',下游引物為5-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為460bp。內(nèi)參照β-actin上游引物為5'-ATCTGGGACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3',下游引物為5'-CGACATACTCGTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3',擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為838bp。RT-PCR熱循環(huán)反應(yīng)的條件為95℃ ,預(yù)變性5 min,95℃ 接鏈45s,55℃ 退火30s,72℃ 延伸55s,32個(gè)循環(huán),72℃ 末次延伸5min。

1.3.2 結(jié)果判定:取PCR產(chǎn)物6μl行2%瓊脂糖(含溴化已錠0.5μg/ml)凝膠電泳,在DNA Maker 指示下,以β-actin(838bp)做為陽(yáng)性對(duì)照,在凝膠電泳中可出現(xiàn)460bp的條帶即為CK-19表達(dá)陽(yáng)性,為骨髓微轉(zhuǎn)移陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CK-19mRNA在骨髓中的表達(dá)情況(見(jiàn)圖1)

95例乳腺癌患者骨髓中CK-19mRNA的表達(dá)陽(yáng)性者51例,占53.7%,15例乳腺良性疾病骨髓中無(wú)一例表達(dá)CK-19mRNA,差異有顯著性意義(P<0.05)。

M:DNA條帶(100-1000bp);1.陰性對(duì)照;2.陽(yáng)性對(duì)照;3. CK-19mRNA表達(dá)陽(yáng)性;4. CK-19mRNA表達(dá)陽(yáng)性陰性

2.2 骨髓中CK-19mRNA的表達(dá)與傳統(tǒng)預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系(見(jiàn)表1)。

CK-19mRNA陽(yáng)性表達(dá)率與乳腺癌臨床分期和腫瘤大小有關(guān)(P<0.05),而與月經(jīng)、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、ER、PR蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著性相關(guān)(P>0.05)。

2.3 骨髓CK-19mRNA的表達(dá)與術(shù)后局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系

截至2007年9月,全組患者隨訪37-61個(gè)月,中位隨訪時(shí)間49個(gè)月。95例乳腺癌中13例出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,其中CK-19mRNA表達(dá)陽(yáng)性組11例,占21.6%(11/51),CK-19mRNA表達(dá)陰性組2例,占4.55%(2/44),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

乳腺癌目前已被廣泛認(rèn)為是一種全身性惡性疾病,即在早期即可發(fā)生血行播散,影響乳腺癌預(yù)后的主要原因是遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移。特別是淋巴結(jié)、骨髓及血液中微轉(zhuǎn)移灶的存在。因此,早期發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有著重要的意義。乳腺癌微轉(zhuǎn)移是指常規(guī)病理學(xué)檢查檢測(cè)不到的存在于患者淋巴結(jié)、血液及骨髓等體內(nèi)的微小轉(zhuǎn)移灶。它常以單個(gè)細(xì)胞或微小細(xì)胞團(tuán)的形式存在,并在一定的條件下分裂增殖成轉(zhuǎn)移灶。

檢測(cè)骨髓微轉(zhuǎn)移的常用方法是RT-PCR技術(shù),能夠快速擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性mRNA的表達(dá),可從10⁶-10⁷個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)出一個(gè)腫瘤細(xì)胞,并預(yù)示腫瘤的微小轉(zhuǎn)移,具有病理組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)所不可比擬的敏感性[2]。角蛋白19(Cytokeratin,CK-19)是一種針對(duì)上皮細(xì)胞的單抗,是上皮性細(xì)胞的標(biāo)志基因,僅在正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中表達(dá),而不在淋巴細(xì)胞、骨骼和外周血中表達(dá)。本組95例乳腺癌患者的骨髓中有51例表達(dá)CK-19 mRNA,其陽(yáng)性率53.7%。而乳腺良性疾病患者中無(wú)一例表達(dá),兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) 。表明它可作為乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移的指標(biāo)有一定的特異性。

本組結(jié)果顯示,乳腺癌骨髓中CK-19陽(yáng)性表達(dá)率隨臨床分期及腫塊的大小的增加而增高。乳腺癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期骨髓中CK-19mRNA的表達(dá)陽(yáng)性率分別為33.3%、44.7%和72.2%,差異有顯著性,提示腫瘤分期越高轉(zhuǎn)移的可能性越大。而且腫塊>2cm者CK-19陽(yáng)性表達(dá)率較≤2cm者也明顯增高,值得注意的是,在腫塊≤2cm及Ⅰ期乳腺癌患者中不同程度的骨髓微轉(zhuǎn)移,說(shuō)明乳腺癌是一個(gè)全身性疾病,早期即可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但是腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組與陰性組之間CK-19陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯差別(P≤0.05),表明乳腺癌血行轉(zhuǎn)移與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為兩條不同的轉(zhuǎn)移途徑,腫瘤細(xì)胞早期即可進(jìn)入血液發(fā)生全身轉(zhuǎn)移。

近年來(lái)報(bào)道顯示,微轉(zhuǎn)移的臨床意義尚有爭(zhēng)議,但至少可揭示其具有轉(zhuǎn)移傾向,并可判斷患者的預(yù)后[3]。 Stathopoulou等[4]認(rèn)為乳腺癌微轉(zhuǎn)移檢出與無(wú)瘤生存率和總生存率相關(guān),是判斷預(yù)后的主要指標(biāo)。本研究顯示,CK-19mRNA表達(dá)陽(yáng)性與CK-19mRNA表達(dá)陰性比較,兩組術(shù)后局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)也是判斷預(yù)后的主要指標(biāo)之一。Braun[5]等檢測(cè)552例乳腺癌骨髓微轉(zhuǎn)移患者,發(fā)現(xiàn)CK-19mRNA表達(dá)陽(yáng)性和局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性,輔助化療可有效降低患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn),是判斷預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。因此,對(duì)檢出有微轉(zhuǎn)移的患者,在其發(fā)展成臨床轉(zhuǎn)移之前,給予積極輔助治療,可以降低患者的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率。

參考文獻(xiàn):

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[2] Von Kenbel Doeberitz M,Lacroix J. Nucleic acid based techniques for the detection of rare cancer cells in clinical samples[J].Cancer Metastasis Rev, 1999,18(1):43-64.

[3] Xenidis N,Vlachonikolis l,Mavroudis D,et al.Peripheral blood circulating cytokeratin-19 mRNA-positive cells after the completion of adjuvant chemotherapy in patients with operable breast cancer[J].Ann Onco, 2003 ,14(6):849-855.

[4] Stathopoulou A,Vlachonikolis I,Mavroudis D,et al.Molecular detection of cytokeratin-19-positive cells in the peripheral blood of patients with operable breast cancer: evaluation of their prognostic significance.J Clin Oncol,2002,20(16):3404-3412.

[5] Braun S,Pantel K, Muller P, et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer[J]. N Engl J Med,2000,342(8):525-533.

(收稿日期2009-06-30)