劉曉光　周永健　夏義山　袁建琴　劉承宜

摘要：采用跑臺下坡跑模型，研究了不同劑量的低強(qiáng)度氦氖激光對大鼠力竭運(yùn)動后骨骼肌自由基、一氧化氮(NO)代謝的影響。72只SD大鼠隨機(jī)分成安靜對照組，運(yùn)動對照組，運(yùn)動加低、中、高劑量激光處理組。各運(yùn)動組的大鼠均進(jìn)行一次性跑臺力竭運(yùn)動，運(yùn)動加激光組的大鼠在運(yùn)動后于腓腸肌處接受氦氖激光照射，每日1次，各劑量組照射參數(shù)分別為12、28和43 J/cm2(20、46和71 mW/cm2，10 min)。運(yùn)動后24和48 h進(jìn)行腓腸肌取材，檢測指標(biāo)為肌肉超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)以及一氧化氮(NO)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動后，運(yùn)動對照組的MDA水平和NOS活性顯著升高，而SOD活性和NO變化不明顯。43 J/cm2的激光照射能顯著提高力竭運(yùn)動后的SOD活性、降低MDA水平以及顯著提高NOS活性和NO水平，而12和28 J/cm2的激光照射則作用不明顯。由此表明，低強(qiáng)度氦氖激光能夠提高大鼠力竭運(yùn)動后骨骼肌抗氧化能力、降低自由基水平，并能促進(jìn)骨骼肌NO的合成，提高NO水平，其作用是劑量和強(qiáng)度依賴性的。

關(guān)鍵詞：運(yùn)動生物化學(xué)；低強(qiáng)度激光；光生物調(diào)節(jié)作用；自由基；一氧化氮；力竭運(yùn)動

中圖分類號：G804.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1006-7116(2009)06-0102-05

Effects of low-level laser irradiation on the metabolism of free radicals and

nitric oxide of rat skeletal muscle after exhaustive exercise

LIU Xiao-guang1，2，ZHOU Yong-jian1，XIA Yi- shan1，YUAN Jian-qin1，LIU Cheng-yi1，2

（1.Lab of Laser Sports Medicine，South China Normal University，Guangzhou 510006，China；

2. Institute of Biomedical Photonics，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China）

Abstract: This study has investigated the effects of low-level He-Ne laser irradiation at different doses on the metabolism of free radicals and nitric oxide (NO) of rat skeletal muscle after exhaustive exercise by using the animal model of downhill running. Seventy-two Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups: sedentary control group, exercise control group，exercise + low-dose laser group, exercise + medium-dose laser group, and exercise + high-dose laser group. Each rat in the exercise control group and the three exercise plus laser groups performed a bout of exhaustive downhill running on treadmill. Three exercise plus laser groups received He-Ne laser irradiation after exercise at gastrocnemius muscles daily. The irradiation parameters for three different dose laser groups were 12, 28, and 43 J/cm2（20, 46, and 71 mW/cm2，10 min）, respectively. Gastrocnemius muscles were sampled at 24 and 48 h after exercise. Muscle superoxide dismutase (SOD), malondiadehyde (MDA), nitric oxide synthase (NOS) and NO were analyzed. The exercise control group exhibited significant elevations in muscle MDA level and NOS activity after exhaustive exercise. He-Ne laser irradiation at 43 J/cm2 significantly enhanced muscle SOD activity, NOS activity and NO level and significantly reduced muscle MDA level after exercise, whereas the effects of the irradiation at 12 or 28 J/cm2 were unmarked. In conclusion, low-level laser irradiation could enhance muscle anti-oxidative capacity and reduce free radicals level, and promote to synthesize NO and increase NO level in a dose/intensity-dependent manner.

