吳海歌,王艷預(yù),姚子昂

(大連大學(xué)生物工程學(xué)院遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點實驗室,遼寧大連 116622）

卡拉膠寡糖的制備及其生物活性的研究

吳海歌,王艷預(yù),姚子昂

(大連大學(xué)生物工程學(xué)院遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點實驗室,遼寧大連 116622）

對卡拉膠的降解條件、降解獲得的卡拉膠寡糖的理化性質(zhì)及其抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,60℃下用0.5%硫酸降解1%的卡拉膠,可以得到比較均勻、分子量大小不等的多種卡拉膠寡糖。用這種方法獲得的卡拉膠寡糖對結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1生長的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于相同濃度的卡拉膠,為拓寬卡拉膠的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

卡拉膠;卡拉膠寡糖;降解;生物活性

卡拉膠(Carrageenan）是從某些紅藻的細(xì)胞壁中提取的一種硫酸半乳聚糖,具有以1,3-β-D-半乳糖和1,42α-D-半乳糖交替連接形成的骨架結(jié)構(gòu),根據(jù)半乳糖中是否含有內(nèi)醚以及半乳糖上硫酸基的數(shù)量和連接位置不同 ,可分為κ2、μ2、ι2、θ2、λ2、ε2、ν2七種類型 ,常見的是κ2、ι2和λ2型[1]?？ɡz具有抗病毒、抗腫瘤、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)、降血脂等多種生理活性[2～5],但由于粘度大、擴(kuò)散困難,很難被機(jī)體吸收,嚴(yán)重限制了其在生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。研究表明,卡拉膠降解后,可提高其生物利用率并具有獨特的生理活性[6]。用稀無機(jī)酸作為催化劑進(jìn)行酸水解是目前最常用的卡拉膠降解方法,但用鹽酸等降解會導(dǎo)致硫酸多糖中硫酸基團(tuán)的脫落,而用硫酸降解可以減少對其結(jié)構(gòu)的破壞[7]。

作者在此采用硫酸降解卡拉膠,研究了卡拉膠酸性降解的條件、降解產(chǎn)物卡拉膠寡糖(CGOS）的理化性質(zhì)及其抗腫瘤活性。

1 實驗

1.1 材料與試劑

卡拉膠,江蘇常航膠體科技有限公司;結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1,中國典型生物保藏中心;四甲基偶氮唑藍(lán)(M TT）,Sigma公司;小牛血清,杭州四季青公司;RPM I21640培養(yǎng)液,Gibcobrl公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 卡拉膠的酸性降解

用硫酸對卡拉膠進(jìn)行降解,考察了硫酸濃度、降解溫度、卡拉膠濃度以及酸的強(qiáng)度對卡拉膠降解的影響。降解過程中每隔2 h取出降解樣品,用冷水浴冷卻至室溫,并將p H值調(diào)至中性。一部分樣品進(jìn)行薄層層析分析(展開劑為正丁醇∶冰醋酸∶水=2∶2∶ 1;顯色劑為苯胺-二苯胺）,另一部分樣品用DNS(3,52二硝基水楊酸）法測定其還原糖含量,并繪制卡拉膠降解時間-吸光度變化曲線。

1.2.2 卡拉膠寡糖的制備及純化

配制1%(質(zhì)量濃度,m/V,下同）卡拉膠溶液,用終濃度(質(zhì)量濃度,m/V,下同）為0.5%的硫酸在60℃恒溫水浴中攪拌水解4 h,然后用冷水浴冷卻至室溫,并調(diào)p H值至中性。將所得的卡拉膠寡糖溶液減壓濃縮后,裝入截留分子量500的透析袋中透析72 h(除去鹽等小分子物質(zhì)）,然后冷凍干燥,獲得純化的卡拉膠寡糖固體。

1.3 分析與測定

1.3.1 卡拉膠寡糖的理化性質(zhì)

卡拉膠寡糖的平均分子量用端基法[8]測定,粘度用數(shù)顯粘度計測定,硫酸根含量用明膠-氯化鋇法[9]測定。

1.3.2 卡拉膠寡糖對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響

采用M TT法檢測卡拉膠寡糖對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響[10,11]。將處于指數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1以2×106個·孔-1的密度接種于96孔板中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,分別加入終濃度為25μg·mL-1、50μg·m L-1、100μg ·mL-1、200μg·m L-1的卡拉膠和卡拉膠寡糖,每個濃度設(shè)4個復(fù)孔。將培養(yǎng)板放至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后加入M TT溶液,再培養(yǎng)3 h,棄去培養(yǎng)板中的溶液,加入DM SO溶液,振蕩至完全溶解。用酶標(biāo)儀在570 nm處測定每孔的吸光度,實驗重復(fù)3次。結(jié)腸癌細(xì)胞生長的抑制率(R）依下式計算:

