高 煥, 張本厚, 陳百堯, 于 飛, 閻斌倫, 陳建華

(1. 淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室, 江蘇 連云港 222005; 2. 連云港市海洋與水產科學研究所, 江蘇 連云港 222042)

逆境環(huán)境因素對三疣梭子蟹幼蟹致死效應分析

高 煥1, 張本厚1, 陳百堯2, 于 飛2, 閻斌倫1, 陳建華1

(1. 淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點建設實驗室, 江蘇 連云港 222005; 2. 連云港市海洋與水產科學研究所, 江蘇 連云港 222042)

利用正交試驗設計, 研究了溫度、鹽度和酸堿度 3種環(huán)境因素逆境下對三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹的致死效應, 以闡明三疣梭子蟹幼蟹對不同逆境環(huán)境的抵抗力大小。3種逆境環(huán)境因素的水平分別是：溫度為10,15,30,35℃; 鹽度為10,15,35,40; 酸堿度為6.0, 6.5, 9.0, 9.5。結果表明, 鹽度變化對梭子蟹幼蟹的影響最大, 其次為酸堿度, 再次為溫度。對于溫度而言, 低溫下幼蟹的存活時間較長; 對于鹽度而言, 高鹽度逆境比低鹽度逆境下的存活時間長; 對于 pH值而言, 堿性環(huán)境下的存活時間比酸性環(huán)境下的存活時間長。

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus); 逆境環(huán)境; 半致死時間

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) 是一種大型的經濟蟹類, 主要分布于中國渤海、黃海、東海,以及朝鮮、韓國、日本和菲律賓等海域, 在中國山東、江蘇、浙江等沿海地區(qū)的養(yǎng)殖規(guī)模很大。目前三疣梭子蟹的育苗和養(yǎng)殖技術已經比較成熟[1,2], 這主要得益于對三疣梭子蟹育苗和養(yǎng)殖適宜環(huán)境因素的研究[3～5], 但對于適宜生存環(huán)境之外的環(huán)境變化對三疣梭子蟹生存的影響未見報道。闡釋物種在逆性環(huán)境下的反應能力, 對于了解物種在自然界中的生存能力大小具有重要的意義。同時, 同一物種內個體間應變能力的差異也是體現(xiàn)不同個體種質差異的一個重要表現(xiàn), 在選種和育種中也具有重要的參考價值,如據(jù)此可以根據(jù)抵抗逆性環(huán)境能力的差異建立評定苗種質量的快速檢測技術, 亦或在環(huán)境臨界點探討物種的育苗技術等。作者旨在探討不同逆境因素對三疣梭子蟹影響的差異, 以期指導三疣梭子蟹的苗種生產和養(yǎng)殖, 也為研究三疣梭子蟹應變環(huán)境變化的內在機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗在江蘇省連云港市長豐育苗場進行, 采用同一家系的Ⅱ期幼蟹進行試驗研究。實驗所用容器為500 mL的玻璃燒杯。實驗用水為二級沙濾海水,鹽度30±0.3, pH8.0±0.2, 溫度21℃±0.2℃。

采用鹵蟲(Artemiasalina)作為餌料投喂幼蟹。

1.2 研究方法

1.2.1 環(huán)境因子的條件控制

幼蟹分別安排在500 mL燒杯中進行實驗。采用手持式折射儀測定海水的鹽度,便攜式pHB-5型 pH計測定pH值, 溫度計測定水體溫度。利用海水粗提鹽調節(jié)鹽度大小, 用1 mol/L鹽酸和氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值。把同一溫度梯度的實驗組安排在同一塑料箱中進行, 塑料箱中加入一定體積的淡水, 通過加入冰塊和熱水(80～100℃)調節(jié)塑料箱中水體的溫度,以水浴方式調節(jié)實驗組燒杯中的水溫, 溫差控制在±0.5℃范圍內。

1.2.2 逆性環(huán)境因子的設定及正交試驗設計

三疣梭子蟹正常育苗時的溫度為 20～27℃, 鹽度為18～27,pH值為7.5～8.4[6]。針對以上3個因素,本實驗中各設置4個水平(表1)。

表1 因素及其水平Tab. 1 Factors and factor levels

以上實驗安排依照正交實驗設計表L16(45)進行安排, 每個實驗組共設置 16個實驗, 各燒杯中放置10個幼蟹。另外設置一組重復和正常育苗水體條件下的對照組。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