Key words: exercise biochemistry；low-level laser；photobiomodulation；free radical；nitric oxide；exhaustive exercise

劇烈運(yùn)動，特別是劇烈離心運(yùn)動后，肌肉常常會發(fā)生延遲性酸痛(Delayed onset muscle soreness，DOMS)。它可能與肌纖維高張力損傷、組織炎癥、缺血、自由基損傷等有關(guān)，目前尚缺乏良好的治療方法[1-2]。

低強(qiáng)度激光(low intensity laser，LIL)能夠減輕炎癥、提高機(jī)體抗氧化能力，增加局部血流量[3，4]，有人嘗試用低強(qiáng)度激光或單色二極管光療法治療DOMS，但可能由于照射劑量、強(qiáng)度等不同而得到了不同的臨床結(jié)果[5-7]。本研究通過動物實驗，研究不同劑量的LIL對力竭性離心運(yùn)動后骨骼肌自由基代謝和一氧化氮(nitric oxide，NO)代謝的影響，旨在為低強(qiáng)度激光療法治療DOMS提供理論依據(jù)。

1研究對象與方法

1.1研究對象與分組

成年雌性大鼠72只，體重(202±20) g。大鼠隨機(jī)分為5組：1)安靜對照組；2)運(yùn)動對照組；3)3個運(yùn)動加激光處理組(低劑量激光組、中劑量激光組、高劑量激光組)。運(yùn)動對照組和運(yùn)動加激光組又進(jìn)一步分為運(yùn)動后24 h亞組和運(yùn)動后48 h亞組，共8個亞組，安靜對照組和各亞組的動物均為8只。

1.2運(yùn)動方式

運(yùn)動對照組和運(yùn)動加激光處理組的大鼠均進(jìn)行一次性的力竭離心運(yùn)動，采用Armstrong等[8]的力竭離心運(yùn)動模型。動物在跑臺上進(jìn)行下坡跑(-16°，16 m/min)，運(yùn)動至力竭。運(yùn)動時使用聲、光刺激或用毛刷刺激動物尾部，使動物保持在跑道前1/3處，以保證運(yùn)動強(qiáng)度。力竭標(biāo)準(zhǔn)：動物不能維持跑臺速度，先后滯于跑道后1/3處達(dá)3次，每次達(dá)10 s以上，刺激驅(qū)趕無效。運(yùn)動至力竭時間為(240±81) min。安靜對照組不進(jìn)行跑臺運(yùn)動，最后同運(yùn)動組一起處死并取材。

1.3激光照射方法

運(yùn)動加激光處理組在力竭運(yùn)動后以低強(qiáng)度氦氖激光(波長632.8 nm，光斑直徑0.5 cm)進(jìn)行照射。照射前，大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥鈉(20 mg/kg)腹腔內(nèi)注射輕度麻醉，然后固定于鼠類固定臺上，剪去局部毛發(fā)，在腓腸肌肌腹中點處進(jìn)行激光照射，光纖與皮膚直接接觸，垂直于皮膚。低、中、高劑量激光組的照射功率分別為4、9和14 mW，功率密度分別為20、46和71 mW/cm2，每次照射10 min，對應(yīng)的劑量分別為12、28和43 J/cm2。各劑量運(yùn)動后24 h亞組在運(yùn)動后即刻、運(yùn)動后18 h各照射1次，共照射2次；各劑量組運(yùn)動后48 h亞組在運(yùn)動后即刻、運(yùn)動后18 h、運(yùn)動后42 h各照射1次，共照射3次。安靜對照組和運(yùn)動對照組均不照射激光。

1.4動物取材和標(biāo)本制備

各運(yùn)動后24 h亞組在運(yùn)動后24 h取材；各運(yùn)動后48 h亞組在運(yùn)動后48 h取材。取材前用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，迅速取后肢腓腸肌，在生理鹽水中清洗，除去可見的結(jié)締組織，錫紙包好后立即放入液氮中冷凍保存。將腓腸肌取出解凍后，稱取0.5 g的肌肉組織，加入生理鹽水，于冰凍環(huán)境中剪碎并用研磨器研碎，制備成10％勻漿，3 500 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.5實驗儀器與試劑

DSPT202型動物跑臺由杭州立泰科技有限公司生產(chǎn)；5801R型低溫離心機(jī)由德國Eppendorf公司生產(chǎn)，HN-1000型低強(qiáng)度氦氖激光治療儀由廣州激光技術(shù)研究所生產(chǎn)；722型分光光度計由上海第三分析儀器廠生產(chǎn)。SOD、MDA、NO、NOS以及蛋白質(zhì)檢測試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.6指標(biāo)檢測

