李亞玲 趙玉潔 謝風(fēng)行 周 可 張峰峰

摘要:對(duì)一株產(chǎn)堿性蛋白酶假絲酵母菌(Candida sp.N9211)的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,研究各種碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響,應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成。結(jié)果表明:最佳培養(yǎng)基組成為酵母膏20 g/L,蛋白胨15 g/L,干酪素20 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L。優(yōu)化后蛋白酶活性提高了27倍(由1.55 U/mL提高到41.85 U/mL)。搖瓶培養(yǎng)的最佳條件為:初始pH值10.0,接種量1%,發(fā)酵溫度35 ℃,最佳培養(yǎng)時(shí)間為15 h。

關(guān)鍵詞:堿性蛋白酶;酵母菌;產(chǎn)酶條件

中圖分類(lèi)號(hào): Q93;TQ925文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B 文章編號(hào):1006-6500(2009)01-0005-05

Optimization of Medium and Cultivation Conditions for Alkaline Protease Production by Candida sp.N9211

LI Ya-ling, ZHAO Yu-jie, XIE Feng-xing, ZHOU Ke, ZHANG Feng-feng

(Tianjin Reararch Center of Agriculture Biotechnology, Tianjin 300192, China)

Abstract:The culture of Candida sp.N9211 were optimized for the production of alkaline protease. The optimum medium (per liter) wasconsisted of 20 g yeast extract, 15 g peptone, 20 g casein, 0.01 g FeSO4. After optimization of the culture medium, the enzyme production in shake flasks was enhanced from 1.55 U/mL to 41.85 U/mL. The optimum fermentation conditions were determined as follows: initial pH 10.0, inoculation size 1%, temperature 35 ℃, and cultivation time 15 h.

Key words: alkaline protease; yeast; fermentation conditions

堿性蛋白酶是一類(lèi)適宜于在堿性條件下(pH9～10左右)水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類(lèi),是非常重要的工業(yè)用酶[1]。在我國(guó),利用嗜堿性微生物生產(chǎn)堿性蛋白酶的研究還處于起步階段。目前,蛋白酶主要來(lái)源于芽孢桿菌屬[2,3]。生產(chǎn)菌株的單一性不但不能滿(mǎn)足制革、絲綢、日化工業(yè)對(duì)多種酶類(lèi)生產(chǎn)的需求[4],而且芽孢桿菌在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的芽孢往往影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量[5]。另外,目前能專(zhuān)一識(shí)別特定氨基酸序列的蛋白酶還很少,從微生物中進(jìn)行廣泛篩選應(yīng)該是尋找這類(lèi)蛋白酶的途徑之一[6]。因此,打破現(xiàn)有產(chǎn)酶菌種的局限性,積極開(kāi)發(fā)新菌種勢(shì)在必行。劉文斌[5]從黃石土壤中分離到一株毛狀假單胞菌,酶活力為45.0 U/mL。梅承芳等[7]從堿湖中分離出一株產(chǎn)蛋白酶的弧菌,產(chǎn)酶能力為3 268 U/mL。池振明等[8]從海洋中分離出一株酵母菌,經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化后產(chǎn)蛋白酶能力為7.2 U/mL。王躍軍[9]、李樹(shù)軍等[10]也先后發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)蛋白酶的非芽孢桿菌菌株。這些研究都拓寬了我國(guó)產(chǎn)堿性蛋白酶的菌種資源,豐富了蛋白酶的種類(lèi)。

目前,關(guān)于產(chǎn)堿性蛋白酶的酵母菌的報(bào)道甚少,本課題組在天津鹽堿沼澤中篩選出一株酵母菌株(Candida sp.N9211),具有較高的產(chǎn)蛋白酶能力。本研究在此基礎(chǔ)上以酵母菌株N9211為出發(fā)菌株,通過(guò)蛋白酶活性的變化對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,使其產(chǎn)蛋白酶的能力提高了27倍,為有關(guān)酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)研究及發(fā)酵工程菌構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌 種

酵母菌株Candida sp.N9211為本研究所篩選保藏菌種。

1.2 試 劑

干酪素、L-酪氨酸、三氯乙酸、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、濃鹽酸、濃溴水等各種化學(xué)式劑均為分析純,購(gòu)自天津科威試劑公司。

