徐義剛,崔麗春,李蘇龍,姜艷春,謝曉峰,劉新亮

(1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,黑龍江哈爾濱 150001;2.東北林業(yè)大學(xué),黑龍江哈爾濱 150040)

大腸埃希菌(Escherichia coli)由Escherich于1885年首次發(fā)現(xiàn),起初一直被認(rèn)為是腸道菌群的正常組成部分,屬于條件致病菌。20世紀(jì)中葉,人們認(rèn)識(shí)到某些特殊血清型大腸埃希菌對人和動(dòng)物有致病性,尤其對嬰兒和幼畜(禽),常引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥[1-2]。與人類疾病有關(guān)的大腸埃希菌,統(tǒng)稱為致瀉性大腸埃希菌(diarrheogenicE.coli),根據(jù)生物學(xué)特性主要分為4類[3-4]：產(chǎn)腸毒性大腸埃希菌(ETEC)、腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)和腸出血性大腸埃希菌(EHEC)。致瀉性大腸埃希菌作為人畜共患性致病菌,其研究具有重要的公共衛(wèi)生意義。ETEC主要感染兒童和旅游者,發(fā)展中國家尤為嚴(yán)重,被污染的水和食物是主要傳染來源,主要致病因素是大腸埃希菌腸毒素LT或ST[5],感染的臨床癥狀輕度時(shí)為溫和性腹瀉,嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為霍亂樣腹瀉癥狀[6];EPEC是嬰兒腹瀉的主要病原菌,具有高度傳染性,嚴(yán)重者可致死,病原菌主要感染腸上皮細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞表面形成特征性的組織病理學(xué)損傷[7];EIEC主要引起大齡兒童和成年人腹瀉,曾爆發(fā)流行,臨床癥狀為水樣腹瀉,有時(shí)呈現(xiàn)痢疾癥狀[8];EHEC主要血清型是O157：H7,引起散發(fā)性或暴發(fā)性出血性結(jié)腸炎,可產(chǎn)生志賀毒素樣細(xì)胞毒素[9]。目前我國針對致瀉性大腸埃希菌的檢測方法主要采用國標(biāo)法(GB 4789.6-1994),經(jīng)樣品→增菌→分離培養(yǎng)→革蘭染色鏡檢/生化及菌落觀察/生化反應(yīng)試驗(yàn)/腸毒素檢查等,操作復(fù)雜繁瑣,檢測時(shí)間長,完成整個(gè)檢測程序需要4～7 d,且檢測單一。本文結(jié)合致瀉性大腸埃希菌的危害性和感染的普遍性,建立一種多重PCR方法,實(shí)現(xiàn)一次性完成4種主要致瀉性大腸埃希菌的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌ATCC 25922、腸出血性大腸埃希菌O157：H7 ATCC 35150、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌ATCC 35401、侵襲性大腸埃希菌ATCC 43893、腸致病性大腸埃希菌ATCC 11775、阪崎腸桿菌ATCC 51329、單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC 19111、綿羊李斯特菌ATCC 33090、英諾克李斯特菌ATCC 19119、威爾斯李斯特菌ATCC 35897、西爾李斯特菌ATCC 35967、類志賀單胞菌ATCC 14030、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、空腸彎曲菌ATCC 33560、普通變形桿菌ATCC 49027、豬霍亂沙門菌ATCC 10708、福氏志賀菌ATCC 12022、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、溶血性鏈球菌CMCC 32121、霍亂弧菌ATCC 14035、副溶血性弧菌ATCC 27519、溶藻性弧菌ATCC 33839、創(chuàng)傷弧菌ATCC 33149和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌ATCC 9610,分別由美國典型菌種保藏中心(ATCC)和中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)提供。

1.1.2 試劑 TaqDNA Polymerase,NEB公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,大連TaKaRa公司;復(fù)合增菌培養(yǎng)基BPW,北京蘭伯瑞生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中發(fā)布的EHEC O157：H7 O-antigen基因、ETEC LT基因、EPECbfpA基因和EIEC invasion plas mid基因,利用引物設(shè)計(jì)軟件Pr imer 5.0設(shè)計(jì)4對多重PCR引物,詳細(xì)信息見表1,引物由大連TaKaRa公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 The primers sequence of PCR

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及基因組DNA提取 將試驗(yàn)菌株分別接種于5 mL復(fù)合增菌培養(yǎng)基BPW中,按照每種細(xì)菌最適生長溫度培養(yǎng)過夜,吸取1 mL培養(yǎng)菌液,利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取DNA,詳見說明書。

