劉彥斌　米振國　楊新晶　任連生

[摘要]目的：觀察聯(lián)合應用塞來昔布與卡介苗治療大鼠膀胱腫瘤的療效，并探討其機制。方法：選用5～6周齡雌性Wistar大白鼠40只，隨機分為4組，即PBS組、塞來昔布組、卡介苗組、塞來昔布+卡介苗組。均采用膀胱灌注MNU(N-甲基亞硝基脲)制成大鼠膀胱腫瘤模型，于灌注MNU后第10周開始給予相應的藥物干預治療，于第13周處死所有大鼠，觀察膀胱腫瘤的形成情況，免疫組織化學檢測腫瘤組織中的CD3+、CD4+、CD8+細胞的浸潤情況，TUNEL法檢測腫瘤細胞的凋亡指數(shù)（apoptotic index,AI）。結(jié)果：聯(lián)合用藥組CD3+、CD4+、CD8+細胞浸潤百分比及腫瘤細胞AI值與其他組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：聯(lián)合應用塞來昔布和卡介苗比單純使用卡介苗或塞來昔布能更加明顯地抑制大鼠膀胱腫瘤的生長，其機制可能是通過促進免疫系統(tǒng)的功能和誘導腫瘤細胞凋亡增加而發(fā)揮作用的。

[關(guān)鍵詞] 膀胱腫瘤；塞來昔布；卡介苗

[中圖分類號] R737.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1674-4721（2009）05（a）-０25－０3

Effect of BCG combined with celecoxib on the animal model of bladder tumor

LIU Yanbin1,MI Zhenguo2*,YANG Xinjing1,REN Liansheng2

（1.The First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China；2.Shanxi Tumor Hospital,Taiyuan 030013,China）

[Abstract] Objective: To observe the effect ofCelecoxib combined with BCG on the Wistar rats model of bladder tumor and discuss the mechanism of the therapeusis. Methods: Separated forty female 5-6 week-old Wistar rats into four groups: PBS groups, Celecoxib groups, BCG groups, Celecoxib+ BCG groups randomly. All the rats were irrigated MNU(M-methyl-N-nitrosourea) into their bladders to make of the bladder tumor models. Treatment took place on tenth week after irrigated MNU, four groups were irrigated corresponding drug into bladders; at thirteen week executed all rats, observed the development of bladder tumor, detected infiltrating condition of CD3+, CD4+, CD8+ cells in tumor tissues with immunohistochemistry, detected apoptosis condition of tumor cells with the method of TUNEL. Results: Celecoxib+ BCG groups compared with the other groups，the difference of the infiltration percentage of CD3+, CD4+, CD8+ cell and the degree of tumor cell apoptosis has statistical significance（P<0.05）. Conclusion: Combined Celecoxib and BCG can be more conspicuous inhibition of tumor growth of rat bladder than the use of celecoxib or BCG alone, The mechanism is maybe that promoting the function of immune system and increasing tumor cells apoptosis.

[Key words] Bladder tumor; Celecoxib; BCG

膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)中最常見的腫瘤，90%以上為移行上皮細胞癌，大部分為淺表性膀胱癌,除了用手術(shù)治療以外，還須輔以抗腫瘤藥物膀胱內(nèi)灌注治療，但有一定的復發(fā)率和應用藥物的副作用，其中卡介苗是主要的治療藥物。本研究采用MNU膀胱灌注誘導建立大鼠膀胱腫瘤模型，用塞來昔布和卡介苗單獨和聯(lián)合用藥，評價其療效，以尋求更安全有效的膀胱腫瘤藥物聯(lián)合治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及主要試劑

5～6周齡Wistar雌性大鼠，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供；MNU由美國Sigma公司生產(chǎn)；凍干卡介苗購自上海生物制品研究所；塞來昔布由美國輝瑞公司生產(chǎn)。

1.1.2 試劑的配制

MNU溶液：用pH 6.0的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液為溶劑，將MUN配成濃度為20 mg/ml的溶液，每只大鼠用量0.1 ml。BCG溶液：50 mg/支凍干卡介苗溶于5 ml生理鹽水中，每只大鼠用量0.1 ml。塞來昔布:每只大鼠用量100 mg/kg，按大鼠體重確定其用量，溶于2 ml生理鹽水中。

1.2 方法

1.2.1 膀胱腫瘤大鼠模型的制備

40只大鼠造模過程：灌注前腹腔內(nèi)注射0.6%的戊巴比妥鈉麻醉動物，劑量為2.5 ml/kg。起效后仰臥固定，0.1%的碘伏消毒尿道外口后，用5 cm硬膜外導管導尿排空膀胱后，接上帶有6號半針頭的1 ml注射器按計劃向膀胱內(nèi)注入0.1 ml MNU溶液，每2周1次，共5次。

1.2.2 分組及處理

于第10周，將40只大鼠隨機分為4組：PBS組，塞來昔布組、卡介苗組、塞來昔布+卡介苗組，每組10只。開始給予藥物干預治療，分別給予0.1 ml PBS、100 mg/kg塞來昔布、0.1 ml 卡介苗、100 mg/kg塞來昔布+0.1 ml卡介苗，PBS 與卡介苗采用膀胱灌注給藥，每周1次，共3次，塞來昔布采用灌胃給藥，每天1次，共3周。

