申杰華

摘要：RNA 剪接是一個多步驟、形成多種中間狀態(tài)復(fù)合物的復(fù)雜過程?？缥锓N的基因表達更顯得復(fù)雜，RNA剪接是基因表達調(diào)控中重要的步驟。這里討論酵母和植物的剪接位點保守序列的差異，指出可能對植物基因在酵母中表達有重要作用的順式作用元件。

關(guān)鍵詞：RNA剪接；剪接體；剪接因子；跨物種表達；剪接位點

釀酒酵母細(xì)胞繁殖快，操作簡便，屬于真核模式生物。將植物的基因放入酵母中表達，在于能用酵母細(xì)胞大量表達植物蛋白。在2002年有一篇論文關(guān)于植物mRNA前體在裂殖酵母中的剪接和1983年的跨物種基因表達的研究。[1]

RNA剪接(RNA splicing)是tRNA、rRNA，特別是mRNA加工與成熟的重要生物學(xué)過程，也是蛋白質(zhì)分子多樣性產(chǎn)生的關(guān)鍵機制之一，在基因表達調(diào)控中扮演著重要的角色[2]。RNA剪接需要多種因子參與， 包括雜性核RNA(heterogeneous nuclear I A，hnRNA)結(jié)合蛋白hnRNP(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)、小型核RNA (small nuclear RNA，snRNA)結(jié)合蛋白snRNP(small nuclear ribonucleoprotein)等。核pre-mRNAs 剪接由剪接體執(zhí)行，剪接體包含有5種（U1,U2,U4/6,和U5）snRNPs和其他non-snRNP剪接因子。[3]在真核細(xì)胞內(nèi)，RNA原初轉(zhuǎn)錄物的分子很大，通過剪接產(chǎn)生成熟的mRNA分子．

1Pre-RNA剪接反應(yīng)機制概述

真核生物細(xì)胞核基因初始轉(zhuǎn)錄物(pre-mRNA)剪接由兩步連續(xù)進行的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)完成(Padgett，1984Ruskin，1984)。首先，分支位點(branch site)處的腺苷酸2羥基親核攻擊5剪接位點的3一5磷酸二酯鍵，產(chǎn)生兩種剪接中間體分子：一為5外顯子對應(yīng)的線性RNA分子；一為由內(nèi)含子5一端鳥苷酸與分支點腺苷酸之間通過2一5磷酸二酯鍵形成的套索狀分子，該分子包含了內(nèi)含子和3外顯子序列。緊接著5一外顯子的3羥基攻擊3剪接位點的磷酸二酯鍵，去除套索狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子序列，同時將相鄰的兩個外顯子連接起來[4]。

2剪接體組裝中的內(nèi)含子和外顯子的界定

U1snRNP結(jié)合上5剪接位點SF1結(jié)合到分支區(qū)域促使U2AF結(jié)合到聚嘧啶區(qū)域和3剪接位點上，導(dǎo)致早期復(fù)合體的形成（E complex）。在A復(fù)合體中U2snRNP和mRNA 前體形成穩(wěn)定的snRNA-branch-region duplex。U4-U5-U6 3snRNP結(jié)合到A復(fù)合體上產(chǎn)生C復(fù)合體，一個成熟的剪接體。（1）內(nèi)含子界定：mRNA 前體含有1個內(nèi)含子和2個外顯子，在E復(fù)合體上的剪接因子結(jié)合在剪接位點上跨過內(nèi)含子。（2）外顯子界定：在mRNA 前體中含有多個內(nèi)含子和外顯子，E復(fù)合體中的剪接因子結(jié)合在剪接位點上在外顯子定義的早期復(fù)合體上（EDE complex）,隨后形成了A復(fù)合體（EDA complex），在組裝成熟剪接體的過程中有一個內(nèi)含子界定的復(fù)合體的過渡[5]。

3剪接體的組裝過程

mRNA 前體原始轉(zhuǎn)錄物被蛋白（hnRNP Proteins;putative AU-biding proteins in plants）結(jié)合上,這類蛋白中的一些可能會結(jié)合上特殊的序列或者結(jié)合剪接因子.U1snRNP 和蛋白的相互作用（比如U2AF）形成一個復(fù)合體。結(jié)合U2 snRNP形成剪接體的前體，再結(jié)合上U4/U6-U5就形成了剪接體。隨著這個復(fù)合體一系列的RNA-RNA間的相互作用和重組的改變，剪接反應(yīng)發(fā)生了。剪接后，間接產(chǎn)物和剪接后復(fù)合體被釋放，內(nèi)含子被降解，剪接體結(jié)合在內(nèi)含子上而后進入新的一輪循環(huán)中[6]。

