羅紅霞，陳志剛，黃彥芳，王芳，李春平，趙鋼

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 食品與生物工程系，北京 102442；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

原生質(zhì)體融合技術(shù)選育弱后酸化乳酸菌菌株的研究

羅紅霞1，陳志剛2，黃彥芳1，王芳1，李春平1，趙鋼1

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院 食品與生物工程系，北京 102442；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

對(duì)新疆地方乳酸菌Lactobacillus bulgaricus LN1#進(jìn)行原生質(zhì)體融合，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)的方法得到L.bulgaricus LN1#的原生質(zhì)體制備條件：溶菌酶質(zhì)量濃度為15.00 g/L，酶解細(xì)胞壁的時(shí)間為60 min，酶解溫度為44℃。對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行滅活，致死率達(dá)到100%的條件：紫外線(xiàn)滅菌為120 s;高溫為53℃,60 min。應(yīng)用青霉素對(duì)融合子進(jìn)行篩選，最終得到37℃培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)乳酸量與出發(fā)菌株相同，10℃貯藏時(shí)，產(chǎn)乳酸量明顯減少的目標(biāo)菌株NO2#和NO3#。

乳酸桿菌；原生質(zhì)融合；弱后酸化

0 引 言

乳酸菌發(fā)酵制備而成的酸乳，由于具有改善胃腸道功能、提高免疫能力、改善機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況等特殊的生理功能而越來(lái)越受到消費(fèi)者的歡迎。但由于乳酸菌在正常發(fā)酵結(jié)束后，貯存、運(yùn)輸、銷(xiāo)售直至食用前這一過(guò)程菌體仍會(huì)生長(zhǎng)繁殖，使pH值繼續(xù)下降，出現(xiàn)消費(fèi)者不可接受的過(guò)酸味及感官質(zhì)量下降等后酸化現(xiàn)象[1]。因此，控制酸乳的后酸化，提高酸乳質(zhì)量、延長(zhǎng)保質(zhì)期是目前急需解決的問(wèn)題。

至今為止，誘變育種和細(xì)胞融合生物選育仍是世界各國(guó)行之有效的重要方法，以其在篩選優(yōu)良菌株應(yīng)用上的卓越成效而最受推崇。尤其發(fā)酵工業(yè)中的各種優(yōu)良高產(chǎn)菌株絕大部分都是以誘變育種和生物選育方法獲得的。誘變育種和細(xì)胞融合生物選育除了能提高產(chǎn)量外，還可達(dá)到改善產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝等目的。

本研究以新疆牧民自制酸奶疙瘩中篩選的乳酸菌為出發(fā)菌株，采用細(xì)胞原生質(zhì)融合技術(shù)對(duì)該乳酸菌菌株進(jìn)行選育，選育在高溫條件下產(chǎn)酸較強(qiáng)、低溫條件下產(chǎn)酸較弱的菌株；以此菌株作為發(fā)酵劑，發(fā)酵得到的酸奶與對(duì)照組比較，后酸化時(shí)間延長(zhǎng)了2-3 d。細(xì)胞原生質(zhì)融合技術(shù)對(duì)新疆地方乳酸菌菌株的選育研究尚屬首次，該實(shí)驗(yàn)參數(shù)和研究結(jié)果以期對(duì)未來(lái)新的乳酸菌菌株資源的開(kāi)發(fā)利用提供有效地參考價(jià)值。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器設(shè)備

乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricus，LN1#），由本試驗(yàn)室從新疆牧民自制酸奶中篩選、保藏，如圖1所示。

對(duì)照菌株：德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus，6032）標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，用作本試驗(yàn)對(duì)照菌株。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津2450）；酸度計(jì)（2003 Thermo Electron Corposition）； 離心機(jī) （Gppendorf-Centrifuge 5804R）；醫(yī)用潔凈工作臺(tái)；生化培養(yǎng)箱；恒溫培養(yǎng)箱。一次性針頭濾器（PALL）；數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器；倒置顯微鏡。

培養(yǎng)基與溶液：脫脂乳培養(yǎng)基；MRS培養(yǎng)基；pH值為7.0的磷酸緩沖液；生理鹽水；高滲緩沖液；原生質(zhì)體穩(wěn)定液（PB）；高滲再生培養(yǎng)基（固體/半固體）;溶菌酶。

1.2 方法

1.2.1 溶液配置

原生質(zhì)體穩(wěn)定液（PB）[2]：0.02M HEPES,pH值為7.0，添加濃度為1 mmol/L的MgCl2,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的明膠,濃度為0.3 mol/L棉籽糖或濃度為0.5 mol/L的乳糖。

溶菌酶溶液：用原生質(zhì)體穩(wěn)定液（PB）配制成一定質(zhì)量濃度的溶菌酶溶液，用一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌。

高滲再生培養(yǎng)基[3-4]：半固體固體MRS培養(yǎng)基（不含Tween80）中添加2.5%的明膠，濃度為20 mmol/L的MgCl2，濃度為0.5 mol/L的蔗糖，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%小牛血清。