1.2.3 標本處理

1.2.3.1 病理切片觀察：于第13周采用斷頸法處死大鼠，解剖膀胱，完整切取膀胱，于膀胱前壁剖開，觀察膀胱內(nèi)表面及腫瘤形成的大體情況；在病變明顯處切取部分腫瘤組織，置于中性福爾馬林溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.3.2 免疫狀態(tài)檢測：用免疫組化法分別檢測切片中腫瘤組織中CD3+、CD4+、CD8+的表達量；TUNEL法檢測腫瘤組織細胞的AI值。

1.2.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用x±s表示，所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進行處理, 用SNK法進行多個樣本均數(shù)的方差分析，以α=0.05作為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 MNU誘發(fā)膀胱腫瘤情況

解剖切開膀胱發(fā)現(xiàn)膀胱壁增厚、蒼白、菜花狀新生物形成，絕大多數(shù)為多發(fā)腫瘤。HE 染色結(jié)果:移行上皮結(jié)構(gòu)特征部分消失，呈彌漫分布或排列成實體性癌灶。細胞異形明顯，表現(xiàn)為細胞大小不一，排列紊亂，極向消失，核畸形，核漿比例大，核分裂像明顯。

2.2 塞來昔布及卡介苗的抑瘤作用

2.2.1免疫組化檢測計數(shù)結(jié)果（表1）

各組均出現(xiàn)不同程度的免疫細胞浸潤呈棕褐色染色（圖1～3）。每個視野計數(shù)100個細胞，計數(shù)3個視野，計算陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分率。其余3組CD3+、CD4+、CD8+細胞的浸潤百分比與PBS組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組與卡介苗組及塞來昔布組比較，免疫細胞浸潤更明顯（P<0.05），聯(lián)合用藥可以增強免疫細胞在腫瘤組織局部的作用。

2.2.2凋亡細胞檢測計數(shù)結(jié)果（表1）

各組均出現(xiàn)不同程度的腫瘤細胞核呈棕褐色染色（圖4）。其他實驗組AI均明顯高于PBS組（P<0.05）。且聯(lián)合用藥組與卡介苗組及塞來昔布組比較凋亡更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，以卡介苗為基礎的聯(lián)合灌注治療能夠明顯地延長膀胱癌患者的總體生存時間?？ń槊绨l(fā)揮抗癌作用的主要方式是通過激活免疫系統(tǒng)而發(fā)揮作用[1]。

近期研究表明,在淺表性膀胱癌和人類其他腫瘤的癌組織和細胞系中檢測到COX-2 蛋白及分子水平都有高表達[2-4]。COX-2誘導產(chǎn)生的PGE2分泌增加與機體免疫抑制相關(guān)，PGE2能降低機體的抗腫瘤免疫而促進腫瘤的生長[5]。研究認為，塞來昔布抗腫瘤效應主要是通過降低PGE2水平從而增強免疫系統(tǒng)的功能來起作用的。

研究表明，在BCG激活的膀胱腫瘤局部免疫中，CD4+T細胞在膀胱黏膜下層的浸潤是最重要的，CD4+T細胞的表達量直接關(guān)系到BCG激活的免疫系統(tǒng)的效能[6]。本實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組CD3+、CD4+T細胞比單獨用藥組有顯著的增長，其差別有統(tǒng)計學意義。本研究中，CD8+T細胞的表達量用藥組比PBS組均減小，聯(lián)合用藥組減少更顯著。研究表明，CD8+T細胞在用藥治療早期是升高的，但是治療后期會下降，這與大量的CD8+T細胞作用于腫瘤細胞，殺傷腫瘤細胞的同時，自身也崩解、凋亡有關(guān)。塞來昔布組與PBS組比較，腫瘤免疫細胞的表達量的差異無統(tǒng)計學意義，這說明在無BCG激活局部免疫反應的條件下，使用塞來昔布難以充分調(diào)動機體的免疫反應，其抗腫瘤效應主要是通過抑制PGE2的產(chǎn)生從而提高腫瘤定向細胞毒性作用[7]。說明聯(lián)合使用塞來昔布和卡介苗可以更大地激活免疫系統(tǒng)的反應性。

凋亡細胞指數(shù)是衡量組織中細胞凋亡發(fā)生程度的一項指標，本實驗通過TUNEL法檢測各組腫瘤組織的凋亡細胞，觀察藥物對腫瘤細胞的凋亡和生長抑制的影響。本研究中，聯(lián)合用藥組的AI值明顯高于其他各組，差別有統(tǒng)計學意義。說明聯(lián)合塞來昔布和卡介苗能顯著增加腫瘤細胞的凋亡，抑制其分化增值。

綜上所述，塞來昔布聯(lián)合卡介苗治療膀胱腫瘤，比單純使用卡介苗及塞來昔布更有效，但要成為一種新的膀胱腫瘤的治療方法，還需要進一步的試驗和研究。

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（收稿日期：2009-03-16）