觀察并記錄實驗組、重復組、對照組蟹苗活動狀況。每隔一段時間(開始0.5 h每隔2 min, 0.5～1 h每隔10 min, 1～11 h每隔1 h, 11 h以后每隔2 h)統(tǒng)計記錄各組幼蟹的死亡時間。

以半致死時間和平均死亡時間兩個數(shù)值來表示各組幼蟹耐受程度的最終結果。半致死時間LT50(Median lethal time)的公式根據(jù)半致死濃度的公式[7]修改而來, 具體如下：

式中,C1和C2分別為存活率接近50%時的低時間和高時間,P1和P2分別為相應的存活率。

平均死亡時間(Td)的計算公式：

式中,Td為平均死亡時間,ni為第i時間死亡個數(shù),t為對應個體的死亡時間。

利用正交設計助手 II V3.1專業(yè)版軟件及SPSS14.0(SPSS Inc., Chicago, IL)進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果

2.1 幼蟹死亡和存活情況

經過28 h觀察, 實驗組和重復組內的幼蟹全部死亡, 其中實驗組和重復組內最短1 min內有幼蟹死亡, 最長存活時間達28 h。對照組三疣梭子蟹幼蟹沒有任何個體死亡。根據(jù)死亡時間和死亡的個體數(shù), 分別計算半致死時間和平均致死時間, 列于表2。

表2 幼蟹的半致死時間Tab. 2 Median lethal time of larva crab

從表2可以看出, 幼蟹的半致死時間為0.09 ～15 h,平均致死時間為 0.12～17.4 h。二者分布的規(guī)律基本相似, 為了更明確地判斷兩個統(tǒng)計量間是否存在差別, 把兩個變量數(shù)值看作一對成組資料進行兩個變量值的比較。利用SPSS軟件進行分析, 兩尾檢驗表明,P=0.067＞0.05, 兩者間不存在顯著性差異。因此在下文進一步的數(shù)據(jù)處理分析中, 只采用半致死時間作為正交試驗結果的統(tǒng)計標準。

2.2 環(huán)境因素突變對幼蟹存活的影響差異

根據(jù)正交試驗設計表, 輸入各實驗組的實驗結果, 見表3。利用正交試驗分析軟件“正交設計助手Ⅱ”(V3.1專業(yè)版, 顏承)對該實驗結果進行分析, 以闡明溫度、鹽度和酸堿度變化對幼蟹的影響, 不同因素引起幼蟹死亡的極差值見表4。

極差值越大, 表明相應因素變化對實驗結果的影響越大, 反之亦然。從表3可以看出, 極差值的大小依次為 9.195(鹽度)＞6.061(pH)＞5.254(溫度)。因此鹽度變化是影響幼蟹死亡的最重要原因。從表3還可以看出, 對于溫度而言, 低溫下幼蟹的存活時間較長, 如10℃(均值1)和15℃(均值2)下的存活時間分別為6.915 h和7.326 h, 而高溫30℃(均值3)35℃(均值4)下的存活時間分別為2.121 h和2.072 h; 對于鹽度而言, 高鹽度逆境比低鹽度逆境下的存活時間長, 對于pH值而言,堿性環(huán)境下的存活時間比酸性環(huán)境下的存活時間長。方差分析(表4)進一步表明, 溫度、鹽度和 pH值各因素的各個水平間的差異均達到了顯著性水平。

表3 正交直觀分析Tab. 3 The orthogonal intuitive analysis on average value of LT50

2.3 環(huán)境因素間的交互作用對幼蟹存活的影響

溫度與鹽度的交互作用對三疣梭子蟹幼蟹的影響見表5。由表5可以看出, 在高鹽度(35和40)和低溫(10℃和 15℃)下, 幼蟹的存活時間較長, 平均為(16.250+15.000+10.750+14.000)/4=14 h; 其次為高鹽度(35和40)和高溫度30℃和35℃)下存活時間也較長(平均為3.98 h), 而在低鹽度環(huán)境(10和15)和低溫(10℃和15℃)或者低鹽度(10和 15)和高溫(30℃和 35℃)下存活時間較短, 分別平均為0.241 h和0.214 h。同一溫度下, 高鹽度脅迫比低鹽度脅迫有利于幼蟹存活; 同一鹽度下, 低溫脅迫比高溫脅迫有利于幼蟹存活。