聚乙二醇（PEG）6000：用原生質(zhì)體穩(wěn)定液（PB）配制成35%的溶液，115℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種活化

取菌種LN1#按質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，42℃恒溫培養(yǎng)12 h。多次傳代直至達(dá)到要求的活力。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

對(duì)菌種進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定其最適生長(zhǎng)溫度、最適接種量、最適初始pH值。于最佳條件下測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)[5]。

pH值-采用pH211型酸度計(jì)；酸奶酸度采用吉爾涅爾度表示[6]；乳酸菌活菌數(shù)-采用高層瓊脂法[7]；OD值的測(cè)量-采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，波長(zhǎng)600 nm。

1.2.4 原生質(zhì)體制備與再生

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液10 mL，離心（3 000 r/min）并以原生質(zhì)體穩(wěn)定液（PB）洗滌兩次，用原生質(zhì)體穩(wěn)定液（PB）稀釋?zhuān)D(zhuǎn)入10 cm培養(yǎng)皿中，加入一定質(zhì)量體積的溶菌酶溶液，處理一定時(shí)間，應(yīng)用裂解法和倒置顯微鏡觀(guān)察（圖2）法測(cè)定原生質(zhì)體形成率。

圖2 乳酸桿菌原生質(zhì)體（未染色L：10×40）

分別取4 mL熱力滅活和紫外先滅活的原生質(zhì)體混合，放置5 min后離心，重懸于8 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%的PEG6000溶液中。37℃水浴保溫2 min，離心，洗滌2次，重懸于8 mL原生質(zhì)體穩(wěn)定液中。取1 mL融合液稀釋后，取0.1 mL加入到半固體高滲再生培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入滅菌培養(yǎng)皿中置37℃下培養(yǎng)直到長(zhǎng)出菌落。

1.2.5 原生質(zhì)制備條件的確定

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表1（如表1），通過(guò)均勻?qū)嶒?yàn)確定來(lái)原生質(zhì)體制備的最佳條件。

表1 原生質(zhì)體制備條件均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)水平因素

1.2.6 原生質(zhì)體滅活

滅活原生質(zhì)體的機(jī)理是：紫外線(xiàn)使菌株的DNA發(fā)生突變,熱的作用可使細(xì)胞內(nèi)有功能蛋白、酶蛋白變性失活。

高溫滅活[8]：取上述制備兩菌株原生質(zhì)體混合液1/3于5 mL離心管中，置于53℃水浴中保溫，不同時(shí)間取50 μL均勻分散于半固體高滲再生培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，7 d后觀(guān)察結(jié)果。

紫外線(xiàn)滅活[9]：另取2/3上述原生質(zhì)體液于9.0 cm滅菌平板中，置15W紫外燈下，距離為30 cm并不時(shí)吸取50 μL均勻分散于半固體高滲再生培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，7 d后觀(guān)察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LN1#生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

由圖1可知，菌株在37℃，3%接種量，初始pH值為6.6的條件下培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一個(gè)較短的延遲期后，菌株即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，15 h時(shí)菌體濃度達(dá)到最高峰，之后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體OD值基本保持不變。

供誘變處理的細(xì)菌一般要求處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌體生長(zhǎng)狀態(tài)比較同步,容易變異,同時(shí)為了保證處理時(shí)具有一定的細(xì)胞濃度以增加可能變異的細(xì)胞總數(shù)，常選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的細(xì)胞進(jìn)行處理。因此，本研究選定誘變菌株培養(yǎng)時(shí)間為12 h。

2.2 原生質(zhì)制備最佳條件的選擇

根據(jù)實(shí)驗(yàn)水平，采用U8*（85）的均勻設(shè)計(jì)方案，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

圖3 供試菌株LN1#生長(zhǎng)曲線(xiàn)

表2 均勻設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Uniform Design Version 2.20軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析 （回歸分析采用后退法,顯著性水平α=0.05），得到原生質(zhì)體制備率與酶濃度、酶處理溫度、酶處理時(shí)間的多元一次回歸方程為

回歸方程顯著性變量分析如表3所示。

表3 回歸方程變量分析

分析各因素對(duì)回歸的貢獻(xiàn)率如表4所示。

表4 各因素對(duì)回歸的貢獻(xiàn)

方程偏回歸系數(shù)分別為B1=1.12,B2=0.280,B3=0.369，可見(jiàn)各因素對(duì)酶解率%的影響為：酶濃度＞酶處理時(shí)間＞酶處理溫度。

由回歸方程可知：X1，X2，X3的系數(shù)為正,表明試驗(yàn)指標(biāo)隨因素的增加而增加,所以,在確定優(yōu)化方案時(shí),各因素的取值應(yīng)偏上限,即酶質(zhì)量濃度取15.00 g/L,酶處理溫度取44℃;酶處理時(shí)間取60 min。將以上各值代入上述回歸方程,得到酶解率最大值為99.6%,這一結(jié)果好于表4中的9個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到結(jié)果與計(jì)算結(jié)果相接近。因此得到原生質(zhì)體制備最佳條件：酶質(zhì)量濃度取15.00 g/L；酶處理溫度取44℃；酶處理時(shí)間取60 min。

