馮年花 ，謝 安 ，婁遠(yuǎn)蕾 ，阮瓊芳 ，郭 菲 ，吳 玨 ，鄧志鋒 ，汪 泱 *

(1、南昌大學(xué)泌尿外科研究所；2、南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部；3、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西南昌330006)

人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

馮年花1，2，謝 安1，婁遠(yuǎn)蕾1，阮瓊芳1，郭 菲1，吳 玨1，2，鄧志鋒3，汪 泱1*

(1、南昌大學(xué)泌尿外科研究所；2、南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部；3、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西南昌330006)

目的建立穩(wěn)定的人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)培養(yǎng)體系。方法取第3～5代的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，絲裂霉素C處理后用作飼養(yǎng)層。人iPS細(xì)胞接種于飼養(yǎng)層上生長，膠原酶消化或機(jī)械法傳代。倒置顯微鏡下觀察iPS細(xì)胞生長狀態(tài)；觀察擬胚體形成能力；RT-PCR檢測(cè)iPS細(xì)胞多能性基因的表達(dá)情況。結(jié)果(1)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)為貼壁生長細(xì)胞，呈梭形或多角形。細(xì)胞增殖旺盛。(2)生長在飼養(yǎng)層上的人iPS細(xì)胞呈典型的克隆狀生長?？寺〕蕡A形或橢圓形，邊界清晰?？寺?nèi)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞體積小，核大，細(xì)胞核/質(zhì)比高。RT-PCR結(jié)果顯示人iPS細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)多能性基因Oct4,Nanog,Sox2；去除飼養(yǎng)層后懸浮培養(yǎng)能形成擬胚體(EB)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)體系適合人iPS細(xì)胞的培養(yǎng)，人iPS細(xì)胞能穩(wěn)定增殖，保持自我更新及分化潛能。

人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；飼養(yǎng)層

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 (induced pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞)是一種通過成體細(xì)胞重編程建立的多能干細(xì)胞，具有胚胎干細(xì)胞的特性，表達(dá)胚胎干細(xì)胞相關(guān)的多能性基因，能分化為三個(gè)胚層的細(xì)胞，移植到裸鼠體內(nèi)能形成畸胎瘤[1,2]。由于可取自成體細(xì)胞，因此iPS細(xì)胞的使用可避免胚胎干細(xì)胞面臨的倫理及免疫排斥問題，具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。iPS細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)體系的建立是其用于基礎(chǔ)研究及臨床疾病治療的基礎(chǔ)，具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)旨在建立穩(wěn)定的iPS細(xì)胞培養(yǎng)體系，為iPS細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系來源 清潔級(jí)孕12.5天Balb/c小鼠由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)科部提供；人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系iPS-S由中科院上海生化細(xì)胞所肖磊課題組惠贈(zèng)[3]。

1.2 試劑 KnockoutTMDMEM培養(yǎng)基、KnockoutTM血清替代物(Serum Replacement)、高糖DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸 (NEAA)、L-谷氨酰胺 (L-Glutamin)、-2-巰基乙醇(β-ME)、堿性成纖維生長因子(b-FGF)、Ⅳ型膠原酶， 以上均購自美國Invitrogen公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物有限公司；絲裂霉素C(MMC)和明膠(gelatine)購自美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購自美國Fermentas公司。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的配制 iPS細(xì)胞培養(yǎng)基：KnockoutTMDMEM+20%SR+1%NEAA+1mM L-glu+0.1mM β-ME+4ng/ml b-FGF；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)培養(yǎng)基：高糖DMEM培養(yǎng)基+10%FBS+2mM L-谷氨酰胺。

2.2 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的原代提取 將健康成年Balb/c小鼠按照雄性和雌性1:2比例合籠，次日觀察陰道栓，見栓當(dāng)日記為孕0.5天(E0.5d)。取妊娠12.5d的孕鼠，無菌條件取出胚胎，剝離羊膜，去除頭、四肢和內(nèi)臟，用無菌PBS洗凈血跡，眼科剪剪碎，加入0.125%EDTA胰蛋白酶37℃水浴消化3～5min后，輕輕吹散細(xì)胞，加入含血清培養(yǎng)基終止，靜置，取上清，重復(fù)數(shù)次；收集上清，1200r/min離心5min，取沉淀，以105/ml的密度接種于T25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、含5%CO2條件下培養(yǎng)。取狀態(tài)良好的細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 飼養(yǎng)層的制備 取第3～5代的MEF細(xì)胞，換上含10μg/ml絲裂霉素C的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)孵育1.5～3h，用無菌 PBS 洗 5 遍，胰酶消化，以 5～10×105/ml接種于預(yù)先用0.1%的明膠處理1～2h的T25塑料培養(yǎng)瓶中，一周內(nèi)使用。