1.3培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:YPD培養(yǎng)基,成分為2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母浸膏。

發(fā)酵培養(yǎng)基:根據(jù)需要,由種子培養(yǎng)基添加一定量的不同碳源或氮源物質(zhì)及無(wú)機(jī)鹽組成。

1.4培養(yǎng)方法

將保存的酵母菌種N9211接到種子培養(yǎng)基中,于30 ℃、180 r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期的培養(yǎng)物作為種子液,以1%的接種量轉(zhuǎn)接入100 mL/250 mL的三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中,根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案改變培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵條件試驗(yàn)。

1.5 酶液制備

取酵母培養(yǎng)液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min,所得上清液用甘氨酸—?dú)溲趸c緩沖液(0.05 mol/L,pH9.0)進(jìn)行適當(dāng)稀釋后得粗酶液。

1.6 分析方法

1.6.1 酶活的測(cè)定[11]在1 mL粗酶液中加入1 mL用甘氨酸—?dú)溲趸c緩沖液(0.05 mol/L,pH 9.0)配制的2%的酪蛋白溶液,40 ℃精確反應(yīng)10 min后迅速加入2 mL10%的TCA溶液(三氯乙酸)終止反應(yīng)。4 ℃、10 000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,加入Folin酚試劑顯色后于650 nm下測(cè)OD值。規(guī)定用1 mL酶液在40 ℃下水解1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的酪蛋白10 min,以每分鐘釋放1 μg酪氨酸的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.6.2 生物量測(cè)定取10 mL發(fā)酵液,離心分離菌體,用蒸餾水洗滌3次后收集菌體,80 ℃烘干至恒質(zhì)量,即為發(fā)酵液中的生物量,以g/L計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別以濃度為20 g/L的蔗糖、甘油、乳糖、可溶性淀粉和檸檬酸代替YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖,以不加葡萄糖的YPD培養(yǎng)基作對(duì)照,滅菌后按1%的接種量將酵母菌種子液接入各培養(yǎng)基中,30 ℃,180 r/min進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。培養(yǎng)液離心后Folin酚法測(cè)定酶活,考察不同碳源對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,去掉YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖時(shí)菌體產(chǎn)酶水平顯著提高,達(dá)到11.24 U/mL,比加葡萄糖的YPD培養(yǎng)基的1.55 U/mL提高了7.25倍。蔗糖、檸檬酸等其它糖類(lèi)和有機(jī)酸作為碳源時(shí)酶活也比無(wú)糖培養(yǎng)基低,這說(shuō)明糖類(lèi)和有機(jī)酸對(duì)酵母菌產(chǎn)蛋白酶具有抑制作用,分析可能是一種分解代謝物阻遏現(xiàn)象。酵母膏和蛋白胨都是復(fù)雜的有機(jī)物,既可以提供氮源又可以提供碳源,因此,本試驗(yàn)選用酵母膏和蛋白胨作為酵母菌的碳源物質(zhì)。

2.2 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

氮源對(duì)酵母菌產(chǎn)蛋白酶的影響較大,解除了YPD培養(yǎng)基中葡萄糖的抑制作用,剩余的酵母膏和蛋白胨成分為酵母菌提供碳源的同時(shí)也提供了豐富的氮源。在酵母膏—蛋白胨培養(yǎng)基中分別添加20 g/L的檸檬酸銨、干酪素、硝酸鉀、硝酸鈉、尿素等各種氮源。結(jié)果如圖2所示,添加干酪素的培養(yǎng)基中蛋白酶活性達(dá)到12.83 U/mL,比對(duì)照的11.67 U/mL提高了10%,干酪素對(duì)蛋白酶具有誘導(dǎo)產(chǎn)生的能力。硝酸鉀、硝酸鈉等無(wú)機(jī)氮源的產(chǎn)酶效果次之。對(duì)這幾種氮源做方差分析,并進(jìn)行多重比較,干酪素與其它幾種氮源相比,有顯著性差異,因此選用干酪素作為添加氮源。