肌肉SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定；NO含量采用硝酸還原酶法測定，NOS活性采用比色法測定。測得的肌肉SOD、MDA、NO和NOS數(shù)據(jù)均以肌肉蛋白含量進(jìn)行修正，肌肉蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行各組間的差異顯著性檢驗，顯著性水平為P<0.05，非常顯著性水平為P<0.01。

2結(jié)果與分析

2.1大鼠肌肉SOD活性在力竭運(yùn)動后的變化

運(yùn)動對照組的肌肉SOD活性在運(yùn)動后24 h略低于安靜對照組水平，而在運(yùn)動后48 h略高于安靜對照組水平，但這些差異均沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義。在高劑量激光組，肌肉SOD活性明顯增加，在運(yùn)動后24 h，比安靜對照組和運(yùn)動對照組分別高47%和63%，而在運(yùn)動后48 h，則比安靜對照組和運(yùn)動對照組分別高61%和49%，差異具有非常顯著意義(P<0.01)(見表1)。低、中劑量激光照射對大鼠力竭運(yùn)動后肌肉SOD活性變化沒有顯著影響。

2.2大鼠肌肉MDA含量在力竭運(yùn)動后的變化

運(yùn)動對照組的肌肉MDA水平運(yùn)動后明顯升高，在運(yùn)動后24 h，比安靜對照組高23%，差異具有顯著意義(P<0.05)；在運(yùn)動后48 h有所恢復(fù)，仍略高于安靜對照組。在高劑量激光組，肌肉MDA水平在運(yùn)動后24 h和48 h均明顯低于運(yùn)動對照組，差異具有顯著意義(P<0.05)(見表1)。低、中劑量激光組肌肉MDA在運(yùn)動后相對于安靜對照組水平的升幅低于運(yùn)動對照組，但差異沒有顯著意義。

2.3大鼠肌肉NOS活性在力竭運(yùn)動后的變化

各組肌肉NOS活性在力竭運(yùn)動后24 h和48 h均明顯升高，運(yùn)動對照組，低、中、高劑量激光組NOS活性在運(yùn)動后24 h分別比安靜對照組水平升高53%、39%、45%和110%，在運(yùn)動后48 h升幅仍分別有39%、47%、41%和94%。高劑量激光組NOS活性在運(yùn)動后24 h和48 h均顯著高于運(yùn)動對照組，差異具有非常顯著意義(P<0.01)(見表2)。低、中劑量激光組NOS活性與運(yùn)動對照組相比沒有明顯差異。

2.4大鼠肌肉NO含量在力竭運(yùn)動后的變化

運(yùn)動對照組的肌肉NO含量在力竭運(yùn)動后24 h和48 h均低于安靜對照組水平，但差異不具有顯著意義(P>0.05)。在高劑量激光組，肌肉NO含量運(yùn)動后24和48 h均明顯高于運(yùn)動對照組(分別高105%和101%)，差異非常顯著(P<0.01)，同時也高于安靜對照組水平(分別高51%和58%)，差異有顯著意義(P<0.05)(見表2)。低、中劑量激光組NO含量與運(yùn)動對照組相比沒有明顯差異。

3討論

3.1力竭運(yùn)動后骨骼肌自由基及NO的代謝變化

大量研究表明，力竭運(yùn)動后骨骼肌MDA水平會顯著增加，其峰值出現(xiàn)在運(yùn)動后3~24 h，然后逐漸恢復(fù)到安靜水平[9-11]。關(guān)于力竭運(yùn)動后骨骼肌SOD活性的變化，文獻(xiàn)報道的結(jié)果則不一致，在力竭運(yùn)動后即刻及運(yùn)動后24 h，骨骼肌SOD活性可表現(xiàn)為下降或上升[9-10，12]，這可能與力竭運(yùn)動的強(qiáng)度和持續(xù)時間不同有關(guān)。本實驗中，骨骼肌MDA水平在運(yùn)動后明顯增加，峰值出現(xiàn)在運(yùn)動后24 h，在運(yùn)動后48 h有所恢復(fù)但仍略高于安靜對照組水平，這與以往的研究結(jié)果是一致的。本實驗中，大鼠力竭運(yùn)動時間較長，骨骼肌SOD活性在運(yùn)動后24 h略低于安靜對照組水平，而在運(yùn)動后48 h則回升至略高于安靜對照組水平，這與陶占泉等[10]的研究結(jié)果相一致。