菌株條件致死標(biāo)記的選擇結(jié)果如表5和表6所示。

表5 UV對(duì)乳酸桿菌致死率的影響

表6 溫度對(duì)乳酸桿菌致死率的影響致死率

2.3 原生質(zhì)體融合效果

從原生質(zhì)半固體再生培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d后，將培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出的24個(gè)菌落用無(wú)菌牙簽挑出，分別接入接入MRS液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。用24株菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵6 h酸度測(cè)定結(jié)果

對(duì)發(fā)酵6 h酸度在75～85oT的8株菌株測(cè)定儲(chǔ)藏性能，篩選到2株儲(chǔ)藏性能好的菌株，目標(biāo)菌株儲(chǔ)藏性能如圖5所示。

圖56032 ，LN1#，N02#，N03#發(fā)酵乳10℃期間滴定酸度變化

酸奶的正常酸度為80.00oT，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)和銷(xiāo)售以及消費(fèi)者的接受程度，本研究以120.00oT作為后酸化的指標(biāo)值。

由圖5可以看出，發(fā)酵脫脂乳在10℃貯藏時(shí)，隨貯藏時(shí)間的增加滴定酸度值都逐漸升高。試驗(yàn)中菌株6032與LN1#到第5天時(shí)已經(jīng)發(fā)生后酸化（滴定酸度＞120oT），而菌株N02#與N03#在貯藏的第8天和第7天時(shí)發(fā)生后酸化。菌株N02#較LN1#的發(fā)酵脫脂乳在貯藏時(shí)間上延長(zhǎng)了3 d，菌株N03#較LN1#的發(fā)酵脫脂乳在貯藏時(shí)間上延長(zhǎng)了2 d。發(fā)酵結(jié)束后，由于發(fā)酵乳溫度由37℃未能立刻降到10℃，所以在儲(chǔ)藏第2 d時(shí)滴定酸度較儲(chǔ)藏初始時(shí)刻有較大升高，儲(chǔ)藏3 d后發(fā)酵乳溫度達(dá)到10℃，滴定酸度升高趨勢(shì)減慢，當(dāng)發(fā)酵乳發(fā)生后酸化后由于自身產(chǎn)酸抑制乳酸菌的增殖，所以滴定酸度增長(zhǎng)幅度較慢。

3 結(jié) 論

（1）對(duì)LN1#進(jìn)行原生質(zhì)融合，得到最佳參數(shù)：溶菌酶質(zhì)量濃度為15.00 g/L，酶解細(xì)胞壁的時(shí)間為60 min，酶解溫度為44℃。

（2）得到目標(biāo)菌株N02#與N03#，兩株菌在37℃培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)乳酸量與出發(fā)菌株一樣，而在10℃貯藏時(shí)，產(chǎn)乳酸量明顯減少。

（3）用N02#與N03#發(fā)酵酸奶，測(cè)定酸奶在儲(chǔ)藏期間的產(chǎn)酸量，結(jié)果表明，菌株N02#發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)生后酸化的時(shí)間較LN1#延長(zhǎng)了3 d，菌株N03#發(fā)酵脫脂乳較LN1#在貯藏時(shí)間上延長(zhǎng)了2 d,有效地控制了酸奶后酸化。

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Screening of the weak postacidification lactobacillus strains using protolast fusion technology

LUO Hong-xia1,CHEN Zhi-gang2,HUANG Yan-fang1,WANG Fang1,LI Chun-ping1,ZHAO Gang1
（1.Food&Bioengineering Department,Beijing Vocational College of Agriculture,Beijing 102442，China;
2.College of Food Science,Xinjiang Agriucltural Univisity,Urumqi 830052,China）

Protolast fusion technology was used in Lactobacillus bulgaricus LN1#from Xingjiang to obtain the weak postacidification strains.Optimum preparation condition for protolast of L.bulgaricus LN1#was achieved using uniform design experiment,being cytoderm was zymohydrolysed with lysozyme concentration of 15.00 mg/mL at 44℃for 60 min.The following 100%inactivation condition for protolast was attained with ultraviolet radiation for 120 s or high-temperature sterilizing at 53℃for 60 min.Penicillin was used to screen the weak postacidification strains.L.bulgaricus NO2#and NO3#were elected as target strain,which have the same lactic acid production capacity with LN1#at 37℃，but less lactic acid production than at LN1#10℃.

Lactobacillus;Protoplast fusion;weak postacidification.

Q93-335

A

1001-2230（2010）01-0008-04

2009-07-16

北京市教委科技支撐項(xiàng)目（KM200800005001）。

羅紅霞（1962-），女，教授，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)食品科學(xué)。