2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

堿性蛋白酶需要有金屬離子的激活,必需的金屬離子有Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等[12]。本試驗(yàn)在含有10 g酵母膏、20 g蛋白胨和10 g干酪素的培養(yǎng)基中分別加入0.01 g/L的硫酸鋅、硫酸亞鐵、三氯化鐵和0.1 g/L的氯化鈣、硫酸鎂、氯化鉀等無(wú)機(jī)鹽成分,結(jié)果如圖3。硫酸鋅和硫酸亞鐵對(duì)菌體產(chǎn)酶有促進(jìn)作用。對(duì)這幾種無(wú)機(jī)鹽做方差分析可知,在培養(yǎng)基中加入硫酸亞鐵對(duì)酶活影響較大,與其它幾種無(wú)機(jī)鹽相比有顯著性差異;硫酸鋅其次,氯化鈣、三氯化鐵和硫酸鎂3種無(wú)機(jī)鹽沒(méi)有顯著性差異,而氯化鉀對(duì)菌體產(chǎn)酶表現(xiàn)出抑制作用。添加硫酸亞鐵后蛋白酶活性由14.24 U/mL提高到28.91 U/mL,可見(jiàn)硫酸亞鐵對(duì)酵母菌產(chǎn)蛋白酶具有顯著影響。

2.4 培養(yǎng)基正交試驗(yàn)

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果,選擇酵母膏、蛋白胨、干酪素和硫酸亞鐵作為發(fā)酵培養(yǎng)基組成。為了研究培養(yǎng)基各成分對(duì)產(chǎn)酶的影響,設(shè)計(jì)了一個(gè)4因素3水平的正交表進(jìn)行試驗(yàn),正交試驗(yàn)結(jié)果與分析詳見(jiàn)表1和圖4。從表1可知,本試驗(yàn)所設(shè)的4個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酶的影響順序?yàn)?酵母膏(A)>蛋白胨(B)>FeSO4(D)>干酪素(C),說(shuō)明酵母膏是影響產(chǎn)酶的主要因素,其次是蛋白胨、硫酸亞鐵,干酪素影響最小。同時(shí)可知,以A因素的水平3,B因素的水平2,C因素的水平3和D因素的水平1的組合酶活性最高,即認(rèn)為A3B2C3D1為最佳配比。由此得到發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方為:酵母膏20 g/L,蛋白胨15 g/L,干酪素20 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L。

2.5 不同溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖5可知,20～30 ℃之間,隨著溫度的升高細(xì)胞代謝速度加快,菌體的酶活也隨著提高,30～35 ℃時(shí)酶活達(dá)到最大值,而后隨著溫度的升高,酶活又迅速降低。

2.6 不同pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

pH值是影響細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)很重要的因素,不同的嗜堿微生物的嗜堿能力不同,在不同的初始pH值下的生長(zhǎng)繁殖能力和產(chǎn)堿性蛋白酶的能力都存在著一定的差異。將發(fā)酵液培養(yǎng)基調(diào)整至不同的pH值,對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖6所示,菌株N9211產(chǎn)蛋白酶的pH范圍較寬,在pH6～12條件下酶活均在20 U/mL以上,在初始pH值為10時(shí)酶活力最高,達(dá)40.70 U/mL,這符合堿性蛋白酶菌株對(duì)堿性生長(zhǎng)環(huán)境的需求。

2.7 菌株N9211代謝曲線(xiàn)的測(cè)定

菌株N9211代謝曲線(xiàn)的測(cè)定將有利于確定最佳發(fā)酵時(shí)間、pH值、產(chǎn)酶與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系,以及今后的發(fā)酵培養(yǎng)等等。在溫度35 ℃、初始pH值10.0、接種量1%、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下,于接種后第3,6,9,12,15,18,21,24,27,30 h取發(fā)酵液,測(cè)定酶活、生物量和pH值,考察不同發(fā)酵時(shí)間下菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)酶的關(guān)系。由圖7中pH值的變化可以看出,酵母菌N9211對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境中的pH值有一定的調(diào)節(jié)能力,基本趨勢(shì)是體系pH值先降后升,后期穩(wěn)定保持pH值8～9左右。嗜堿菌一般具有一個(gè)比外部環(huán)境低的細(xì)胞質(zhì)pH值,盡管外部pH值較高,但細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)pH值仍可維持在8.0左右。但關(guān)于酵母菌pH調(diào)節(jié)能力這方面的報(bào)道還較少,相關(guān)的機(jī)理也不是很清楚。可能在菌體生長(zhǎng)繁殖期和產(chǎn)酶期對(duì)體系pH值具有不同的需要,導(dǎo)致了其自身的pH調(diào)節(jié)機(jī)制。圖7表明,0～20 h酵母菌體大量生長(zhǎng),酶活也逐漸提高,15 h酶活達(dá)最大值,20 h以后酵母生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期,酶的合成隨著減弱。菌體生長(zhǎng)與酶活變化并不完全同步,該酶生物合成類(lèi)型屬于半藕聯(lián)合成型。從產(chǎn)酶過(guò)程可見(jiàn),其培養(yǎng)較合適的時(shí)間為15 h。優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件成效較顯著,優(yōu)化后的發(fā)酵液中酶活比未優(yōu)化前有了顯著提高,由1.55 U/mL提高到41.85 U/mL。