1.2.3 單一PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系為25μL,不含Mg2+的Buffer(10×)2.5 μL,將Mg2+、dNTP、TaqDNA Polymerase和引物配制成不同濃度的組合,用去離子水補(bǔ)充至25μL。Mg2+、dNTP、TaqDNA Polymerase和引物的濃度范圍依次為：Mg2+濃度范圍1.0～8 mmol/L,以0.5 mmol/L遞增;dNTPs濃度范圍0.1～0.8 mmol/L,以0.05 mmol/L遞增;TaqDNA Polymerase濃度范圍0.5～3.5 U,以0.5 U單位遞增;引物濃度范圍0.1～0.6μmol/L,以0.1μmol/L遞增。采用矩陣法進(jìn)行對比試驗(yàn)。反應(yīng)條件：95℃5 min,95℃20 s,為了提高PCR反應(yīng)的靈敏度和特異性,根據(jù)設(shè)計(jì)的引物退火溫度,以55℃為基礎(chǔ),以0.5℃遞加,直至62℃,時(shí)間30 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 多重PCR反應(yīng)體系為25μL,以提取的致病菌基因組作為模板,進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件及體系優(yōu)化參考單重PCR方法進(jìn)行。

1.2.5 多重PCR方法的特異性 采用試劑盒法提取試驗(yàn)菌株的基因組DNA,利用所建立的多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,驗(yàn)證本方法的特異性。

1.2.6 多重PCR方法的敏感性 測定所提取的4種致瀉性大腸埃希菌基因組DNA濃度,然后分別進(jìn)行10倍遞進(jìn)系列稀釋,從每種致病菌基因組DNA的每個(gè)稀釋度中各取1μL混合,以此作為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,以確定其敏感性。

1.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 將建立的多重PCR檢測方法應(yīng)用于檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐工作中,檢測124份肉類、奶類制品及人工污染樣品等,其結(jié)果與國標(biāo)法(GB 4789.6-1994)進(jìn)行比較,驗(yàn)證該方法的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR反應(yīng)條件的確定

首先對單一PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化,經(jīng)對比分析確定單一PCR反應(yīng)體系中的Mg2+濃度為2.5 mmol/L、dNTP濃度為0.2 mmol/L、TaqDNA Polymerase用量為1.5 U、引物濃度為0.2μmol/L,在該反應(yīng)體系下的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果見圖1。在單一PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增的基礎(chǔ)上,優(yōu)化了多重PCR反應(yīng)體系及條件,最佳反應(yīng)體系為：Mg2+濃度為4 mmol/L、dNTP濃度為0.3 mmol/L、TaqDNA Polymerase用量為2.0 U,PCR擴(kuò)增引物濃度比例為ETEC：EHEC：EIEC：EPEC=1：1：1.3：1。反應(yīng)條件為：95℃5 min、95℃15 s、60℃20 s、72℃60 s,進(jìn)行35個(gè)循環(huán),多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2。

圖1 致瀉性大腸埃希菌單一PCR檢測結(jié)果Fig.1 The detection results of diarrheogenicEscherichia coliby single PCR

圖2 4種致瀉性大腸埃希菌多重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification results of four diarrheogenic Escherichia colibymulti-PCR

2.2 多重PCR的特異性

利用多重PCR方法對表2中24株細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測試驗(yàn),結(jié)果顯示所試腸出血性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌和產(chǎn)腸毒性大腸埃希菌等4種致瀉性大腸埃希菌均為陽性,說明本研究所建立的多重PCR方法具有高度特異性。

表2 多重PCR特異性結(jié)果Table 2 The specificity results ofmulti-PCR assay

2.3 多重PCR的敏感性

將已知濃度的4種致瀉性大腸埃希菌基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋,從每個(gè)稀釋度中各取1μL混合,以此作為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,以確定其敏感性。結(jié)果表明,該多重PCR方法能同時(shí)檢測到128 pg的EHEC、EPEC、EIEC和ETEC的基因組DNA,其中EHEC和ETEC的最低基因組DNA檢出濃度為32 pg。

2.4 多重PCR的實(shí)踐應(yīng)用

利用多重PCR方法對124份肉類、奶類制品及人工污染食品樣品進(jìn)行檢測,同時(shí)采用國標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見表3。多重PCR方法共檢出15份陽性樣本,與國標(biāo)檢測結(jié)果符合率為100%,說明所建立的多重PCR方法具有良好的可靠性。

