夏艷飛　陽冬芳　李海軍　曾令斌

【摘要】 目的 探討環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因和蛋白在腎癌組織中的表達及與其分型之間的關系。方法 收集經手術病理證實腎癌組織的標本39例和正常腎組織8例,采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)及Western免疫印跡分別檢測COX-2 mRNA及蛋白的表達水平。結果 腎癌組織中的COX-2的基因和蛋白的表達明顯高于正常腎組織組(P<0.01)；在三種類型的腎癌中，混合型腎癌組織中COX-2表達最強，顆粒細胞癌的表達水平次之，腎透明細胞癌中表達最少(P<0.01)。結論 COX-2的基因和蛋白的表達在腎癌組織中增高且與其病理分型密切相關。

【關鍵詞】 腎癌；環(huán)氧化酶-2；基因；蛋白質

環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是前列腺素合成過程中的重要限速酶,它在某些腫瘤組織中高表達,可能參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。腎癌是一種常見的泌尿系統腫瘤,發(fā)生率僅次于膀胱癌。本研究采用Western免疫印跡及逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測人不同臨床類型的腎癌組織中COX-2基因和蛋白質的表達，初步探討COX-2的表達與腎癌病理分型之間的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2004-2007年本院術后經HE 染色病理證實腎透明細胞癌39例,其中男28例,女11例,年齡35~66歲(平均48.5歲),其中透明細胞癌19例,顆粒細胞癌12例,混合型8 例。切取距離腫瘤3 cm以外的正常腎臟組織8例為對照,經病理檢查無癌細胞浸潤。

1.2 主要試劑 Reverse Transcription System購自美國Promega公司；COX-2及GAPDH上、下游引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；其他試劑均為國產試劑。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測腎癌組織COX-2 mRNA的表達 用TRIzol 試劑提取細胞總RNA，溶于無Rnase水中，紫外分光光度計測定OD260/OD280 的比值在118~210。取總RNA 2 μg，用Promega公司逆轉錄試劑盒合成cDNA，再取逆轉錄產物110 μl進行PCR循環(huán)。內參照采用GAPGH，引物序列為:上游5′-AACTTTGGCATT GTG2GAAGG-3′，下游5′-TGTGAGGGA GATGCTCAGTG-3′，擴增片段長度為599 bp。COX-2引物序列：上游5′-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT TGCT-3′,下游5′-AGATCATCTCTGGCCTGAGTATCTTT-3′,擴增片斷長度305 bp。PCR反應條件：95℃溫育3 min，94℃變性45 s，60℃復性40 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)，末次循環(huán)72℃延伸10 min。反應結束后，取RT-PCR 產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，加樣量均為5 μl，溴化乙錠染色。電泳條帶采用UVP型凝膠圖像分析系統做積分吸光度測定和分析，以各組目的基因與內參照基因的RT-PCR擴增DNA片段的吸光度值減去背景值的比值來比較待測基因的mRNA表達差異。

1.4 Western免疫印跡檢測COX-2蛋白質的表達 取腎癌組織及對照正常腎組織，用PBS洗滌3次，洗去殘血，加入三去污劑裂解緩沖液裂解組織提取蛋白，BCA法蛋白質定量。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離（積層膠80 V，分離膠120 V）后，半干轉移法進行電轉移（60 mA 1 h）至PDVF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，按1∶1000比例加入兔抗人COX-1一抗，于室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，每次5 min；按1∶1000比例加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h；TBST洗3次，每次5 min；然后用Western blot熒光檢測試劑激發(fā)熒光，顯示于X光片。結果用凝膠圖像分析系統對膠片掃描進行分析。

1.5 統計學方法 實驗所得數據采用均數±標準差（x±s）表示，數據統計采用t檢驗。

2 結果

2.1 腎癌組織及正常腎組織中COX-2 mRNA的表達 RT-PCR分別檢測腎癌組織及正常腎組織COX-2 mRNA的表達水平，結果發(fā)現，在正常腎組織中，COX-2的基因表達很少，大部分呈陰性表達。而腎癌組織中其表達明顯增加，且三種類型的腎癌中，混合型腎癌組織中表達最強，腎透明細胞癌中表達最少，而顆粒細胞癌的表達水平居中（結果如圖1）。