3 結(jié) 論

以酶活性為考察指標(biāo),對(duì)酵母菌(Candida sp.N9211)產(chǎn)堿性蛋白酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到的最佳培養(yǎng)基組成為:酵母膏20 g/L、蛋白胨15 g/L、干酪素20 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L。搖瓶培養(yǎng)的最佳條件為:初始pH值10.0,接種量1%,發(fā)酵溫度35 ℃,最佳培養(yǎng)時(shí)間為15 h。優(yōu)化后蛋白酶活性由1.55 U/mL提高到41.85 U/mL,提高了27倍。本菌株不但拓寬了我國(guó)產(chǎn)酶的菌種資源,也豐富了蛋白酶的種類(lèi)。菌株N9211的產(chǎn)酶能力高于池振明從海洋中分離的布魯氏酵母[8],今后通過(guò)基因工程方法對(duì)其加以改造將有望進(jìn)一步提高蛋白酶活力,為功能性酵母菌的開(kāi)發(fā)和在食品、醫(yī)藥、飼料、環(huán)保等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1] 肖懷秋,林親錄,李玉珍,等. 微生物堿性蛋白酶研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2005(5):60-63.

[2] 方海紅,胡好遠(yuǎn),黃紅英,等. 微生物堿性蛋白酶的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2002,29(2):57-59.

[3] 伍欣,張曉昱,武龍. 產(chǎn)堿性蛋白酶嗜堿芽孢桿菌的篩選及其研究[J]. 微生物學(xué)雜志, 2005,25(2):40-44.

[4] 陳靜,王淑軍,黃煒,等. 產(chǎn)低溫堿性蛋白酶海洋嗜冷菌SY的篩選[J]. 微生物學(xué)雜志, 2005,25(4):38-42.

[5] 劉文斌,黃紅,吳燕. 一株產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的分離與鑒定[J]. 湖北大學(xué)學(xué)報(bào), 1999,21(2):168-170.

[6] 高卜渝,陳孝康,徐波,等. 產(chǎn)分泌蛋白酶酵母菌株的篩選[J]. 復(fù)旦學(xué)報(bào),1999,38(5):537-539.

[7] 梅承芳,江曉路,牟海津,等. 堿湖高產(chǎn)堿性蛋白酶菌的選育和產(chǎn)酶條件研究[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2005,35(4):613-617.

[8] Chi Z, Ma C, Wang P, et al. Optimization of medium and cultivation conditions for alkaline protease production by the marine yeast aureobasidium pullulans[J]. Bioresource technology, 2007, 98: 534-538.

[9] 王躍軍,孫謐,洪義國(guó),等. 黃海黃桿菌YS-9412-130低溫堿性蛋白酶的制備工藝研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究,2001,22(2):11-20.

[10] 李樹(shù)文,陸秀華,尚海利. 堿性蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選[J]. 萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,23(1):70-72.

[11] Ma Chunling, Ni Xiumei, Chi Zhenming, et al. Purification and characterization of an alkaline protease from the marine aureobasidium pullulans for bioactive peptide production from different sources[J]. Marine biotechnology, 2007(9): 343-351.

[12] 包巨南,蘭立新,肖懷秋. 微生物源蛋白酶研究進(jìn)展[J]. 釀酒,2007,34(3):50-52.