雷 婧,萬(wàn)華濤,汪勁松,王衛(wèi)東,潘繼承

(1.湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能實(shí)驗(yàn)室,湖北黃石 435002;2.湖北省黃石廣播電視大學(xué)陽(yáng)新分校,湖北黃石 435200）

精氨酸激酶C端結(jié)構(gòu)域的克隆及其表達(dá)純化

雷 婧1,萬(wàn)華濤2,汪勁松1,王衛(wèi)東1,潘繼承1

(1.湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能實(shí)驗(yàn)室,湖北黃石 435002;2.湖北省黃石廣播電視大學(xué)陽(yáng)新分校,湖北黃石 435200）

精氨酸激酶(A rginine kinase,AK）由一個(gè)小的球形N端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)大的C端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。將來(lái)源于基圍蝦的A K C端結(jié)構(gòu)域基因成功克隆到了原核表達(dá)載體p ET-28a上,然后再轉(zhuǎn)入 Rosetta進(jìn)行表達(dá)。探討了A K C端結(jié)構(gòu)域的最佳表達(dá)條件,當(dāng) OD600達(dá)到0.5～0.7時(shí),用終濃度為0.2 mmol·L-1的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG）在20℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)5～6 h,A K C端結(jié)構(gòu)域在上清中大量表達(dá)。采用 His-Tag金屬螯合親和層析純化、不連續(xù)梯度咪唑洗脫,得到了電泳純的A K C端結(jié)構(gòu)域。

精氨酸激酶;C端結(jié)構(gòu)域;克隆;表達(dá);純化

精氨酸激酶(Arginine kinase,A K,E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一種,主要存在于無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi),是細(xì)胞能量代謝中非常關(guān)鍵的磷酸激酶[1,2]。

從不同的無(wú)脊椎動(dòng)物體分離得到的A K結(jié)構(gòu)和大小均不同,可分為單亞基 A K[3](相對(duì)分子量約40 kDa）、雙亞基 A K[4](相對(duì)分子量約84 kDa）、四亞基A K[5](相對(duì)分子量約150～160 kDa）等三種類別。

研究表明,A K由一個(gè)小的球形N端結(jié)構(gòu)域(1～111）和一個(gè)大的C端結(jié)構(gòu)域(112～357）構(gòu)成。環(huán)63～68和環(huán)309～318為兩個(gè)高度保守的環(huán),分別位于這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)。N端結(jié)構(gòu)域?yàn)槿?螺旋,C端結(jié)構(gòu)域?yàn)楸?個(gè)α-螺旋包繞著的8股反平行β-折疊[6,7]。A K的活性部位位于C末端[8]。

作者將來(lái)源于基圍蝦的A K C端結(jié)構(gòu)域基因成功克隆到原核表達(dá)載體p ET2-8a上,再轉(zhuǎn)入 Rosetta進(jìn)行表達(dá),探索了A K C端結(jié)構(gòu)域(C-domain）的最佳表達(dá)條件,并進(jìn)行了純化。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌種與載體

Rosetta(DE3）、E.coli DH5α、A K菌種(基圍蝦）,自行保存;p ET-28a,Novagen公司。

1.1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶,上海中科開瑞公司;限制性內(nèi)切酶 Bam H I和 Sal I、T4DNA ligase,大連寶生物公司;Q IAquick Gel Extraction Kit,Qiagen公司;雙丙烯酰胺、2-巰基乙醇、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG）、PEG8000,Am resco公司;丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS）,Biomol公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DYCZ224D型垂直電泳槽,北京六一;GL-21M型冷凍離心機(jī),湖南星科儀器有限公司;UVP凝膠成像分析系統(tǒng),Gene公司;PCR儀,德國(guó) Hybaid公司;A KTA Purifier蛋白質(zhì)純化分析儀,GE公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與PCR

以基圍蝦 A K全基因序列為模板,用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,上游引物 P1:5′2 TTAGGA TCCAAGGACTTCGGTGATGTGAAC23′,下游 引 物 P2:5′2AAAGTCGACTTACA TCTCCT2 TCTCAA TCTT23′,分別從其中引入Bam H I和Sal I的酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基,擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為783 bp。引物由上海生物工程有限公司合成。

AK C-domain的PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性45 s,57℃退火45 s,72℃延伸1min,35次循環(huán);最后72℃10 min。得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收。

1.2.2 A K C-domain重組載體構(gòu)建

獲得的片斷經(jīng)Bam H I和 Sal I雙酶切處理產(chǎn)生粘性末端后,與同樣經(jīng)過(guò)這酶切處理過(guò)的載體p ET2 28a進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)質(zhì)粒提取篩選、酶切鑒定正確后,測(cè)序確認(rèn)。DNA測(cè)序由TaKaRa公司完成。

