黃清南　黃　耀　趙　潔

[摘要] 目的 探討流式細(xì)胞術(shù)在檢測(cè)甲狀腺穿刺組織細(xì)胞角蛋白－19中的應(yīng)用，評(píng)估其在進(jìn)一步臨床診斷應(yīng)用中的可行性。方法 取我院2006年1月~2008年6月手術(shù)切除甲狀腺腫物標(biāo)本進(jìn)行穿刺獲取組織并制備成單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)懸液中的CK-19表達(dá)；根據(jù)術(shù)后標(biāo)本病理分為良性組（23例）及惡性組（17例）。結(jié)果 惡性組中，陽(yáng)性表達(dá)13例（76.4％），良性組中100％陰性表達(dá)。靈敏度76.4％，特異性100％，準(zhǔn)確度為90.0％；與國(guó)內(nèi)外采用免疫組化方法的靈敏度及特異性相當(dāng)。結(jié)論 CK-19是鑒別良惡性甲狀腺腫瘤特異的及敏感的指標(biāo)，采用流式細(xì)胞術(shù)能較準(zhǔn)確地檢測(cè)甲狀腺穿刺組織中CK-19的表達(dá)，有進(jìn)一步臨床診斷應(yīng)用的可行性。

[關(guān)鍵詞] 甲狀腺腫瘤；流式細(xì)胞術(shù)；細(xì)胞角蛋白－19；細(xì)針穿刺

[中圖分類(lèi)號(hào)] R7361[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2009）12-18-02

Cytokeratins-19 Expression in Biopsy Specimens from Thyroid Neoplasm Detected by Flow Cytometry

HUANG QingnanHUANG YaoZHAO Jie

The Peoples of Futian District in Shenzhen，Guangdong 518033

[Abstract] Objective To study cytokeratins-19 expression in biopsy specimens from thyroid neoplasm detected by flow cytometry and estimate its clinical diagnosis utility. Methods The 50 biopsy specimens were collected after thyroid neoplasm exairesis from January 2006 to June 2008 in the foruth people's hospital of Shenzhen city.All the biopsy specimens were prepared in cell suspension and detected the cytekeratins-19expression，according to postoperative pathology diagnosis，all the specimens was divided into two groups：innocence group（23 cases） and m alignant group（17 cases）. Results 13 cases were positive expression（76.4%） in m alignant groups，all the case were negative expression， sensitivity was 76.4%，specificity was 100%，accuracy was 90%. The sensitivity and the specificity were correspondent to the approach by the immunohistochemisty. Conclusion Cytokeratins-19 is sensitive and specific marker. The approach by the flow cytometry can accuratelydetect the Ck-19 expression in thyroid biopsy specimen，theclinical diagnosis utility is feasible.

[Key Words] Thyroid neoplasms；Flow cytometry；Cytokeratins-19；Biopsy

流式細(xì)胞術(shù)具有檢測(cè)速度快、測(cè)量指標(biāo)多，采集數(shù)據(jù)量大、分析全面、方法靈活等特點(diǎn)，其在腫瘤研究中已廣泛應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)已廣泛應(yīng)用于石蠟標(biāo)本[1]及新鮮穿刺標(biāo)本[2]的腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。本研究主要通過(guò)采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)穿刺甲狀腺組織細(xì)胞角蛋白-19（Cytokeratins-19，CK-19）表達(dá)情況的測(cè)定，從而達(dá)到腫瘤定性的目的及評(píng)估性在進(jìn)一步臨床診斷應(yīng)用中的可行性。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

取我院2006年1月~2008年7月手術(shù)切除甲狀腺腫物標(biāo)本進(jìn)行細(xì)針穿刺獲取組織，其中男13例，女27例；良性病變23例（其中腺瘤8例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大15例）；惡性病變17例（乳頭狀癌15例，濾泡癌2例）；平均年齡（42±8.6）歲。

1.2單細(xì)胞懸液的制作[3]

將獲取的穿刺標(biāo)本反復(fù)用生理鹽水洗滌，以眼科剪將組織剪至勻漿狀加入5mLPBS液，用吸管吸取組織勻漿先以200目銅網(wǎng)過(guò)濾到試管內(nèi)離心沉淀3000r/min，3~5min后，再用PBS液洗三次，每次以1000r/min的低速離心5min去除細(xì)胞碎片，以350目尼龍網(wǎng)過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，取上述細(xì)胞懸液，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板顯微鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)細(xì)胞濃度為（1～2）×106個(gè)/mL。

1.3抗體標(biāo)記

取約1×106細(xì)胞的懸液100μl，分別加入對(duì)照管及測(cè)定管，每管加入10μl CD45-PC5單抗，置室溫15min，離心洗滌后再加破膜劑Intraprep Rengent 1固定15min，經(jīng)洗滌再加入Reagent 2破膜，5min后加入CK19-FIFC置室溫暗處待機(jī)檢測(cè)。

1.4流式細(xì)胞儀測(cè)定

采用beckman-epics-XL流式細(xì)胞儀測(cè)定并用專(zhuān)業(yè)軟件處理數(shù)據(jù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用四格表FISHER精確概率法檢驗(yàn)。靈敏度=癌的陽(yáng)性例數(shù)/癌的總數(shù)×100%；特異度=良性總例數(shù)×100%；準(zhǔn)確度= （癌的陽(yáng)性例數(shù)+良性的陰性例數(shù)） / （癌的總例數(shù)+良性的總例數(shù)）。