2.4 人iPS細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

2.4.1 復(fù)蘇 取出凍存的iPS細(xì)胞，放于37℃溫水，使冰晶快速融化，逐滴加入10倍體積的iPS細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，800r/min離心3min，棄上清，加入5ml新鮮iPS細(xì)胞培養(yǎng)基，再次離心，洗凈凍存液中的DMSO和血清，用iPS細(xì)胞培養(yǎng)基重懸后接種于預(yù)先制備的飼養(yǎng)層上，每天換液。

2.4.2 傳代 (1)Ⅳ型膠原酶消化傳代法：待集落長滿飼養(yǎng)層，用1mg/ml的Ⅳ型膠原酶消化15～20min，將集落吹下，加入3～5ml培養(yǎng)液，輕輕吹散成小集落，均勻接種于飼養(yǎng)層細(xì)胞上，37℃、含5%CO2條件下培養(yǎng)；(2)機(jī)械傳代法：傳代前在倒置相差顯微鏡下將要分離的克隆做好標(biāo)記，無菌條件下用無菌巴氏管挑取標(biāo)記好的克隆，機(jī)械分離至合適大小，挑至離心管中800r/min離心3min，收集細(xì)胞沉淀，新鮮培養(yǎng)基重懸，接種于預(yù)先制備的飼養(yǎng)層上，每天換液。

2.4.3 凍存 將消化下來的iPS細(xì)胞集落轉(zhuǎn)移至離心管中，輕輕吹打至合適大小，800rpm離心3min，棄上清，加入預(yù)先配好的凍存液(70%培養(yǎng)基+20%血清+10%DMSO)，混勻，轉(zhuǎn)移至凍存管，標(biāo)記好名稱、日期和代數(shù)，于凍存盒中-80℃過夜，次日轉(zhuǎn)移至-196℃液氮罐中保存。

2.5 人iPS細(xì)胞的鑒定

2.5.1 RT-PCR檢測(cè)多能性基因的表達(dá) 取狀態(tài)良好的人iPS細(xì)胞克隆，Trizol法提取總RNA，RTPCR檢測(cè)多能性基因Oct4，Sox2，Nanog的表達(dá)。使用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性 5min，94℃變性 30s，退火 30s，72℃ 30s，72℃延伸10min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。β-actin做內(nèi)參。各引物序列及產(chǎn)物長度如下：Oct4：上游引物：CGAAGAGAAAGCGAACCAGTATC，下游引物：AGAACCACACTCGGACCAC ATC；Nanog： 上 游 引 物 ：GCAAAAAAGGAAGACAAGGTCC，下游引物：CCTTCTGCGTCACACCATTG；Sox2： 上 游 引 物 ：CCCCCGGCGGCAATAGCA，下游引物：TCGGCGCCGGGGAGATACAT；β-actin： 上 游 引 物 ：TCCTGTGGCATC CACGAAACT， 下 游 引 物 ：GAAGCATTTGCGGTGGACGAT。

2.5.2 擬胚體(EB)形成能力 將消化下來的iPS細(xì)胞集落移至一培養(yǎng)皿中，差速貼壁30min，去除剩余的飼養(yǎng)層細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞集落，用不含bFGF的iPS細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，吹打至合適大小的細(xì)胞團(tuán)，接種于低黏附的細(xì)菌培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)，隔天換液。

結(jié) 果

1 原代MEF的生長狀態(tài)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞，消化后2～3小時(shí)即貼壁并完全伸展，細(xì)胞呈梭形或多角形，胞漿飽滿，立體感強(qiáng)，細(xì)胞核清晰。培養(yǎng)第二天可見培養(yǎng)液中漂浮較多的死亡細(xì)胞。細(xì)胞增殖旺盛，鏡下可見較多圓形透亮的新生分裂細(xì)胞(圖A)。一般2～3天細(xì)胞完全融合，以1:2～3傳代，取第3～5代狀態(tài)良好的細(xì)胞用于飼養(yǎng)層的制備。