表3 多重PCR方法實(shí)際應(yīng)用結(jié)果Table 3 The application ofmulti-PCR assay in practice

3 討 論

食品安全是全球性的重大公共衛(wèi)生問題,已報(bào)道的食源性疾病致病因子有250多種,其中腸道致病菌是食源性疾病中最常見的生物致病因素。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道[10],全球每年因食源性微生物污染引起的腹瀉病例達(dá)數(shù)億起,死亡的0～15歲兒童約170萬人。目前,致瀉性大腸埃希菌仍是引起腹瀉的重要病原之一,特別是嬰幼兒腹瀉,在我國及國外腹瀉患者中致瀉性大腸埃希菌檢出率、構(gòu)成比、優(yōu)勢類型及血清型不同[11-15],給臨床診斷帶來不便。

在此情況下,采用多重PCR方法一次性檢測出單一病原感染或混合感染,對保障食品安全和人類健康具有現(xiàn)實(shí)意義。因此,本研究針對4種主要的致瀉性大腸埃希菌相關(guān)基因設(shè)計(jì)了4對特異性引物,通過體系及反應(yīng)條件優(yōu)化,建立了一步反應(yīng)同時(shí)檢測4種致瀉性大腸埃希菌的多重PCR方法。檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐證實(shí),該方法比常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定敏感度高,檢測快速,可用于臨床病例的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查,具有一定的實(shí)用性。

[1] 孫貴娟,林毓寧,鄧其軍,等.南寧市致瀉性大腸埃希菌病原監(jiān)測與研究[J].廣西醫(yī)學(xué),2000,22(4)：684-686.

[2] 陳萍,李澤鴻,邴偉.致瀉性大腸埃希菌研究進(jìn)展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2007,4：11-13.

[3] Rodríguez-Angeles G.Principal characteristics and diagnosis of the pathogenic groups of Escherichia coli[J].Salud Publica Mex,2002,44(5)：464-475.

[4] Nataro JP,Kaper JB.Diarrheagenic Escherichia coli[J].Clin Microbiol Rev,1998,11(1)：142-201.

[5] Levine MM.Escherichia colithat cause diarrhea：enterotoxigenic,enteropathogenic,enteroinvasive,enterohemorrhagic,and enteroadherent[J].J Infect Dis,1987,155：377-389.

[6] Qadri F,Svennerholm AM,Faruque ASG,et al.Enterotoxigenic Escherichia coliin developing countries：epidemiology,microbiology,clinical features,treatment,and prevention[J].ClinMicrobiol Rev,2005,18(3)：465-483.

[7] Torres AG,Zhou X,Kaper JB.Adherence of diarrheagenic Escherichia colistrains to epithelial cells[J].Infect Immun,2005,73：18-29.

[8] Lan R,AllesMC,Donohoe K.,et al.Molecular evolutionary relationships of enteroinvasive Escherichia coliand Shigella spp[J].Infect Immun,2004,72(9)：5080-5088.

[9] Rowe PC,Orrbine E,OgbornM,et al.EpidemicEscherichia coliO157：H7 gastroenteritis and hemolytic-uremic syndrome in a Canadian Inuit community：intestinal illness in family members as a risk factor[J].J Pediatr,1994,124：21-26.

[10] 張紅波.我國食品安全現(xiàn)狀分析及其對策[J].中國安全科學(xué)學(xué)報(bào),2004,14(1)：15-17.

[11] 趙瑞珍,李連青,朱慶義,等.產(chǎn)志賀樣毒素且具侵襲力的大腸埃希菌性小兒腹瀉[J].中華兒科雜志,2006,44(2)：136-137.

[12] 張道玲,邵長喜.感染性腹瀉病原菌調(diào)查分析[J].中國自然醫(yī)學(xué)雜志,2005,7(2)：83.

[13] 凌蘇,趙星祥,華冰,等.感染性腹瀉病原菌及藥敏分析[J].中華傳染病雜志,2005,23(5)：347-348.

[14] Kebede A,Polderman A M.Etiology of Acute Diarrhea in A-dults in Southwestern Nigeria[J].J Clin Microhiol,2004,42(8)：3909-3910.

[15] Keskim?kiM,Mattila L,Peltola H,et al.Prevalence of Diarrheagenic Eecherichia coliin Finns with or without Diarrhea during a Round-the-World Trip[J].J Clin Microbiol,2000,38(12)：4425-4429.