云　強　蘇秀蘭　歐陽曉暉

【摘要】 目的 研究抗癌活性肽對人膽囊癌細胞系GBC-SD細胞作用前后的基因表達譜，篩選與抗癌活性肽作用相關的基因表達改變。方法 將1152條人類全長基因的PCR產(chǎn)物按微矩陣排列點樣于特殊處理的玻片上制備成表達譜芯片；按一步法抽提抗癌活性肽作用前后體外培養(yǎng)的膽囊癌細胞的RNA并純化mRNA，通過逆轉錄用兩種熒光Cy3-dUTP和Cy5-dUTP標記對照和實驗組膽囊癌細胞cDNA，制成cDNA探針并與表達譜芯片雜交，用ScanArray4000掃描儀掃描芯片上兩種熒光信號，計算機分析判定差異表達的基因。結果 在1152條基因中篩選出有差異表達的基因245條，其中上調(diào)的121條，下調(diào)的124條。結論 利用本基因表達譜芯片可同時研究數(shù)以千計的基因表達水平，從而在基因水平上探討抗癌活性肽對膽囊癌GBC-SD細胞作用的機制。

【關鍵詞】 抗癌活性肽；膽囊癌；細胞系；基因芯片；基因表達譜

Analysis of gene expression pattern in gallbladder carcinoma cells treated by anti-cancer bioactive peptide (ACBP) YUN Qiang，SU Xiu-lan，OU YANG Xiao-hui.Inner Mongolia Hospital，Inner Mongolia 100027，China

【Abstract】 Objective To investigate gene expression pattern of human gallbladder carcinoma cell line treated by anti-cancer bioactive peptide (ACBP)，and in the identification of novel cance rassociated genes.Methods The cDNA retro-transcribed from equal quantity mRNA from the gallbladder carcinoma cell line (GBC-SD) which were labeled with Cy5 and Cy3 fluorescence as a probes.The mixed probe was hybridized with cDNA microarray which representing a set of 1152 human genes.It was scanned by laser scanner.The acquired image was analyzed by software.Results 245 differentially expressed genes were identified that further identified 121 upregulated and 124 downregulated gene.Conclusion cDNA microarray for analysis of gene expression patterns is a powerful method to identify nove cancer as sociated genes.

【Key words】 Anti-cancer bioactive peptide (ACBP)；Gallbladder carcinoma；Cell line；Gene chip；Gene expression pattern

本研究將通過基因芯片技術比較分析抗癌活性肽對膽囊癌GBC-SD細胞的基因表達譜的影響，了解作用前后基因表達的變化，深入探討這種新型生物活性制劑的分子機制，為腫瘤治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人膽囊癌GBC-SD細胞由山東大學齊魯醫(yī)院腫瘤研究所保存并提供。

1.2 主要試劑與耗材

1.2.1 細胞培養(yǎng)相關試劑

1.2.2 細胞總RNA提取、分析試劑

1.2.3 基因芯片標記、雜交試劑盒 上海博星(BioStar)基因芯片有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與藥物作用 膽囊癌細胞按適當密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，當達到80%融合時，加入活性肽使終濃度達到8 mg/ml繼續(xù)培養(yǎng)48 h開始有形態(tài)的改變時終止。

1.3.2 探針制備 用改進的Trizol試劑一步法抽提培養(yǎng)細胞總RNA。

1.3.3 芯片雜交洗滌 按雜交試劑盒說明操作。

1.3.4 檢測與分析 用ScanArray4000掃描儀掃描芯片，用GenePix Pro3.0圖象分析軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號的強度和比值。

2 結果

2.1 總RNA抽提結果 所提兩組細胞(GBC-SD細胞對照組、GBC-SD細胞實驗組)RNA OD260/OD280：1.8～2.0；1%瓊脂糖凝膠電泳28 s、18 s條帶清晰，無DNA雜帶，證明已抽提高純化的細胞總RNA。

2.2 芯片雜交結果分析

2.3 基因芯片檢測結果 總基因位點1152條，歸一化選擇后基因總數(shù)1010條，有差異表達的基因245條，占基因總數(shù)的21.27%。其中經(jīng)活性肽誘導后表達降低的124條，表達增高的121條。

