張維，姚璐，張世湘，羅云波，郝彥玲

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

乳酸菌啟動子探針載體的構(gòu)建及其功能驗證

張維，姚璐，張世湘，羅云波，郝彥玲

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

以β-葡萄糖醛酸酶基因gusA作為報告基因，在乳酸菌表達載體pMG36e基礎(chǔ)上，利用平滑化技術(shù)刪除表達載體自帶啟動子P32，構(gòu)建了乳酸菌啟動子探針載體pMGPP。將已知的嗜酸乳桿菌S-layer蛋白基因啟動子slpA插入到pMGPP無啟動子的gusA基因上游驗證其功能，GUS染色結(jié)果表明：pMGPP在大腸桿菌KW1和植物乳桿菌WQ0815中皆具有啟動子探針載體的功能。因此，具有自主知識產(chǎn)權(quán)的啟動子探針載體pMGPP的構(gòu)建不僅為篩選乳酸菌啟動子提供了有效的工具，同時為高效乳酸菌表達載體的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

乳酸菌，啟動子探針載體，報告基因gusA，功能驗證

0 引 言

乳酸菌是一類廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料領(lǐng)域的重要工業(yè)微生物[1]，隨著基因工程技術(shù)發(fā)展，改良乳酸菌發(fā)酵性能和益生性能工程菌株構(gòu)建已取得了可喜進展[2]。高效穩(wěn)定的表達載體是乳酸菌工程菌株獲得的基礎(chǔ)，而啟動子是決定外源基因表達效率的關(guān)鍵遺傳元件。

目前報道的乳酸菌啟動子篩選方法主要為通過已知基因推測其啟動子、構(gòu)建基因組文庫和人工啟動子文庫,但無論哪種方法皆依賴于啟動子探針載體來驗證啟動子的功能[3-5]。所謂啟動子探針載體是指攜帶報告基因、抗性標記和轉(zhuǎn)錄終止子，但無啟動子的克隆載體。因此，將一段已知的核苷酸序列插入報告基因上游時，可通過檢測報告基因的表達情況判斷插入序列是否具有啟動子活性及啟動子強度。因此，啟動子探針載體的構(gòu)建為篩選高效啟動子奠定了基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 材料

（1）菌株和質(zhì)粒：gusA缺陷型大腸桿菌菌株KW1，大腸桿菌 （Escherichia coli）DH5α感受態(tài)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）WQ0815和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophillus）05-17為本室保存。攜帶gus基因的植物表達載體pBI121和乳酸菌表達載體pMG36e均為本室保存。

（2）試劑：限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，高保真ExTaq DNA聚合酶，Klenow Fragment； 溶菌酶，5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷（X-Gluc），紅霉素，常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

（3）引物合成：引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及用途如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 pMGPP的構(gòu)建

（1）攜帶報告基因gusA的乳酸菌表達載體的構(gòu)建。以植物表達載體pBI121為模板，利用引物gus-F和gus-R擴增gusA基因，采用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切回收的gusA基因和乳酸菌表達載體pMG36e，將酶切后gusA基因和載體在T4 DNA連接酶作用下進行連接，將得到的攜帶報告基因gus的重組質(zhì)粒命名為pMG36eGUS。

表1 引物序列及用途

（2）利用平滑化技術(shù)制備乳酸菌探針載體。利用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pMG36eGUS，目的是刪除表達載體自帶的啟動子P32，回收的大片段用Klenow Fragment進行平滑化形成鈍端，進一步用T4 DNA連接酶連接，篩選得到的重組質(zhì)粒即為啟動子探針載體，命名為pMGPP。乳酸菌啟動子探針載體構(gòu)建策略如圖1所示。

1.2.2 在大腸桿菌中的功能驗證

以嗜酸乳桿菌05-17基因組為模板，利用引物slp-E和slp-B擴增嗜酸乳桿菌S-layer蛋白基因slpA啟動子，采用EcoRⅠ和BamHⅠ分別酶切slpA和pMGPP，將回收后的載體和slpA進行連接，獲得重組質(zhì)粒pMGGS。采用熱激轉(zhuǎn)化的方法將pMGPP（陰性對照）和pMGGS轉(zhuǎn)入大腸桿菌KW1。利用X-Gluc檢測液對陽性克隆gusA基因表達的情況進行鑒定，驗證啟動子探針載體在大腸桿菌中的功能。

1.2.3 在植物乳桿菌中的功能驗證

植物乳桿菌感受態(tài)細胞的制備按Aukrust的方法稍作修改。過夜培養(yǎng)的菌體接種到濃度為0.3 mol/L蔗糖和質(zhì)量分數(shù)為1.0%甘氨酸的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值達0.40～0.60；離心收集的菌體用預(yù)冷的漂洗液（濃度為0.3 mol/L蔗糖，0.1 mol/L的MgCl2）洗滌兩次，并用200 μL預(yù)冷的電擊緩沖液（30%PEG-1500）重懸；將40 μL感受態(tài)細胞和0.5 μg純化的質(zhì)?；旌喜⑥D(zhuǎn)移到預(yù)冷的2 mm電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)參數(shù)為1.5 kV，400 Ω，25 μF；電擊后立即加入1 mL復(fù)蘇液（含有濃度為0.3 mol/L蔗糖和0.1 mol/L的MgCl2的MRS培養(yǎng)基），于37°C培養(yǎng)2 h。復(fù)蘇后的轉(zhuǎn)化子在質(zhì)量濃度為5 mg/L紅霉素的MRS固體培養(yǎng)基上進行篩選。利用GUS染色陽性克隆考察啟動子探針載體在植物乳桿菌中的功能。