2結(jié)果

在惡性組17例（乳頭狀癌15例，濾泡癌2例）中，陽(yáng)性表達(dá)有13例（76.4％），良性組23例（其中腺瘤8例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫大15例）中陰性表達(dá)23例（100％）；兩組間CK-19的陽(yáng)性表達(dá)率用四格表FISHER精確概率法檢驗(yàn)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，靈敏度=13/17×100％=76.4％，特異度100％，準(zhǔn)確度90.0％。細(xì)胞角蛋白-19是鑒別良惡性甲狀腺腫瘤特異性及敏感的指標(biāo)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)甲狀腺穿刺組織中CK-19的表達(dá)情況如表1。在甲狀腺腫瘤定性上敏感度、特異性及準(zhǔn)確性高，有進(jìn)一步臨床診斷應(yīng)用的可行性。

3討論

甲狀腺腫瘤為我國(guó)較高發(fā)的腫瘤之一，及早明確甲狀腺腫瘤的性質(zhì)對(duì)避免良性病變患者不必要的手術(shù)及改善惡性腫瘤患者的預(yù)后有相當(dāng)重要的意義。盡管有很多檢查方法如超聲及CT及MRI等檢查技術(shù)用于甲狀腺腫瘤的診斷，但對(duì)于腫瘤定性上仍有很大局限。組織細(xì)胞病理學(xué)是腫瘤定性的主要方法，但對(duì)以組織結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹?，?qiáng)調(diào)實(shí)質(zhì)和間質(zhì)成分關(guān)系的病變，如甲狀腺乳頭狀癌、濾泡狀癌與乳頭狀增生結(jié)節(jié)的鑒別上有困難[4]。

CK-19是可用于甲狀腺鑒別診斷的一種相對(duì)分子質(zhì)量低的角蛋白[5]，Miettinen等[6]認(rèn)為CK-19可區(qū)別乳頭狀癌和乳頭狀增生，Baloch[7]等其認(rèn)為對(duì)濾泡型乳頭狀癌和其他濾泡性病變亦有區(qū)別作用，研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺良性病變中CK-19多為陰性，僅少數(shù)陽(yáng)性表達(dá)，即使結(jié)甲和甲亢的乳頭狀增生結(jié)節(jié)大多亦為陰性，濾泡性癌中大多陽(yáng)性并中度及強(qiáng)陽(yáng)性，特別是在包膜浸潤(rùn)處明顯陽(yáng)性，而乳頭狀癌不論經(jīng)典型還是濾泡型基本都是中、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在癌周?chē)M織中一些散在浸潤(rùn)腺體亦為明顯陽(yáng)性，而不同于背景組織，提示CK-19陽(yáng)性表達(dá)是濾泡細(xì)胞增生惡變的重要標(biāo)志，不但可作為甲狀腺良、惡性病變，尤其是乳頭狀癌診斷的重要依據(jù)，而且可以提示一些惡性病變傾向，防止漏診。

目前CK-19的檢測(cè)主要是通過(guò)免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行，在甲狀腺穿刺組織用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)CK-19的表達(dá)，目前國(guó)內(nèi)外很少報(bào)道；本研究用手術(shù)切除標(biāo)本模仿活體穿刺操作，以保持與活體操作的一致性；用穿刺組織制備成細(xì)胞懸液，再用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)CK-19的表達(dá)；從結(jié)果可以看到用本方法得出的CK-19的表達(dá)情況在甲狀腺腫瘤定性上與報(bào)道[8]用免疫組織化學(xué)方法得出的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度相近。由此可見(jiàn)，用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)甲狀腺穿刺組織CK-19的表達(dá)，有助于甲狀腺腫瘤的定性，且有進(jìn)一步臨床診斷應(yīng)用的可行性。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 齊亞靈，方艷秋，段秀梅，等. 凋亡抑制蛋白Survivin在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，38（1）：135- 138.

[2] 沈宗麗，朱月清，莊一平，等. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)遺傳不穩(wěn)定性：肺癌穿刺標(biāo)本中DNA異倍體與P16表達(dá)[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2007，24（3）：322-324.

[3] 賈云香，孫兆瑤，卓夏陽(yáng)，等. 流式細(xì)胞術(shù)新鮮實(shí)體瘤檢測(cè)樣本的制作[J]. 江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2006，24（6）：513-514.

[4] 方芳，鄭宏庭，劉理等. 細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)甲狀腺腫瘤診斷價(jià)值的探討[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2006，35（10）：877-878.

[5] 滕曉東，王麗君，姚洪田，等. 細(xì)胞角蛋白19、galectin-3、HBME-1在甲狀腺病變上的表達(dá)及鑒別診斷意義[J]. 中華病理學(xué)雜志，2004，33（3）：212-216.

[6] Miettinen M，Kovatich AJ，Karkkainen P. Keratin subsets in papillary and follicular thyroid lesions：a paraffin section analysis with diagnosis implications[J]. Vichows Arch，1997，431（6）：407-4l3．

[7] Baloch ZW，Abraham S，Roberts S，et a1. Differential expression of cytokeratins in follicular variant papillary carcinoma：an imunohistochemical study and its diagnostic utility[J]. Hum Patho1，1999，30（10）：l166-1171.

[8] 何春年，Lili H，Jin Q CH，等. 甲狀腺乳頭狀癌診斷與鑒別的可靠標(biāo)記物[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2007，23（6）：694-698.

（收稿日期：2008-12-23）