3 討論

利用基因芯片技術可以大規(guī)模、高通量、快速高效的對大量基因進行同時研究。表達譜基因芯片是用于基因功能研究的一種芯片，對來源于不同下的細胞內(nèi)的mRNA或逆轉錄后產(chǎn)生的cDNA與表達譜基因芯片進行雜交、洗滌，用特有的熒光波長掃描芯片，計算機分析檢測結果，對基因表達進行綜合的分析和判斷，將某個或幾個基因與疾病聯(lián)系起來。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多階段、多基因參與的復雜過程，利用基因芯片技術可以平行檢測數(shù)千條基因，了解藥物對基因表達的影響，從而推測藥物作用的基因靶點及機制，有利于發(fā)揮生物制劑特異性靶向調(diào)節(jié)作用。

3.1 缺氧誘導因子-1(HIF-1)反應性基因RTP801和內(nèi)皮素1(ET-1)表達降低 HIF-1在多數(shù)腫瘤細胞中高表達，上調(diào)參與腫瘤增殖和代謝通路的靶基因。其機制主要是通過提高葡萄糖轉運、糖酵解速率及形成多血管體系來使腫瘤細胞適應缺氧的環(huán)境^[2]。其功能可分為：①促進糖酵解：能使腫瘤細胞適應不利環(huán)境，減少有氧代謝中氧自由基對DNA復制的破壞；②促進新生血管生成，給瘤細胞的侵襲和轉移創(chuàng)造條件^[3]；③慢性缺氧狀態(tài)下，HIF-1α可能參與誘導細胞凋亡。Nip是Bcl-2凋亡家族的凋亡前成員，它的啟動子中包含HIF-1反應元件。在慢性缺氧及強制表達HIF-1α時均可使Nip3表達活躍，啟動Bcl-2誘導細胞凋亡^[4]；④其他：HIF-1還可誘導各種促紅細胞生成因子(如EPO、轉鐵蛋白)、擴血管因子(如誘導型一氧化氮合酶)、內(nèi)皮素1等的表達來增加組織氧的運輸和利用能力。拮抗HIF-1能抑制血管增生和腫瘤生長。RTP801是一個新克隆的HIF-1反應性基因，在體外和體內(nèi)缺血性動物模型都可以檢測到RTP801表達增高，將含有RTP801cDNA的脂質(zhì)體導入小鼠肺內(nèi)可導致大量細胞死亡^[5]。內(nèi)皮素是由內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞產(chǎn)生的含有21個氨基酸殘基的短肽，有四種亞型，有強烈的縮血管作用，ET-1作用最強?，F(xiàn)已證實，多數(shù)腫瘤能產(chǎn)生ET-1并表達內(nèi)皮素受體，內(nèi)皮素可通過多種途徑參與腫瘤的血管生成^[6]。推測活性肽能通過抑制腫瘤血管形成和影響腫瘤細胞能量代謝，促進凋亡而起到抗腫瘤效應。

3.2 參與H+轉運的ATP合成酶表達下降 細胞能量代謝最重要過程三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化都在線粒體內(nèi)進行，而細胞凋亡時最早發(fā)生的改變就是線粒體內(nèi)跨膜電位改變。本實驗中ATP5G1和ATP5J表達下降提示活性肽可能通過干擾線粒體正常功能誘導凋亡。

3.3 Survivin和凋亡抑制蛋白1(IAP-1/MIHC)表達下調(diào) Survivin是一種凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成員。Survivin主要通過抑制Caspases-3和Caspases-7阻斷細胞凋亡。另外Survivin 也通過p21間接抑制Caspases，其機制是Survivin 與細胞周期調(diào)控因子CDK4形成復合體，使得p21從CDK4的復合體中釋放出來，p21進一步與線粒體Caspases 結合，抑制其活性，阻礙凋亡^[7]。有研究報道^[8]Survivin可能是血管形成中生長因子誘導的保護性基因，維持血管內(nèi)皮細胞的正常增殖。Survivin在腫瘤組織中表達的相對特異性，使抗Survivin療法具有良好的靶向特異性，對正常組織損害小^[9]。MIHC作為IAP家族成員通過阻斷Caspases級聯(lián)反應而抑制細胞凋亡。