2.2 腎癌組織及正常腎組織中COX-2蛋白的表達 Western免疫印跡法分別檢測腎癌組織及正常腎組織COX-2 蛋白質的表達水平，結果發(fā)現，在正常腎組織中，COX-2蛋白表達較少，而腎癌組織中其表達明顯增加，其中混合型腎癌織中表達最強，顆粒細胞癌的表達水平次之，腎透明細胞癌中表達最少（結果如圖2）。

3 討論

腎癌是腎臟最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率約占腎惡性腫瘤的80%,占全身惡性腫瘤的3%。其生物學行為多變，發(fā)病機制以及發(fā)生、發(fā)展的分子生物學基礎及預后仍不清楚。近年來，有研究發(fā)現犬科動物腎細胞癌模型體內COX-2具有高表達，并在腫瘤細胞增長調節(jié)方面起重要作用，COX-2與腎盂移行細胞癌的分型和分期的具有相關性，而COX-2選擇性抑制劑可用于防治腎細胞癌［1-3］。

環(huán)氧化酶是花生四烯酸合成前列腺素(prostaglandin,PG)的一個限速酶，可將花生四烯酸轉變?yōu)楦鞣NPG產物，維持機體的各種病理生理過程。目前發(fā)現哺乳動物COX 至少有2種同工酶，即COX-1和COX-2，其中COX-2為誘導性表達，靜息時并不表達，在大多數正常組織難以發(fā)現，一般只在受刺激時迅速合成，這種刺激因子可為細胞因子、生長因子、促癌劑以及癌基因產物等。COX-2在致癌作用中充當重要角色，研究發(fā)現它在人體結腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、食管癌、前列腺癌、喉癌等組織中檢測到COX-2的高表達［4］。羅洪波等通過免疫組化研究認為，腎細胞癌中COX-2的高表達與腎癌的分級、分期、分型及腫瘤侵襲轉移有關［5］,也有研究提示COX-2與腎細胞癌病理分級成正相關［6,7］,呂紅凱等［8］在研究中認為，COX-2對腎癌的早期診斷有意義，這些數據說明COX-2 與腎細胞癌發(fā)生發(fā)展之間聯系密切。

本研究通過收集臨床病例并進行分型，檢測了不同臨床類型的腎癌組織中COX-2 mRNA和蛋白質的表達，結果發(fā)現，在正常腎組織中，COX-2基因和蛋白的表達較少，大部分呈陰性，而腎癌組織中其表達明顯增加。在三種不同臨床類型的腎癌組織中，混合型腎癌組織中表達最強，顆粒細胞癌的表達水平次之，腎透明細胞癌中表達最少。結果提示，COX-2的表達與腎癌的分型有關，其中與混合型腎癌的關系最為密切，檢測COX-2的表達有利于協助腎癌的分型診斷。COX-2的表達為腎癌發(fā)生的早期事件，與腎癌的發(fā)生、發(fā)展有關，有可能作為腎癌早期診斷及分型的指標，并有可能為腎癌的預防提供新的靶向。

參 考 文 獻

［1］ Khan KN,Stanfield KM,Trajkovic D,et al.Expression of cyclooxygenase-2 in canine renal cell carcinoma.Vet Pathol,2001,38 (1):116-119.

［2］ Oku S,Higashi M,Imazono Y,et al.Overexpression of cyclooxygenase-2 in high-grade human transitional cell carcinoma of the upper urinary tract.BJU Int,2003,91 (1):109-114.

［3］ Hara S,Kondo Y,Matsuzawa I,et al.Expression of cycloxygenase-2 in human bladder and renal cell carcinoma.Adv Exp Med Biol,2002,507:123-126.

［4］ 敬前程，羅志強.環(huán)氧化酶2在鼻咽癌的研究進展.醫(yī)學綜述，2008,14(20):3078-3081.

［5］ 羅洪波，劉修恒，陳智敏，等.腎細胞癌COX-2 及MMP-2 的免疫組化研究.腫瘤防治研究,2005,32 (6 ):354-356.

［6］ Hashimoto Y,Kondo Y,Kimura G,et al.Cyclooxygenase-2 expression and relationship to tumour progression in human renal cell carcinoma.Histopathology,2004,44:353-359.

［7］ 王沈陽，李相洲，盧洪凱，等.環(huán)氧化酶-2在人腎透明細胞癌中的表達及意義.濰坊醫(yī)學院學報,2007,29(2):123-125.

［8］ 呂紅凱，張雁鋼，王東文.COX-2 在腎癌中的表達及其臨床意義.臨床醫(yī)藥實踐雜志，2008,17(1):13-16.