2 人iPS細(xì)胞的生長狀況及鑒定 iPS細(xì)胞呈典型的克隆狀生長，克隆呈圓形或橢圓形，邊界清晰，折光性好，高倍鏡下形似鳥巢(圖B)?？寺?nèi)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞體積較小，細(xì)胞核大、核仁清晰，細(xì)胞核/質(zhì)比高。細(xì)胞增殖旺盛，一般每5～6d傳代。RTPCR結(jié)果顯示體外多次傳代的iPS細(xì)胞仍高表達(dá)多能性基因 Oct4，Sox2，Nanog(圖 C)。消化后的 iPS 細(xì)胞集落在低黏附培養(yǎng)板中懸浮培養(yǎng)能聚集成球生長，形成擬胚體。擬胚體內(nèi)細(xì)胞間黏附緊密，各擬胚體邊界清楚，胚體飽滿，折光性好，懸浮生長于培養(yǎng)液中(圖 D)。

討 論

隨著再生醫(yī)學(xué)的興起，干細(xì)胞成為研究的熱點(diǎn)。iPS技術(shù)的建立是干細(xì)胞領(lǐng)域的又一重大突破，具有里程碑式的意義。穩(wěn)定的iPS細(xì)胞體外培養(yǎng)體系是其應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及臨床疾病治療的前提。本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞具有和ES細(xì)胞類似的生長特性，傳至35代仍能穩(wěn)定增殖并保持未分化狀態(tài)，強(qiáng)表達(dá)多能性基因Oct4，Sox2，Nanog，在去除飼養(yǎng)層之后能形成擬胚體，表現(xiàn)出干細(xì)胞的聚集生長特性。說明本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)體系適合iPS細(xì)胞的穩(wěn)定生長。

膠原酶消化法和機(jī)械傳代法是兩種常用的胚胎干細(xì)胞傳代方法[4]，膠原酶適合消化生長狀態(tài)良好，分化較少的克?。粰C(jī)械法適合于克隆的純化優(yōu)選。前者操作方便，適合大批量擴(kuò)增培養(yǎng)，但消化后集落的大小不易控制；后者工作量較大，時(shí)間較長，不適合大批量擴(kuò)增培養(yǎng)，但能控制集落的大小。實(shí)際操作中可將二者結(jié)合，在不同階段使用不同的方法進(jìn)行傳代。

在iPS細(xì)胞培養(yǎng)體系中，合適的飼養(yǎng)層細(xì)胞是維持其生長的必要條件。飼養(yǎng)層細(xì)胞是經(jīng)過滅活處理的不再增殖的細(xì)胞，可以分泌一些生長因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制分化，從而保持干細(xì)胞的自我更新及高度未分化狀態(tài)[5]。不同的飼養(yǎng)層分泌生長因子的能力不同[6]。飼養(yǎng)層細(xì)胞的好壞直接影響iPS細(xì)胞的生長狀態(tài)。制備飼養(yǎng)層細(xì)胞最關(guān)鍵的步驟是滅活，比較常用的有兩種方法，一種是射線照射法，另一種是絲裂霉素C處理法。處理的濃度和時(shí)間主要根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)、密度進(jìn)行調(diào)整[7]。本實(shí)驗(yàn)中采用絲裂霉素C處理法，一般10μg/ml處理1.5～3小時(shí)。我們?cè)鴮⒔?jīng)10μg/ml的絲裂霉素C處理2、2.5、3小時(shí)的飼養(yǎng)層進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)處理2.5小時(shí)比較合適，此時(shí)MC對(duì)細(xì)胞的毒性最低，同時(shí)又達(dá)到最佳的滅活效果。飼養(yǎng)層細(xì)胞的密度對(duì)iPS的生長狀態(tài)亦有影響[7,8]，細(xì)胞密度太高導(dǎo)致iPS細(xì)胞堆積生長，克隆中部細(xì)胞容易營養(yǎng)缺乏而死亡；密度太低易使iPS細(xì)胞分化，一般T25的培養(yǎng)瓶種植5～8×105細(xì)胞。此外，不同種屬的飼養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)iPS細(xì)胞的維持能力也不同[9，10]；飼養(yǎng)層細(xì)胞傳代次數(shù)越多，其對(duì)iPS細(xì)胞的維持能力則越低[11]。