2 結(jié)果和分析

2.1 表達載體pMG36eGUS的構(gòu)建

以質(zhì)粒pBI121為模板進行PCR擴增，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見一條約2.0 kb的擴增條帶，與預(yù)期大小相符，經(jīng)序列分析結(jié)果表明其與大腸桿菌gusA的同源性達100%。將XbaⅠ和HindⅢ雙酶切回收的gusA基因和pMG36e載體進行連接，重組質(zhì)粒pMG36eGUS經(jīng)酶切鑒定獲得預(yù)期大小2 kb的目的片段，證明該攜帶報告基因的乳酸菌表達載體構(gòu)建成功（圖2）。

圖2中，M為DNA分子量標準DL15000；1為基因gusA的PCR產(chǎn)物；2為載體pMG36e雙酶切/XbaⅠ和HindⅢ；3為重組質(zhì)粒pMG36eGUS雙酶切/XbaⅠ和HindⅢ。

2.2 制備乳酸菌啟動子探針載體pMGPP

利用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pMG36eGUS，回收的大片段用Klenow Fragment進行平滑化形成鈍端，進一步用T4 DNA連接酶連接，篩選得到的重組質(zhì)粒即為啟動子探針載體pMGPP。以probe-R為引物對pMGPP進行測序鑒定，序列比對結(jié)果如圖3所示，由圖3可以看出：pMGPP經(jīng)測序后和pMG36eGUS比對證明質(zhì)粒上原有的啟動子P32被刪除，啟動子探針載體pMGPP構(gòu)建成功。圖3中，黑色標注為相同序列，灰色為P32啟動子序列。

2.3 攜帶嗜酸乳桿菌啟動子slpA重組質(zhì)粒pMGGS的構(gòu)建

利用PCR技術(shù)從嗜酸乳桿菌05-17基因組中擴增S-layer蛋白基因slpA啟動子，瓊脂糖凝膠電泳檢測可見約300 bp片段，與預(yù)期大小相符，測序結(jié)果與Gen-Bank發(fā)表序列的同源性為97%。分析結(jié)果表明該序列具有啟動子保守的-10區(qū)（TAAAAT）和-35區(qū)（TTGCTA）以及核糖體結(jié)合位點SD序列。進一步將slpA啟動子序列插入啟動子探針載體pMGPP的EcoRⅠ和BamHⅠ位點，采用PCR方法鑒定重組子，由圖4中可見，攜帶嗜酸乳桿菌啟動子slpA重組質(zhì)粒pMGGS的構(gòu)建正確。

圖4中，M為DNA分子量標準DL2000；1為slpA啟動子擴增產(chǎn)物；2為陰性對照 （水為模板）；3為以pMG36eGUS為模板slpA擴增產(chǎn)物；4為以pMGGS為模板slpA擴增產(chǎn)物。

2.4 載體pMGPP的功能驗證

啟動子探針載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌和植物乳桿菌，將攜帶pMGGS和pMGPP的大腸桿菌KW1和植物乳桿菌WQ0815離心后，菌體進行GUS染色，實驗結(jié)果如圖5和圖6所示，由圖中可以看出，僅攜帶pMGGS載體的大腸桿菌和植物乳桿菌染色后呈藍色。染色的結(jié)果表明載體pMGPP在大腸桿菌和植物乳桿菌中具有啟動子探針載體的功能。

3 討 論

目前基因工程領(lǐng)域應(yīng)用的報告基因主要有cat（氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因）、lacZ（β-半乳糖苷酶基因）、lux（熒光素酶基因）和gusA（β-葡萄糖醛酸酶基因）等。其中cat基因和lux的表達產(chǎn)物分析成本較高，而在乳酸菌中l(wèi)acZ的背景表達量比較高，對啟動子活性分析造成一定的干擾。gusA基因編碼的β-葡萄糖醛酸酶是一種酸水解酶，能水解多種β-葡萄糖醛酸衍生物，多數(shù)β-葡萄糖醛酸酶的底物是可溶性的，而且目前都已經(jīng)實現(xiàn)了商業(yè)化，不同的底物可以用于分光光度法、熒光光度法、組織化學(xué)法等不同的方法分析gusA的表達情況，而且乳酸菌在可檢測的范圍之內(nèi)都沒有檢測到β-葡萄糖醛酸酶活性[6，7]。 因此，本研究中選gusA基因作為篩選乳酸菌啟動子的報告基因。

