孫慧潔,黃惠琴,朱 軍,孫前光,余中華,鮑時(shí)翔＊

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所,海南?？?571101;2.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院,海南儋州 570228)

海綿屬于動(dòng)物界多孔動(dòng)物門(mén),大多數(shù)棲息于海洋中,是營(yíng)固生活的一類(lèi)多細(xì)胞后生動(dòng)物,體壁上有許多小孔或管道與外界或中央腔相通,依靠過(guò)濾海水中的微生物為食。全世界約有10 000～15 000種海綿[1],是海洋中除珊瑚外的第二大生物量,是迄今為止海洋天然產(chǎn)物的最大來(lái)源。我國(guó)南海海域遼闊,造礁珊瑚極其發(fā)達(dá),很適合海綿的生長(zhǎng)和繁殖,因此,南海海綿的種類(lèi)遠(yuǎn)比中國(guó)其他海域豐富。由于海綿屬于底棲濾捕食動(dòng)物,其獨(dú)特的攝食、濾食系統(tǒng)使其體內(nèi)蘊(yùn)藏了豐富的微生物。據(jù)估計(jì),海綿體內(nèi)和體表的微生物群落占海綿干重的40%左右,最高可達(dá)70%,比周?chē)Ｋ⑸锖扛叱?～4個(gè)數(shù)量級(jí)[2]。分子生物學(xué)研究也表明海綿中存在大量的微生物資源,然而已成功分離的微生物物種卻僅占整個(gè)海綿微生物群落的0.1%[3]。為尋找新的微生物資源,本文利用R2A培養(yǎng)基對(duì)采自海南三亞的海綿樣品進(jìn)行細(xì)菌選擇性分離,并對(duì)其中2株細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海綿樣品 2008年7月于三亞市小東海采集到3種新鮮海綿,放入無(wú)菌采樣袋,2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室處理,不能及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室的則放于冰盒內(nèi)低溫短時(shí)間保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①R2A培養(yǎng)基：酵母膏0.5 g,蛋白胨0.5 g,酸水解酪素0.5 g,葡萄糖0.5 g,可溶性淀粉0.5 g,磷酸氫二鉀0.3 g,無(wú)水硫酸鎂0.024 g,丙酮酸鈉0.3 g,瓊脂18 g,陳海水750 mL,蒸餾水250 mL,pH 7.4;②LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,陳海水750 mL,蒸餾水250 mL,pH 7.2～7.4。1.1.3 主要試劑 蛋白酶K(Merck Co.Ltd.)、PCR試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)、瓊脂糖(Promega Co.Ltd.),其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)試劑。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理 將采集的海綿樣品用無(wú)菌海水洗滌2～3次后,用無(wú)菌的手術(shù)刀將樣品切成小塊,然后在無(wú)菌研缽中研磨5 min,使成為均勻漿狀。一部分作為本實(shí)驗(yàn)材料立即處理,另一部分以1：1的比例加入40%甘油水溶液放置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 海綿細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將樣品進(jìn)行系列稀釋,選擇10-3、10-4稀釋度涂布于R2A培養(yǎng)基平板,各5個(gè)重復(fù),置于25℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)3、7、12、15、19、36 d觀察平板上菌落生長(zhǎng)情況,挑取單菌落純化。將分離到的菌株在R2A培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng),選擇在營(yíng)養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)勢(shì)較弱的菌株作為本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)菌。

1.2.3 細(xì)菌基因組DNA提取 參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.4 16S r DNA的PCR擴(kuò)增[5]根據(jù)細(xì)菌16S r DNA保守序列,合成引物：27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。PCR反應(yīng)體系(50μL)：5μL 10×PCR buffer,5μL 2 mmol/L dNTP,3μL 25 mmol/L MgCl2,1μL 20μmol/L引物27F,1μL 20μmol/L引物1492R,0.4μL Taq Polymerase(5 U/μL),1μL模板DNA和33.6μL無(wú)菌水。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,52℃退火1 min,72℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。

1.2.5 16S rDNA序列同源性分析 16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化,由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將序列結(jié)果與

GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast比對(duì),選取同源性高的菌株序列用于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。使用Clustal X1.8和MEGA2軟件進(jìn)行多序列匹配排列,用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.6 形態(tài)觀察 接種于R2A培養(yǎng)基平板,25℃倒置培養(yǎng)7 d,觀察菌落形狀、大小和形態(tài)。同時(shí)挑取菌體,進(jìn)行革蘭染色,用光學(xué)顯微鏡觀察[6]。

1.2.7 生理生化實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[6]中有關(guān)方法進(jìn)行生理生化特征鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 海綿細(xì)菌的分離培養(yǎng)

從海綿樣品中分離到89株菌落形態(tài)有差異的細(xì)菌,將分離到的菌株接種到R2A培養(yǎng)基與LB培養(yǎng)基平板上,與在R2A培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)相比,有13株菌在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較緩慢、長(zhǎng)勢(shì)也較弱,選擇這些在營(yíng)養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較弱的菌株作為本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)菌。

2.2 16S rDNA序列結(jié)果分析

對(duì)獲得的13株菌進(jìn)行基因組DNA提取,16S r DNA的PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,其中菌株HB09009與B acillus carboniphilus JCM9731T(AB021182)同源性最高,為97.1%,發(fā)育樹(shù)上處于同一個(gè)分支,親緣關(guān)系較近。菌株HB09012的Blast結(jié)果中,同源性較高的多為未培養(yǎng)菌,有效菌株中與Planctom yces marisDS M8797T(NR025327)同源性最高,為97.4%,二者在發(fā)育樹(shù)上也處于同一個(gè)分支。2株菌在GenBank中的登錄號(hào)分別是GU263833和GU263834。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 基于16S rDNA的HB09009與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain HB09009 and representatives