目前，多家實(shí)驗(yàn)室已成功建立iPS細(xì)胞系，但各實(shí)驗(yàn)室之間的培養(yǎng)體系存在些許差異，這在一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及穩(wěn)定性。因此，建立穩(wěn)定規(guī)范的iPS細(xì)胞培養(yǎng)體系有助于提供高質(zhì)量細(xì)胞系，提高實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。

(致謝：感謝中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所肖磊課題組提供iPS細(xì)胞系)。

[1]Takahashi K.Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663～676.

[2]Boland M J,Hazen J L,Nazor K L,et al.Adult mice generated from induced pluripotent stem cells[J].Nature,2009,461(7260):91～94.

[3]Liao J,Wu Z,Wang Y,et al.Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS)cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors[J].Cell Res,2008,18(5):600～603.

[4]Richards M,Bongso A.Propagation of human embryonic stem cells on human feeder cells[J].MethodsMol Biol,2006,331:23～41.

[5]Saxena S,Hanwate M,Deb K,et al.FGF2 secreting human fibroblast feeder cells:a novel culture system for human embryonic stem cells[J].Mol Reprod Dev,2008,75(10):1523～1532.

[6]Eiselleova L,Peterkova I,Neradil J,et al.Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells[J].Int J Dev Biol,2008,52(4):353～363.

[7]Zhou D,Liu T,Zhou X,et al.Three key variables involved in feeder preparation for the maintenance of human embryonic stem cells[J].Cell Biol Int,2009,33(7):796～800.

[8]Michalska AE.Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells[J].Curr Protoc Stem Cell Biol,2007,Chapter 1:Unit1C.3.

[9]Zhu W W,Li N,Wang F,et al.Different types of feeder cells for maintenance of human embryonic stem cells[J].Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao,2009,31(4):468～472.

[10]Lee J B,Song J M,Lee J E,et al.Available human feeder cells for the maintenance of human embryonic stem cells[J].Reproduction,2004,128(6):727～735.

[11]Camarasa M,Brison D,Kimber S J,et al.Naturally immortalised mouse embryonic fibroblast lines support human embryonic stem cell growth[J].Cloning Stem Cells,2009,11(3):453～462.

Culture and identification of human induced pluripotent stem cells

FENG Nianhua,XIE An,LOU Yuanlei,et al.Institute of Urology of Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo establish a stable culture system of induced pluripotent stem cells(iPS).MethodsMouse embryonic fibroblast cells of 3-5th passages were treated by mitomycin C and prepared as feeder layers.iPS clones were plated on feeder layers and cells were observed under invert microscope.iPS clones was passaged by collagenase digestion or mechanical method.Total mRNA were extracted and expression of pluripotentassociated genes were detected by RT-RCR.Results(1)Mouse embryonic fibroblast cells were tightly adherent to culture dish and showed a spindle or polygon shape.(2)iPS cells were maintained on inactivated feeder layer and formed condensed clones with clear borders.Cells in clones appeared high nucleus/cytoplasm ratio and predominant nuclei.All iPS cells strongly expressed Oct4,Nanog and Sox2.When feeder cells were removed,iPS cells formed embryoid bodies in suspension condition.ConclusionHuman iPS cells proliferated stablely and kept high self-renewal and differentiation potency in our lab culture system,so the culture system is suitable for the long term subculture of human iPS cells.

Human induced pluripotent stem cells;Cell culture;Feeder cells

R446.11+3,Q813.1+1,R392-33

A

1674-1129(2010)01-0006-03

國家自然科學(xué)基金(30960385)；江西省自然科學(xué)基金(2007GZY1470)

馮年花，女，江西吉安人，1987年1月出生，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士研究生。

*通訊作者：汪泱，女，江西高安人，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)楦杉?xì)胞與再生醫(yī)學(xué)。

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.01.003