4mRNA前體剪接因子

4.1 SR蛋白

SR蛋白家族是近些年來為人們廣泛關(guān)注的一類剪接因子，它在剪接復(fù)合體的聚集形成，以及剪接因子在mRNA前體鏈上結(jié)合位點的識別過程中起著關(guān)鍵作用。其成員包括SC35(spliesome component of 35kD)、SF2/ASF(splicing factor 2/alternative splicing factor)、SRP20、SRP30、SRP40、SRP55和SRP70等。SR 家 族 剪接因子的結(jié)構(gòu)特點是氨基酸序列中富含絲氨酸一精氨酸殘基。其中RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RNA binding domain)位于氨基末端(N末端)，具有結(jié)合RNA的能力。而位于竣基末端的是含不同絲氨酸和精氨酸殘基數(shù)量的RS 結(jié)構(gòu)域(RS domain)，它能夠與具有RS結(jié)構(gòu)域的U2AF(U2 auxiliary factor)的35kD亞基和U1snRNP7OkD的蛋白質(zhì)相互作用，因而能夠促進U2AF和U1snRNP與剪接位置結(jié)合。所以，SR蛋白在高等真核生物細(xì)胞中介導(dǎo)U1snRNP同5剪接位點結(jié)合與U2AF同3'剪接位點結(jié)合，起著“橋”的作用。關(guān)于SR蛋白在選擇性剪接中對剪接位點的調(diào)控，主要是通過與不同的幾個順式調(diào)節(jié)因子作用。如通過與外顯子的剪接增強子(exonic splicing enhancer，ESE)、內(nèi)含子的剪接增強子(intronic splicing enhancer，ISE)、外顯子的剪接沉默子(exomcsplicing silencer，ESS)和內(nèi)含子的剪接沉默子(Intronic splcing silencer，ISS)的結(jié)合，來增強或減弱對其附近3或5弱剪接位點的識別和利用[7]。Wang等[8]使用ESE finder的軟件(web一based)，對人類SR蛋白可識別的細(xì)胞中存在著的ESE序列進行篩選和評分，這些蛋白質(zhì)包括SF2/ASF、SRP40、SRP55和SC35;進一步證實了與ESE序列相關(guān)的SR蛋白，在外顯子的定位過程以及組成性剪接和選擇性剪接過程中的重要作用。另一方面，人類的很多疾病都與SR蛋白非正常結(jié)合剪接位點有關(guān)。Stickeler等[9]對腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤形成之前，不同組織細(xì)胞中SR蛋白的表達類型各不相同，一般只表達1個家族中的1個亞型;隨著腫瘤的發(fā)展，SR蛋白表達類型逐漸增多而各不相同。以至最后，惡性腫瘤中SR蛋白的表達類型變得十分復(fù)雜。另外，Li等[10]發(fā)現(xiàn)SR蛋白SF2/ASF在維持基因組的穩(wěn)定方面也起作用。

4.2 hnRNP形成因子

多聚嘧啶區(qū)域結(jié)合蛋白(PTB)是一種分子量為58kD的可以與RNA結(jié)合的新型核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNp)形成因子，它參與各種與RNA代謝相關(guān)的過程，也包括RNA的剪接。PTB能與U2AF競爭結(jié)合多聚嘧啶區(qū)域，對3剪接位點起調(diào)控作用。PTB也能抑制5剪接位點，并且可能通過包裹外顯子使其不被剪接體結(jié)合而使外顯子被跳過。

hnR N P A1也是一類hnRNP形成因子，有人對其進行晶體結(jié)構(gòu)分析表明，它有兩個獨立折疊的與RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，兩者之間有一個連接體。兩個RNA結(jié)合域(RNA binding domain，RBD)對于U1部分區(qū)域具有很高的同源性，這可以解釋兩者之間的對于剪接位點結(jié)合的競爭關(guān)系。而在空間位置上，兩個RBD呈反平行排列且彼此靠近，構(gòu)成RNA結(jié)合平臺，依靠兩對Arg一AsP離子鍵來實現(xiàn)結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定。這種反平行RNA結(jié)合平臺的存在，使得RNA能夠形成濃縮狀態(tài)結(jié)合并集聚于平臺上，從而有利于RNA分子的剪接和運輸[10]。