表4 平均LT50值正交方差分析Tab. 4 The orthogonal analysis of variance on average value of LT50

表5 鹽度與溫度的交互作用對三疣梭子蟹幼蟹存活的影響Tab. 5 Effect of the mutual action between temperature and salinity on the larva crab livability

溫度與酸堿度(pH)間的交互作用對三疣梭子蟹幼蟹的影響見表6。由表6可以看出, 在堿性環(huán)境(pH9.0, 9.5)和低溫度(10℃和 15℃)下, 幼蟹的存活時間較長, 平均為(16.250+14.000+10.750+15.000)/4=14 h; 其次為酸性環(huán)境(pH6.0, 6.5)和高溫度(30℃和 35℃)下存活時間也較長(平均為 3.98 h), 而在酸性環(huán)境(pH6.0, 6.5)和低溫(10℃和 15℃)或者堿性環(huán)境(pH9.0, 9.5)和高溫(30℃和35℃)下存活時間較短,分別平均為0.241 h和0.214 h。低溫脅迫條件下, 幼蟹在堿性脅迫下比酸性脅迫的存活時間長, 而高溫脅迫下, 幼蟹在酸性脅迫下比堿性脅迫的存活時間長; 酸性脅迫下, 幼蟹在高溫脅迫下比在低溫脅迫下的存活時間長, 而堿性脅迫下, 幼蟹卻在低溫脅迫下比在高溫脅迫下的存活時間長。

表6 溫度與pH的交互作用對三疣梭子蟹幼蟹存活的影響Tab. 6 Effect of the mutual action between temperature and pH on the larva crab livability

鹽度與酸堿度(pH)間的交互作用對三疣梭子蟹幼蟹的影響見表7。由表7可以看出, 在堿性環(huán)境(pH9.0, 9.5)和高鹽度(35和 40)下, 幼蟹的存活時間較長, 平均為(16.250+14.000+10.750+15.000)/4=14 h;其次為酸性環(huán)境(pH6.0, 6.5)和高鹽度(35和40)下存活時間也較長(平均為3.98 h), 而在酸性環(huán)境(pH6.0,6.5)和低鹽度(10和 15)或者堿性環(huán)境(pH9.0, 9.5)和高鹽度(35和40)下存活時間較短, 分別平均為0.241 h和0.214 h。在低鹽度脅迫下, 幼蟹在酸性脅迫下比在堿性脅迫下的存活時間長, 而在高鹽度脅迫下,幼蟹在堿性脅迫下比在酸性脅迫下的存活時間長;在同一個酸堿度下, 三疣梭子蟹幼蟹在高鹽脅迫下比在低鹽脅迫下的存活時間長。

表7 鹽度與pH的交互作用對三疣梭子蟹幼蟹存活的影響Tab. 7 Effect of the mutual action between salinity and pH on the larva crab livability

3 討論

3.1 實驗設計對實驗結果的影響

為了保證實驗結果的可靠性, 本研究中采用了同一家系的子代進行比較研究, 這從一定程度上可以保證用于實驗研究的幼蟹的遺傳背景相近, 因而減少了遺傳因素差異對于實驗結果的影響, 同時從重復組的結果看, 其與實驗組的數(shù)據(jù)相近, 這也說明實驗結果具有較好的重復性。

正交試驗設計的優(yōu)點在于可以用較少的實驗安排考察較多的實驗因素及其水平對實驗結果的影響[8], 其在食品工業(yè)和田間實驗中應用較多, 水產生物中多用來考察不同因素及其交互作用對水生生物的生長和存活的影響[9]。在本研究中, 首次研究了 3個因素, 鹽度、溫度和pH值對三疣梭子蟹幼蟹的存活影響, 引進了半致死時間和平均致死時間兩個統(tǒng)計量來對實驗結果進行衡量, 數(shù)據(jù)分析的結果比較說明, 這兩個數(shù)值都可以作為衡量正交試驗結果的值, 這為展開更多的因素和水平在水產生物中的應用提供了新的思路。