運(yùn)動內(nèi)源性自由基的產(chǎn)生機(jī)制包括線粒體機(jī)制、黃嘌呤氧化酶機(jī)制、中性粒細(xì)胞機(jī)制等[13]，過多的自由基會對組織細(xì)胞造成損害，正常情況下，機(jī)體氧化和抗氧化作用處于動態(tài)平衡之中，力竭運(yùn)動則有可能使機(jī)體氧化和抗氧化作用失去平衡，體內(nèi)由此出現(xiàn)過量的自由基。本實驗中，骨骼肌氧化和抗氧化作用失衡在運(yùn)動后24 h非常明顯，在運(yùn)動后48 h失衡現(xiàn)象有所減輕，鑒于DOMS的臨床癥狀在運(yùn)動后1~2 d最為明顯，本實驗結(jié)果間接支持自由基在DOMS的發(fā)生過程中引起繼發(fā)性損傷的觀點[14]。

力竭運(yùn)動后骨骼肌NO代謝如何變化，研究結(jié)果尚不太一致。多數(shù)動物研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動后，骨骼肌NO含量在運(yùn)動后即刻及運(yùn)動后24 h均低于安靜對照組水平[15-16]，未訓(xùn)練鼠的骨骼肌NOS活性在力竭運(yùn)動后即刻及運(yùn)動后24 h均明顯高于安靜對照組水平[15]，訓(xùn)練鼠的骨骼肌NOS活性在力竭運(yùn)動后即刻低于安靜對照組水平，24 h后回升至接近安靜對照組水平[15-16]。張全江等[17]報告了不同的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)小鼠骨骼肌NO含量在力竭運(yùn)動后即刻及運(yùn)動后24 h均高于安靜對照組水平，這可能是力竭運(yùn)動的強(qiáng)度或持續(xù)時間不同所致。本實驗發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動后24 h和48 h，運(yùn)動對照組的骨骼肌NO含量均低于安靜對照組水平，但差異不顯著(P>0.05)，而骨骼肌NOS活性則明顯高于安靜對照組水平(P<0.05)，這與多數(shù)研究結(jié)果基本一致。

力竭運(yùn)動后機(jī)體NO水平下降的確切原因目前尚不清楚，可能有生成減少和清除率增加這兩方面的因素。NO是由NOS催化左旋精氨酸和分子氧發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的，力竭運(yùn)動后可能會出現(xiàn)體內(nèi)精氨酸的缺乏或不足，在精氨酸的缺乏或不足的情況下，NOS的催化作用會發(fā)生改變，不是生成NO，而是生成超氧陰離子(O2-)[18]，這可能是NO水平下降的重要原因。另外，在力竭運(yùn)動中和力竭運(yùn)動后，O2-會由多種途徑不斷地產(chǎn)生，而SOD活性被抑制不能將O2-及時清除，O2-可以與NO反應(yīng)生成細(xì)胞毒性極大的過氧化亞硝酸離子(ONOO-)[19]，降低NO的生物利用度。力竭運(yùn)動后骨骼肌NO水平的下降可能意味著局部過氧化亞硝酸離子濃度的增加和局部血流量的減少，過氧化亞硝酸離子可導(dǎo)致肌細(xì)胞的損傷，因此，骨骼肌NO水平的下降可能與DOMS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。力竭運(yùn)動后骨骼肌NO水平和NOS活性表現(xiàn)出不一致的變化，其原因尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