式中:A1為空白組的吸光度;A2為卡拉膠或卡拉膠寡糖組的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 卡拉膠降解條件的確定

2.1.1 硫酸濃度對卡拉膠降解的影響(圖1、圖2）

由圖1和圖2可以看出,硫酸濃度對卡拉膠的降解有一定的影響。硫酸濃度越大,卡拉膠降解得越快。1%硫酸降解卡拉膠的前4 h OD值變化很大,降解反應(yīng)較快;4 h之后,OD值的變化趨緩,說明卡拉膠大部分被降解成分子量較小的寡糖;24 h之后,卡拉膠幾乎全部被降解為單糖等小分子片段。0.5%硫酸降解卡拉膠6 h之后,OD值的變化趨緩,薄層層析結(jié)果與1%硫酸降解情況相似。0.1%硫酸降解卡拉膠的速度相對緩慢,降解8 h時只有少量分子量較小的寡糖生成;8 h之后OD值變化趨緩,24 h之后才有大量分子量較小的寡糖生成。綜合考慮,選擇硫酸濃度為0.5%,既能夠滿足降解卡拉膠為卡拉膠寡糖的需要,而且反應(yīng)時間和反應(yīng)產(chǎn)物較易控制。

2.1.2 溫度對卡拉膠降解的影響(圖3、圖4）

由圖3、圖4可以看出,溫度對卡拉膠降解的影響很大。在50℃降解卡拉膠時,反應(yīng)緩慢,長時間降解也很少生成分子量較小的寡糖,降解效果不理想;在60℃降解卡拉膠時,反應(yīng)較溫和,卡拉膠能夠逐漸被降解成小分子片斷;在70℃降解卡拉膠時,反應(yīng)較為劇烈,降解1 h左右卡拉膠就幾乎全部被降解成單糖等小分子片段,之后變化甚微,使得反應(yīng)產(chǎn)物和反應(yīng)時間不易控制。因此,選擇卡拉膠降解溫度為60℃。

2.1.3 卡拉膠濃度對降解的影響(圖5、圖6）

由圖5、圖6可以看出,卡拉膠濃度越高,降解反應(yīng)越慢。綜合考慮,選擇卡拉膠濃度為1%,不僅反應(yīng)迅速,產(chǎn)品也易于控制。

圖7 不同pH值下降解卡拉膠的吸光度變化曲線Fig.7 Absorbance of carrageenan degraded at different pH value

圖8 0.5%磷酸(a）和5%醋酸(b）降解卡拉膠的薄層層析圖Fig.8 TLC of carrageenan degraded with 0.5%phosphoric acid(a）or 5%acetic acid(b）

2.1.4 p H值對卡拉膠降解的影響(圖7、圖8）響很大。p H值越小,卡拉膠降解速度越快,降解程度也越高。0.5%硫酸(p H=1）降解卡拉膠4 h時,大部分卡拉膠就被降解為分子量較小的寡糖,OD值的變化趨緩;24 h之后,卡拉膠幾乎全部被降解成了單糖等小分子片段。0.5%磷酸(p H=2）降解卡拉膠的速度較慢,OD值變化平緩,降解24 h之后仍然沒有全部轉(zhuǎn)化成單糖等小分子片段。5%醋酸(p H=3）降解卡拉膠的程度最弱,降解過程中 OD值變化緩慢,降解24 h才生成很少量分子量較小的寡糖。因此,選擇0.5%硫酸(p H=1）用于卡拉膠的降解。

2.2 卡拉膠寡糖的理化性質(zhì)

2.2.1 一般物理表征

純化的卡拉膠寡糖為白色粉末狀固體,易溶于水,不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。

2.2.2 平均分子量

卡拉膠的分子量一般在 3×105左右,用0.5%硫酸在60℃降解卡拉膠4 h后,其平均分子量大大降低,測得卡拉膠寡糖混合物的平均分子量為1430。

2.2.3 硫酸根含量

卡拉膠降解前后硫酸根的含量由9.98%降低為8.78%,說明溫和條件下硫酸降解卡拉膠對結(jié)構(gòu)沒有破壞作用,大部分的硫酸根仍然連接在卡拉膠的糖環(huán)上。