3.2 逆性環(huán)境對梭子蟹幼蟹的影響

三疣梭子蟹對于溫度的適應性較廣, 在 5～35℃范圍內均能正常生活, 而 0℃ 和 40℃ 為其存活的極限溫度[5]。但本研究表明, 當溫度劇烈變化時, 三疣梭子蟹幼蟹在低溫逆境下比高溫逆境的存活時間較長。這也說明了為什么三疣梭子蟹在偏冷區(qū)域分布較廣, 而在熱帶區(qū)域分布較少, 尤其是在地球炎熱的赤道附近。

三疣梭子蟹為廣鹽性種類, 其鹽度的適應性范圍為16～35[10]。本研究中顯示鹽度逆境造成三疣梭子蟹幼蟹死亡的極值最大, 說明鹽度是影響幼蟹存活的最主要因素, 這也說明幼蟹對鹽度變化較為敏感。其原因可能是幼蟹的滲透壓調節(jié)功能還不健全造成的, 當然也可能是本研究中鹽度差過大引起的應急死亡現(xiàn)象, 因此具體原因還有待進一步的研究。

目前, 酸堿度對水生生物毒性作用的研究相對較少, 尤其是在甲殼類生物中[11]。本實驗結果顯示酸堿度對三疣梭子蟹幼蟹的影響也是非常顯著的, 甚至略高于溫度的影響, 而且在堿性逆境下幼蟹的存活時間高于酸性逆境下的存活率。事實上, 三疣梭子蟹育苗水環(huán)境也是偏堿性的(pH7.8～8.6)[10]。這也說明三疣梭子蟹幼蟹對于堿性環(huán)境的適應性較高。

溫度、鹽度和酸堿度三者間的互作作用對幼蟹存活情況也是存在差異的, 如同一溫度下, 高鹽度脅迫比低鹽度脅迫有利于幼蟹存活; 同一鹽度下,低溫脅迫比高溫脅迫有利于幼蟹存活。這可能與不同因素間存在的關聯(lián)性有關, 如在堿性條件下, 水體中的 HO-較高, 必然與水體中的二價陽離子結合形成沉淀而使二價陽離子減少, 這加劇了一價陽離子和二價陽離子比例的失衡[11], 因此引起生物機體正常代謝對這些離子的需求, 引起功能紊亂, 加速幼蟹的死亡。這也顯示在三疣梭子蟹育苗和養(yǎng)殖中,有必要高度重視水體的酸堿度變化。

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Analysis on lethal effect of adversity on thePortunus trituberculatus

GAO Huan1, ZHANG Ben-hou1, CHEN Bai-yao2, YU Fei2, YAN Bin-lun1,CHEN Jian-hua1

(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China;2. Marine Fisheries Research Institute of Lianyungang, Lianyungang 222042, China)

Oct. ,12, 2008

Portunus trituberculatus; adversity; median lethal time

Using an orthogonal experiment plan, three kinds of adversity, tempreture, sality and pH, were used to test the resistance of the larva ofPortunus trituberculatus. The factor levels of three kinds of adversity, are 10, 15,30, and 35℃ for tempreture, 10, 15, 35, and 40 for salinity, and 6.0, 6.5, 9.0, and 9.5 for pH, respectively. The results discovered that the salinity was the most important factor affecting the livability of crab, and sub-important factor was pH, and the third-important facor was tempreture. The living time of crabs in low temprature was longer than that in high temprature, however, it is more longer in high salinity than in low salinity. For pH, the alkalic environment is more propitious to the livability of crab than acid environment.

Q178 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3096(2010)02-0057-05

2008-10-12;

2008-12-23

江蘇省海洋資源開發(fā)研究院科技開放基金項目(JSIMR09A03); 江蘇省水產三項工程資助項目(k2008-6); 淮海工學院引進人才科研啟動基金資助項目(KQ07048)

高煥(1976-), 男, 江蘇東海人, 淮海工學院講師, 博士, 主要從事水生生物種質資源與遺傳育種研究, 電話：13951258651,0518-85895252, E-mail：huanmr@163.com

梁德海)