3.4 與細胞外基質(zhì)有關的基質(zhì)降解酶人類基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶D、纖溶酶原激活物抑制劑Ⅰ型(絲氨酸蛋白酶抑制劑)和層粘連蛋白以及血管生成誘導劑CYR61表達均下調(diào)。惡性腫瘤組織通過產(chǎn)生或誘導產(chǎn)生各種蛋白酶降解ECM而向周圍浸潤和轉移。MMPs的蛋白溶解作用可能有3個后果：①允許內(nèi)皮細胞降解并浸潤血管基底膜；②產(chǎn)生ECM降解產(chǎn)物，趨化內(nèi)皮細胞；③激活并固定ECM中的生長因子。MMPs可調(diào)節(jié)細胞與細胞間及細胞與基質(zhì)間的粘附，調(diào)節(jié)新生血管的生成，促進腫瘤細胞的轉移和浸潤^[10]。此外，MMP11有抑制腫瘤細胞凋亡的作用^[11]。組織蛋白酶D(CD)是一種天冬氨酸類溶酶體肽鏈內(nèi)切酶，分泌到細胞外后便降解細胞外基質(zhì)成分。有研究表明CD在侵透胃壁，淋巴結轉移陽性胃癌組織中表達增加，有更強的腹膜轉移傾向。而且發(fā)現(xiàn)浸潤到肌層的胃癌細胞CD強表達，表現(xiàn)出更強的侵襲能力^[12]。層粘連蛋白(LN)是細胞外基質(zhì)的重要成分之一，生理情況下細胞通過LN介導其與細胞外基質(zhì)、細胞與細胞間粘附和信息傳遞，影響細胞的附著、游走、增殖和分化。CYR61是一個細胞外基質(zhì)相關的信號分子，作為整合素受體的配體能促進細胞黏附，游走，增殖和蛋白質(zhì)合成^[13]。此外，作為一個血管生成素誘導劑能促進腫瘤生長和血管形成。因此，活性肽可能通過影響細胞黏附和血管形成從而抑制腫瘤細胞浸潤和轉移。

3.5 腫瘤壞死因子誘導蛋白(GG2-1)、腫瘤壞死因子受體相關因子3(TRAF-3)、腫瘤壞死因子超家族成員4(TNFSF4)和干擾素(α、β、δ)受體1(IFNAR1)，TGF-βRⅡ表達均增高。腫瘤壞死因子對腫瘤細胞有細胞毒作用和生長抑制作用，可誘導許多不同來源腫瘤細胞凋亡；損傷腫瘤血管內(nèi)皮細胞和堵塞血管引起腫瘤缺血、壞死并介導免疫調(diào)節(jié)。干擾素是具有生物活性的細胞因子，參與調(diào)節(jié)免疫反應；促進成熟單核巨噬細胞的吞噬作用，加強對腫瘤細胞的殺傷力；干擾素還可以上調(diào)腫瘤細胞MHC抗原和黏附分子的表達，促進機體對腫瘤細胞的識別和加強抗腫瘤免疫反應；TGF-β對細胞增殖與分化、細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、血管的生成、細胞凋亡及機體免疫系統(tǒng)均起著重要的調(diào)節(jié)作用^[14]。推測抗癌生物活性肽可能通過促進TNF、TGF-β和IFN生成來攻擊、殺傷腫瘤細胞，增強人體免役防御能力，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

通過基因芯片技術對活性肽作用前后膽囊癌GBC-SD細胞基因表達譜的研究，可以發(fā)現(xiàn)有很多表達差異的基因。一方面能初步了解活性肽作用的分子機制，另一方面能發(fā)現(xiàn)更多的與活性肽作用有關的基因、蛋白產(chǎn)物，為進一步的研究提供新思路。測定結果說明活性肽抗腫瘤的機制可能是多種多樣的，多途徑的。通過多種途徑抑制腫瘤新生血管形成，抑制糖酵解從而影響腫瘤細胞的能量代謝；影響線粒體能量代謝觸發(fā)凋亡；下調(diào)多種基質(zhì)降解酶，防止腫瘤細胞向細胞外基質(zhì)和基底膜浸透，降低腫瘤細胞的局部浸潤能力和遠處轉移能力。

總之，抑制腫瘤生長的基因表達下調(diào)，促進腫瘤凋亡的基因表達上調(diào)，兩者協(xié)同作用誘導腫瘤細胞死亡。因此提示抗癌生物活性肽是一個多作用靶點的新型生物制劑，具有良好的應用、開發(fā)前景。但目前的研究還僅限于動物臟器的粗提物，還須以后進一步深入探討其具體的表達產(chǎn)物，利用基因工程技術純化，擴增，用于腫瘤治療。

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