2.2.4 粘度(圖9）

由圖9可以看出,0.5%硫酸在60℃降解卡拉膠15 m in后,表觀粘度就由3380 m Pa·s降到428 m Pa·s;降解1 h之后,卡拉膠的表觀粘度就低于100 m Pa·s。這說明酸性降解卡拉膠在使其分子量大大降低的同時,粘度也大大降低。

圖9 卡拉膠降解的粘度變化曲線Fig.9 Change curve of carrageenan viscosity with the degradation time

2.3 卡拉膠寡糖對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響(圖10）

圖10 卡拉膠和卡拉膠寡糖對結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1生長的影響Fig.10 Effects of carrageenan and CGOSon the growth of DLD1

由圖10可以看出,相同濃度的卡拉膠寡糖對結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1生長的抑制率明顯高于卡拉膠。25～100μg·mL-1的卡拉膠寡糖對結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1生長的抑制作用相差不大,當(dāng)卡拉膠寡糖的濃度為200 μg·m L-1時,其對結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1生長的抑制率達(dá)到了20%。由此可見卡拉膠被降解為卡拉膠寡糖后,其生物活性會有一定的改善,這為拓寬卡拉膠乃至更多海洋多糖的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),值得深入研究。

3 結(jié)論

對卡拉膠的降解條件、降解獲得的卡拉膠寡糖的理化性質(zhì)及其抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,在60℃下用0.5%硫酸降解1%的卡拉膠可以得到比較均勻、分子量大小不等的多種卡拉膠寡糖。用這種方法獲得的卡拉膠寡糖對結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1生長的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于相同濃度的卡拉膠,為拓寬卡拉膠的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

[1]紀(jì)明候.海藻化學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1997:117-187.

[2]Girond S,Crance JM,Van Cuyck-Gandre H,et al.Antiviral activ- ity of carrageenan on hepatitis A virus replication in cell culture[J].Res Virol,1991,142(4）:261-270.

[3]Coombe D R,Parish C R,Ramshaw IA,et al.Analysis of the in- hibition of tumour metastasis by sulphated polysaccharides[J].Int J Cancer,1987,39(1）:82-88.

[4]Noda H,Amano H,Arashima K,et al.Studies on the antitumor activity of marine algae[J].Nippon Suissan Gakkaishi,1989,55:1259-1264.

[5]Guven K C,Ozsoy Y,Ulutin O N.Anticoagulant,fibrinolytic and antiaggregant activity of carrageenans and alginic acid[J].Botani- ca Marina,1991,34(5）:429-432.

[6]徐強(qiáng),管華詩.卡拉膠研究的發(fā)展及現(xiàn)狀[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報,1995,(海洋藥物專輯）:117-124.

[7]王長云,顧謙群,周鵬,等.紅藻多糖卡拉膠分子修飾研究Ⅰ.酸降解[J].中國海洋藥物,2003,22(2）:24-27.

[8]張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1987:56.

[9]邱芳萍,張玲,于健.硫酸鋇比濁法對鹿茸多糖中硫酸基含量的測定[J].長春工業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版）,2005,26(4）:268-270.

[10]岑穎洲,馬夏軍,王凌云,等.羊棲菜多糖的制備及其對 Hep G-細(xì)胞的抑制作用[J].中國海洋藥物,2005,24(1）:21-24.

[11]鄧守恒,孫各琴,朱名安,等.硒化殼聚糖對NB4細(xì)胞作用的實驗研究[J].廣東微量元素科學(xué),2006,13(1）:23-26.

Preparation of Carrageenan Oligosaccharidesand Study on Its Biological Activity

WU Hai-ge,WANGYan-yu,YAO Zi-ang
(Key Lab of Bioorganic Chemistry of Liaoning Province,College of Bioengineering,Dalian University,Dalian 116622,China）

The degradation condition for carrageenan,the physico-chemical property and anticancer activity of carrageenan oligosaccharides(CGOS）obtained w ere studied.The results show ed that w hen 1% carrageenan was degraded with 0.5%sulphuric acid at 60℃,the products were uniform and the CGOS were inequality of size.The inhibition rate of colon carcinoma cell DLD1 by CGOS was much higher than that by carrageenan.It provides experimental reference to widen the application of carrageenan.

carrageenan;carrageenan oligosaccharides;degradation;biological activity

Q 533

A

1672-5425(2010）06-0037-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(30901875）,遼寧省教育廳科技資助項目(2008050）

2010-01-26

吳海歌(1975-）,女,遼寧大連人,博士,副教授,研究方向:海洋生物化工;通訊作者:姚子昂,教授。E-mail:ziangyao@163.com。