1.2.3 A K C-domain的表達(dá)

將經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒p ET-A K C-domain轉(zhuǎn)化 E.coli DH 5α表達(dá)菌株Rosetta。通過(guò)設(shè)置幾組平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)探索可溶性A K C-domain的最佳表達(dá)溫度以及IPTG濃度。由于A K C-domain蛋白不穩(wěn)定,在37℃大部分以包涵體形式存在。通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度以及摸索合適的誘導(dǎo)時(shí)間等措施能夠有效減少包涵體的形成,提高上清表達(dá)量。

1.2.4 A K C-domain的純化

由于A K C-domain末端連接p ET-28a載體的6個(gè)組氨酸(His）以融合蛋白形式表達(dá),可以采用鎳親和層析法純化。取螯合鎳離子常用的緩沖溶液(50 mmol·L-1Tris2Cl,500 mmo l·L-1NaCl,p H=7.4）平衡,將A K C-domain粗提液上柱,流速約0.5 m L·m in-1,His與鎳結(jié)合使帶 His標(biāo)記的蛋白質(zhì)吸附在鎳柱上面,不帶 His標(biāo)記的蛋白質(zhì)穿流下來(lái),分別用含50 mmol·L-1、150 mmol·L-1、250 mmol·L-1咪唑的常用緩沖溶液進(jìn)行洗脫,同時(shí)在280 nm處進(jìn)行連續(xù)紫外檢測(cè),根據(jù)電腦監(jiān)測(cè)波峰收集蛋白并留樣電泳,檢測(cè)分離純化情況。

1.2.5 純化的A K C-domain經(jīng)分子排阻層析

取1 m L純化后的蛋白樣品,以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾,再將其上樣到A KTA Purifier的層析柱中開始洗脫,同時(shí)檢測(cè)洗脫峰,用 A KTA Purifier蛋白純化分析儀在280 nm處監(jiān)測(cè),進(jìn)一步測(cè)定 A K C-do2 main純度。

分子篩層析使用的是 HR10/30 Superdex 200分子排阻鑒定緩沖溶液(p H=7.4）,其中包含50 mmol·L-1Tris2Cl、0.5 mol·L-1NaCl、0.1 mmol·L-1巰基乙醇溶液。使用前通過(guò)0.22μm的過(guò)濾器過(guò)濾、脫氣處理,濃度均為10.8μmol·L-1,每次上樣 500 μL,流速為0.5 m L ·min-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴(kuò)增目的片段

以A K全基因序列為模板,用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行

PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果見圖1。

圖1 AK C-domain PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR product of AK C-domain

由圖1可以看出,泳道1上檢測(cè)到一個(gè)800 bp左右DNA片段(PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）,大小與預(yù)期結(jié)果相符,且無(wú)其它非特異性的雜帶存在,初步確定該800 bp的DNA片段為A K C-domain。

由圖3可知，當(dāng)浸泡時(shí)間為2 h時(shí)，藕片的硬度最大；當(dāng)浸泡時(shí)間大于2 h后，隨著浸泡時(shí)間的增加，藕片硬度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但2 h后的硬度變化較小，結(jié)合感官評(píng)分圖可以看出，浸泡時(shí)間對(duì)感官影響較大，在2 h之前，感官評(píng)分上升趨勢(shì)變化明顯，能夠明顯感覺到藕片硬度的變化，2 h后感官評(píng)分變化趨勢(shì)減緩。隨著浸泡時(shí)間的增加，硬度減小，口感變差，且消耗的生產(chǎn)時(shí)間多，影響生產(chǎn)效率。

2.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

將A K C-domain和p ET-28a質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切后,在一定的連接體系下進(jìn)行連接,所獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞 E.coli DH5α中,結(jié)果見圖2。以p ET-28a質(zhì)粒未經(jīng)酶切直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照,以p ET-28a質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞為陰性對(duì)照。

圖2 pET-AK C-domain轉(zhuǎn)化 E.coli DH5αFig.2 Transformated E.coli DH5α with pET-AK C-domain

由圖2可以看出,經(jīng)雙酶切的A K C-domain基因片段與p ET-28a質(zhì)粒已成功連接。

2.3 重組克隆載體的PCR鑒定

目的基因C-domain的酶切產(chǎn)物電泳經(jīng)低熔點(diǎn)凝膠回收后,與p ET-28a載體連接,用PCR鑒定重組質(zhì)粒p ET-A K C-domain,結(jié)果見圖3。

將經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒p ET-A K C-domain轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α表達(dá)菌株 Rosetta。加入 IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過(guò)控制誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件,提高A K C-domain在上清中的表達(dá)量。結(jié)果表明,當(dāng)OD600達(dá)到0.5～0.7時(shí),用終濃度為 0.2 mmol·L-1的IPTG在20℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)5～6 h,A K C-domain在上清中能大量表達(dá)。

圖3 pET-AK C-domain的PCR鑒定Fig.3 PCR Identification of p ET-AK C-domain

對(duì)上清液中 A K C-domain進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果見圖4。

圖4 AK C-domain誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖Fig.4 SDS-PAG Eanalysis of induction expression of AK C-domain