圖2 基于16S rDNA的HB09012與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain HB09012 and representatives

2.3 形態(tài)特征

菌株HB09009菌落圓形、較小,白色,濕潤(rùn)、略透明,邊緣規(guī)則。革蘭染色為陽(yáng)性,不具運(yùn)動(dòng)性;菌株HB09012菌落圓形、較小,淺黃色,較干燥、不透明,中央略隆起,邊緣整齊。革蘭染色為陽(yáng)性,具有運(yùn)動(dòng)性。

2.4 生理生化特征

菌株HB09009生長(zhǎng)溫度為20～39℃,適鹽范圍為2%～5%,生長(zhǎng)pH 4.0～7.5。接觸酶、甲基紅、硝酸鹽還原呈陽(yáng)性,氧化酶、V-P測(cè)定、纖維素分解、明膠液化、淀粉水解和脂酶呈陰性。可利用甘露醇、葡萄糖、D-棉子糖、纖維二糖、L-精氨酸、L-脯氨酸、淀粉、果糖、甘氨酸等碳源,不利用的碳源有肌醇、山梨醇、D-木糖、D-半乳糖、蔗糖、α-乳糖、L-胱氨酸、氨基乙酸、L-半胱氨酸、麥芽糖、L-酪氨酸、4-氨基丁酸。與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上同源性最高的B acillus carboniphilus在生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)特征和生理生化等方面存在明顯差異,見(jiàn)表1。

表1 菌株HB09009與Bacillus carboniphilus的比較Table 1 Comparison between strain HB09009 and Bacillus carboniphilus

菌株HB09012生長(zhǎng)溫度為20～39℃,適鹽范圍為2%～10%,生長(zhǎng)pH 4.0～8.0。接觸酶、硝酸鹽還原呈陽(yáng)性,氧化酶、甲基紅、V-P測(cè)定、纖維素分解、明膠液化、淀粉水解和脂酶呈陰性?？衫眉〈?、山梨醇、甘露醇、D-木糖、葡萄糖、α-乳糖、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-酪氨酸、淀粉、果糖、甘氨酸等碳源,不利用的碳源有D-半乳糖、D-棉子糖、蔗糖、纖維二糖、L-胱氨酸、氨基乙酸、L-半胱氨酸、麥芽糖、4-氨基丁酸。(G+C)mol%含量為49.4%。與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上同源性最高的Planctom yces m aris在生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)特征和生理生化特性等方面差異明顯,見(jiàn)表2。

表2 菌株HB09012與Planctom yces m aris的比較Table 2 Comparison between strain HB09012 andPlanctomyces maris

2.5 鑒定結(jié)果

菌株HB09009具有芽胞桿菌屬的典型特征,但與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上同源性最高的B acillus carboniphilus相比,二者在生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)特征和生理生化等方面存在較大的差異,因此很可能是B acillus屬的一個(gè)新種,暫定為B acillussp.HB09009。菌株HB09012具有浮霉菌屬的典型特征,與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上同源性最高的Planctom yces m aris相比,二者在生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)特征和生理生化特性等方面也存在較大的差異,很可能是Planctom yces屬的一個(gè)新種,暫定為Planctom ycessp.HB09012。

3 討 論

海洋是典型的寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境,生活在其中的細(xì)菌選擇了對(duì)環(huán)境資源高親和性的生長(zhǎng)策略,適應(yīng)低營(yíng)養(yǎng)含量。此類(lèi)菌個(gè)體微小,生長(zhǎng)緩慢,生長(zhǎng)速率和豐度變化很小[9]。在寡營(yíng)養(yǎng)濃度下,它們依然可以吸收足夠的有機(jī)質(zhì)來(lái)維持生長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)的增加甚至?xí)璧K其生長(zhǎng)[10]。R2A培養(yǎng)基雖然營(yíng)養(yǎng)濃度低,但種類(lèi)豐富,尤其是含有丙酮酸鈉成分,具有毒性氧降解的能力[11],對(duì)一些在常規(guī)培養(yǎng)基分離被忽略的類(lèi)群具有一定的分離效果,本研究獲得的13株菌是常規(guī)培養(yǎng)基分離所忽略的類(lèi)群。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),在R2A培養(yǎng)基上,雖然菌落形成速度慢,但會(huì)陸續(xù)穩(wěn)定形成。因此培養(yǎng)寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)菌,可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,使其長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)的尺度[12]。

細(xì)菌分類(lèi)和鑒定經(jīng)歷了長(zhǎng)期不斷的發(fā)展和提高。早期的分類(lèi)系統(tǒng)主要以形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征等表觀分類(lèi)學(xué)特征,對(duì)其進(jìn)行描述分類(lèi)。但是傳統(tǒng)分類(lèi)不能確切說(shuō)明遺傳進(jìn)化地位和關(guān)系。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,核酸序列分析等分子生物學(xué)技術(shù)在現(xiàn)代分類(lèi)學(xué)中已占主導(dǎo)地位。一般認(rèn)為,16S rDNA序列同源性≥95%的菌可歸為同一屬,≥97%可視為同一種。因此,在進(jìn)行菌株鑒定時(shí),16S rDNA序列同源性低于95%的菌可考慮建立新屬,低于97%的可建立新種,≥97%時(shí)必須測(cè)定DNA-DNA雜交率才能確定是否為新種。本文從海綿中分離的2株菌HB09009、HB09012 16S rDNA序列同源性分別是97.1%、97.4%,因此需要測(cè)定DNA-DNA雜交率來(lái)確定是否為新種。

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