3.2低強(qiáng)度激光照射對大鼠力竭運(yùn)動后骨骼肌自由基代謝的影響

本實驗首次研究了不同劑量氦氖激光對大鼠力竭運(yùn)動后骨骼肌自由基代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，43 J/cm2(71 mW/cm2，10 min)的激光照射可以顯著地提高大鼠力竭運(yùn)動后骨骼肌抗氧化酶(SOD)的活性，同時顯著地降低骨骼肌MDA水平。Fillipin等[20]發(fā)現(xiàn)，LIL可使挫傷跟腱的SOD活性顯著增高，MDA水平顯著降低，而顏紅金等[21]則發(fā)現(xiàn)，LIL可使老齡小鼠肝組織的SOD活性顯著增高，MDA水平顯著降低，這些研究結(jié)果與本實驗結(jié)果是一致的。如前所述，力竭運(yùn)動后骨骼肌氧化與抗氧化作用會出現(xiàn)明顯失衡，而LIL可以有效地糾正這種失衡，從而有可能減輕或防止力竭運(yùn)動后的骨骼肌自由基損傷。12、28 J/cm2(20、46 mW/cm2，10 min)的激光照射對骨骼肌SOD活性和MDA含量沒有明顯影響，由此可見，低強(qiáng)度氦氖激光的效應(yīng)是劑量與強(qiáng)度依賴性的。

LIL可通過提高抗氧化酶活性加速自由基的清除，也能夠減少自由基的產(chǎn)生。分子水平研究顯示，線粒體呼吸鏈上的細(xì)胞色素c、b等能選擇性地吸收特定波長的單色光，使得電子傳遞鏈耦合加強(qiáng)，促進(jìn)電子傳遞，減少活性氧的產(chǎn)生[3]。細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)劑量的低強(qiáng)度激光可以明顯降低電刺激后C2C12肌管細(xì)胞的活性氧水平，改善線粒體的功能[22]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度激光可以抑制中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，減少其產(chǎn)生的活性氧[23]。至于LIL如何提高抗氧化酶活性，其具體機(jī)制目前尚不清楚。

3.3低強(qiáng)度激光照射對大鼠力竭運(yùn)動后骨骼肌NO代謝的影響

本實驗首次發(fā)現(xiàn)，43 J/cm2的氦氖激光照射能夠明顯提高大鼠力竭運(yùn)動后的骨骼肌NOS活性和NO水平。LIL可能通過幾種途徑影響大鼠力竭運(yùn)動后的骨骼肌NO代謝。李菊香等[24]研究發(fā)現(xiàn)，O2-可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞NOS的活性，而本研究顯示，LIL能夠提高骨骼肌SOD活性，因此，LIL有可能通過清除肌組織內(nèi)的O2-而提高肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的NOS活性。鐘光珍等[25]的研究表明，LIL可以促進(jìn)細(xì)胞膜氨基酸載體對左旋精氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此而增加NO的合成。此外，LIL也可能通過降低骨骼肌O2-水平而減少NO的淬滅。本實驗觀察到，低強(qiáng)度氦氖激光能使大鼠力竭運(yùn)動后的骨骼肌MDA水平顯著降低，而骨骼肌NO水平則顯著增加，這提示低強(qiáng)度氦氖激光可能減輕力竭運(yùn)動后的骨骼肌損傷，有利于損傷的修復(fù)。

經(jīng)43 J/cm2激光照射，力竭大鼠的骨骼肌NO水平和NOS活性在運(yùn)動后24 h和48 h均顯著高于運(yùn)動對照組，也高于安靜對照組水平，而12和28 J/cm2的激光照射則無明顯作用，這說明低強(qiáng)度氦氖激光對力竭運(yùn)動后骨骼肌NO代謝的作用也是劑量與強(qiáng)度依賴性的。

綜上所述，低強(qiáng)度氦氖激光能夠提高大鼠力竭運(yùn)動后骨骼肌抗氧化能力、降低骨骼肌自由基水平，并能提高大鼠力竭運(yùn)動后骨骼肌NOS活性，增加骨骼肌NO水平。低強(qiáng)度氦氖激光對大鼠力竭運(yùn)動后骨骼肌自由基代謝和NO代謝的作用效應(yīng)與其照射劑量和強(qiáng)度有關(guān)，43 J/cm2(71 mW/cm2，10 min)的激光照射作用明顯，而12、28 J/cm2(20、46 mW/cm2，10 min)的激光照射作用不明顯。

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[編輯：鄭植友]