4.3 RNA解旋酶類剪接因子

在酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一類需要水解特定的核苷三磷酸進而發(fā)揮其功能的剪接因子。其中的代表是特定氨基酸位點是天冬氨酸一谷氨酸一隨機氨基酸一組氨酸/天冬氨酸基序的核苷三磷酸酶(Asp一Glu一x一His/Asp box NTPase，DExH/D一box NTPase)。這類蛋白質(zhì)因子具有“解旋酶”的結(jié)構(gòu)域，有類似于核酸蛋白酶(RNPases)的功能，且極為保守。屬DExH/D一box NTPases蛋白家族的成員有Prps、Prp2、Prpl6、Prp22和Prp43等。

通過實驗，人們發(fā)現(xiàn)Ppr5對于剪接復(fù)合體的聚合至關(guān)重要，Prp2催化復(fù)合體構(gòu)象的改變以順應(yīng)第一步的RNA酯交換反應(yīng)，Prpl6p參與第二步的RNA酯交換反應(yīng)，Prp22p在mRNA的釋放過程中發(fā)揮作用，而內(nèi)含子的釋放與Prp43的參與有關(guān)。另外，Prp28和Brr2是U5snRNP中的兩個DExH/D一box ATPase，它們在U1和U4snRNP從剪接復(fù)合體中釋放過程中起作用[11]。對于剪接復(fù)合體來說，在完成一輪的剪接反應(yīng)后解聚是很有必要的，因為這對于參與剪接的蛋白質(zhì)因子的重新利用而促進下一輪的剪接反應(yīng)很重要。

在剪接催化過程中，U5snRNP扮演了重要角色，而Snull4和Prp8似乎是組成了U5snRNP的核心。其中，Snull4和核糖體轉(zhuǎn)運酶(translocase)EF一G有很高的同源性，Small等[12]發(fā)現(xiàn)，Snull4催化GTP水解然后引發(fā)剪接復(fù)合體激活和解聚。

另外，人們發(fā)現(xiàn)一種蛋白復(fù)合體Ppr19，又稱NTC(NineTeen complex)，在剪接過程中加到原先的剪接復(fù)合體上[13]。對于U1或者U4的解離，NTC并非必需，但是它們可在U4的解離后在剪接復(fù)合體上穩(wěn)定U5和U6，使得U5和U6與mRNA前體形成一種高度易于催化反應(yīng)的狀態(tài)。這表明，NTC在調(diào)節(jié)復(fù)合體結(jié)構(gòu)改變過程中起著關(guān)鍵作用。利用基因工程的方法，目前已鑒定出8種蛋白質(zhì)因子參與了NTC的組成。這些蛋白質(zhì)因子是在U4脫離剪接復(fù)合體后一起加到復(fù)合體上去的，提示這些蛋白質(zhì)可能以整體的一個復(fù)合體的形式發(fā)揮功能。

5釀酒酵母和擬南芥的剪接順式作用元件保守序列的比較（14）：

上圖中A表示5剪接位點，B表示分支位點，C表示3剪接位點。每個字母的高低對應(yīng)著堿基在相應(yīng)位置出現(xiàn)的頻率。比較酵母和擬南芥5剪接位點和分支位點，不難發(fā)現(xiàn)擬南芥相對酵母堿基出現(xiàn)的頻率沒酵母的高，相對來說剪切位點堿基保守性不高。所以從序列保守性來看，5剪接位點和分支位點是擬南芥植物基因在酵母中表達比較重要順式作用元件。

6展望與結(jié)語

在多數(shù)情況下，真核mRNA內(nèi)含子的存在可以提高基因的表達水平，因為其剪接過程會影響mRNA新陳代謝的多個階段，包括轉(zhuǎn)錄、RNA編輯、pre-mRNA的加工、mRNA的出核運輸、翻譯和無義衰變等。真核mRNA內(nèi)含子在真核生物基因表達調(diào)控中起著重要的作用，是轉(zhuǎn)基因研究中提高外源基因表達的重要元件之一。

植物內(nèi)含子序列在3剪接位點前沒有聚嘧啶序列（polypyrimidine tract），也沒有保守的分支位點序列和酵母比較。然而，植物內(nèi)含子富含AU 序列在3剪接位點前。AU-rich 序列在酵母中可能和在植物中的作用相似，能幫助剪接因子識別其他的順式作用元件例如剪接位點。植物內(nèi)含子在酵母中表達的過程中可能會出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始位點提前和隱藏剪接位點等復(fù)雜的問題。

植物基因在酵母中的表達具有重要的意義，可應(yīng)用于工程菌，對跨物種基因表達也具有重要的作用。

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