由圖4可以看出,泳道1對(duì)應(yīng)分子量31 kD處有一條表達(dá)量相對(duì)較高的蛋白帶,與A K C-domain的分子量比較吻合,可以確定其為A K C-domain。

2.5 AK C-domain經(jīng) Ni-NAT后的SDS-PAGE圖譜(圖5）

圖5 AK C-domain經(jīng) Ni-NAT后的電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE analysis of AK C-domain

由圖5可以看出,非特異性結(jié)合的蛋白能被低濃度咪唑洗脫下來(lái),含有6×His-Tag的A K C-domain在更高濃度咪唑下被洗脫,因此能得到很純的目標(biāo)蛋白。

2.6 純化的AK C-domain經(jīng)分子排阻層析(圖6）

圖6 AK C-domain經(jīng) AKTA Purifier的洗脫圖譜(內(nèi)插圖為C-domain的SDS-PAGE圖譜）Fig.6 Size exclusion chromatogram of AK C-domain(Insert plot,SDS-PAGE of AK C-domain）

由圖6可以看出,A K C-domain的洗脫體積(17 mL）與其本身的分子量(31 kD）的關(guān)系與理論相符,表明純化的A K C-domain已達(dá)到了電泳純度。其帶電荷方面的均一性還需要進(jìn)一步做Native2PAGE觀測(cè)。

3 結(jié)論

將基圍蝦C端結(jié)構(gòu)域基因成功克隆到了原核表達(dá)載體p ET-28a上,再轉(zhuǎn)入連接的重組載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α擴(kuò)增,然后在 Rosetta進(jìn)行表達(dá)。當(dāng) OD600達(dá)到 0.5～0.7時(shí),用終濃度為 0.2 mmol·L-1的 IPTG在20℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)5～6 h,A K C端結(jié)構(gòu)域在上清中大量表達(dá)。采用鎳親和層析法純化、不連續(xù)梯度咪唑洗脫,得到了電泳純的A K C端結(jié)構(gòu)域。

[1]New sholme E A,Beis I,Leech A R,et al.The role of creatine ki-nase and arginine kinase in muscle[J].Biochem J,1978,172(3）:533-537.

[2]Ellington W R.Phosphocreatine rep resents a thermodynamic and functional improvement over other muscle phosphagens[J].J Exp Biol,1989,143:177-194.

[3]France R M,Sellers D S,Grossman S H.Purification,character- ization,and hydrodynamic properties of arginine kinase from Gulf shrimp(Penaeus aztecus）[J].Arch Biochem Biophys,1997,345(1）:73-78.

[4]Suzuki T,Yamamoto Y,Umekawa M.Stichopus japonicus argi-nine kinase:Gene structure and unique substrate recognition sys- tem[J].Biochem J,2000,351(3）:579-585.

[5]Robin Y,Klotz C,Thoai N V.On a new form of A TP:Arginine phosphotransferase,with a molecular of 160000[J].Biochim Bio- phys Acta,1969,171(2）:357-359.

[6]Zhou G,Somasundaram T,Blanc E,et al.Transition state struc- ture of arginine kinase:Implication for catalysis of bimolecular re- actions[J].Proc Natl Acad Sci,1998,95(15）:8449-8454.

[7]Pineda A O,Ellington W R.Structural and functional implications of the amino acid sequences of dimeric,cytoplasmic and octameric mitochondrial creatine kinases from a protostome invertebrate[J].Eur J Biochem,1999,264(1）:67-73.

[8]Rao J K,Bujacz G,W lodawer A.Crystal structure of rabbitmus-cle creatine kinase[J].FEBSLett,1998,439(122）:133-137.

Cloning,Expression and Purification of the C-domain of Arginine Kinase

LEI Jing1,WAN Hua-tao2,WANG Jin-song1,WANG Wei-dong1,PAN Ji-cheng1
(1.The Protein Structure and Function Laboratory,College of Life Science,Hubei Normal University,Huangshi 435002,China;2.The Yangxin Division School of Hubei Broad&TV University,Huangshi 435200,China）

Arginine kinase(A K）p lays an important role in cellular energy metabolism in invertebrates.A K consists of a small spherical N-terminal domain and a large C-terminal domain.The encoding A K gene from greasyback shrimp was cloned in prokaryotic expression plasmid pET-28a,and then it was expressed in Rosetta dissoluble form.It was found that A K C-domain was expressed in bulk in supernant when the culture induced by isopropyL-β-D-galatose with final concentration of 0.2 mmol·L-1lasted for 5～6 h at 20 ℃w hen OD600w as 0.5～0.7.The electrophoretic pure recombinant protein was obtained by purification using His-Tag nickel affinity chromatography and discontinuous gradient elution with imidazole.

arginine kinase;C-terminal domain;clone;expression;purification

Q 786

A

1672-5425(2010）06-0041-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30570412）,湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2005ABA 192）

2010-04-22

雷婧(1985-）,女,湖北武漢人,碩士研究生,主要從事蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究;通訊作者:潘繼承,教授。E-mail:jichen2 gp@yahoo.cn。