本文構(gòu)建的啟動子探針載體pMGPP中無啟動子報告基因gusA上游有一個BamHⅠ（G↓GATCC）的單酶切位點，由于限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Sau3AⅠ是同尾酶，而Sau3AⅠ是識別4個堿基（↓GATC）的內(nèi)切酶。因此，可以利用Sau3AⅠ酶切基因組，將酶切產(chǎn)物連接到pMGPP的BamHⅠ酶切位點，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化gusA缺陷的大腸桿菌KW1的突變體，通過GUS染色篩選攜帶乳酸菌啟動子的陽性克隆，從而為利用基因組文庫法篩選高效乳酸菌啟動子提供強有力的工具。此外，由于乳酸菌電轉(zhuǎn)化效率低于大腸桿菌，因此在大腸桿菌中構(gòu)建乳酸菌基因組文庫將能夠提高文庫的容量，更有利于篩選乳酸菌的啟動子，然后將定位的啟動子序列再轉(zhuǎn)化到乳酸菌中進行活性的分析。

此外，攜帶強啟動子的pMGGS表達載體轉(zhuǎn)化植物乳桿菌WQ0815后染色較淺，染色結(jié)果與gus操縱子上gusB基因突變的大腸桿菌菌株K-12的染色現(xiàn)象一致[8]。因此，推測可能由于植物乳桿菌WQ0815缺失gusB基因而不能將細胞外的底物x-gluc轉(zhuǎn)運富集到細胞內(nèi)，從而影響了誘導(dǎo)gusA基因的表達和水解反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致了染色速度慢而且顏色較淺[9]。因此，為了提高啟動子探針載體在乳酸菌中的有效性，可進一步嘗試將gusB基因構(gòu)建到該啟動子探針載體。

[1]LING D W，DONG X Z.Lactic Acid Bacteria Identification and Experiment Methods[M].Beijing：China Light Industry Press,1999.

[2]AN H,ZHOU H,HUANG Y,et al.High-Level Expression of Heme-Dependent Catalase Gene katA from Lactobacillus Sakei Protects Lactobacillus rhamnosus from Oxidative Stress[J].Molecular Biotechnology,2010,45（2）：155-60.

[3]BRON P A,HOFFER S M,VAN SWAM I I,et al.Selection and Characterization of Conditionally Active Promoters in Lactobacillus plantarum,Using Alanine Racemase as a Promoter Probe[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70（1）：310-317.

[4]RUD I,JENSEN P R,NATERSTAD K，AXELSSON L.A Synthetic Promoter Library for Constitutive Gene Expres-sion in Lactobacillus plantarum[J].Microbiology,2006,152（4）：1011-1019.

[5]MCCRACKEN A,TURNER M S,GIFFARD P,et al.Analysis of Promoter Sequences from Lactobacillus and Lactococcus and Their Activity in Several Lactobacillus species[J].Archives of Microbiology,2000,173（5）：383-389.

[6]JEFFERSON R A,BURGESS S M，HIRSH D.beta-Glucuronidase from Escherichia Coli as a Gene-Fusion Marker,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1986,83（22）：8447-8451.

[7]PLATTEEUW C,SIMONS G，DE VOS W M.Use of the Escherichia coli beta-Glucuronidase（GusA）Gene as a Reporter Gene for Analyzing Promoters in Lactic Acid Bacteria[J].Applied and Environmental Microbiology,1994,60（2）：587-593.

[8]WELSON K J,HUGHES S G，JEFFERSON R A.The Escherichia coli Gus Operon：Induction and Expression of the Gus Operon in E.coli and the Occurrence and Use of GUS in Other Bacteria[M].GUS Protocols.Using the GUS Gene as Reporter of Gene Expression,Acad.Press Inc.,San Diego,U.S.A.,1992：7-22.

[9]LIANG W,WILSON K J,XIE H,et al.The gusBC Genes of Escherichia coli Encode a Glucuronide Transport System[J].The Journal of Bacteriology,2005,187（7）：2377-2385.

Construction and identification of promoter-probe vector for Lactic acid bacteria

ZHANG Wei,YAO Lu,ZHANG Shi-xiang,LUO Yun-bo,HAO Yan-ling
（College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China）

β-glycuronidase gusA was used as the reporter gene,and based on lactic bacterial expression vector pMG36e,promoter-probe vector pMGPP was constructed by deleting its promoter P32 through smoothing technique.Then the reported strong promoter,Lactobacillus acidophilus S-layer protein promoter slpA,was inserted upstream of the promoterless gusA gene to verify the function of pMGPP,and the results of GUS dyeing indicated that the eligibility of pMGPP in both E.coli KW1 and Lactobacillus plantarum WQ0815.The construction of pMGPP with the independent intellectual property rights lays a foundation for screening promoter and constructing expression vector for Lactic acid bacteria.

Lactic acid bacteria；promoter-probe vector；reporter gene gusA；verification of function

Q939.11+7

A

1001-2230（2010）11-0004-03

2010-07-15

本研究由國家高技術(shù)研究與發(fā)展計劃（863）（2006AA10Z317和2007AA10Z354）資助。

張維（1987-），男，本科，研究方向為乳酸菌遺傳與代謝工程。

郝彥玲