胡冬華 ，歐陽福桂，李 鷹 ，李 琴，王祖康，劉 瓊

(1江西省萍鄉(xiāng)市第三人民醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337000；2、江西省萍鄉(xiāng)市湘雅萍礦合作醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

耐多藥結(jié)核桿菌對二線抗結(jié)核藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)研究

胡冬華1，歐陽福桂2，李 鷹1，李 琴1，王祖康1，劉 瓊1

(1江西省萍鄉(xiāng)市第三人民醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337000；2、江西省萍鄉(xiāng)市湘雅萍礦合作醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

目的明確耐多藥結(jié)核桿菌對部分二線抗結(jié)核藥物的敏感性，為治愈耐多藥結(jié)核病提供依據(jù)。方法選用改良羅氏培養(yǎng)基，采用藥敏比例法測定耐多藥結(jié)核菌對卷曲霉素、丁胺卡那、左旋氧氟沙星、對氨基水楊酸此四種臨床常用二線抗結(jié)核藥物的敏感性。結(jié)果22株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對卷曲霉素、丁胺卡那、左旋氧氟沙星、對氨基水楊酸的敏感率依次為：72.7%、90.9%、63.6%、45.5%。結(jié)論本地區(qū)耐多藥結(jié)核菌對對氨基水楊酸敏感率較低，對其它三種二線抗結(jié)核藥還處于低水平耐藥狀態(tài)，但已出現(xiàn)廣泛耐藥結(jié)核桿菌菌株，應(yīng)予重視。

結(jié)核桿菌；耐多藥；二線抗結(jié)核藥物

近年來，耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB) 和廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDRTB)的流行與傳播引起了全球各國學(xué)者的極大關(guān)注，耐藥結(jié)核病的治療已成為結(jié)核病控制工作中亟待解決的難題[1-5]。耐多藥結(jié)核病是指結(jié)核病患者至少包括對異煙肼和利福平耐藥者，廣泛耐藥結(jié)核病是指在MDR-TB的基礎(chǔ)上，還對氟喹諾酮類藥物中的一種以及至少對以下三種注射藥物：卷曲霉素(Cm)、卡那霉素(Km)和丁胺卡那霉素(Amk)中的一種產(chǎn)生耐藥的結(jié)核病[1-3]。XDR-TB是目前最為嚴(yán)重的一種結(jié)核病，治愈率很低，病死率極高[5]。為掌握本地區(qū)耐多藥結(jié)核菌對部分二線抗結(jié)核藥物的敏感率及確認(rèn)廣泛耐藥結(jié)核菌的存在狀態(tài)，以便更及時(shí)有效地治愈好耐多藥結(jié)核患者，更有效地控制耐多藥、廣泛耐藥結(jié)核病的傳播流行，我們對自2008年12月份至2010年5月份培養(yǎng)分離出的22株耐多藥結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了四種二線抗結(jié)核藥物的藥物敏感實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

材料與方法

1 材料

1.1 標(biāo)本

22 例耐多藥結(jié)核分枝桿菌標(biāo)本，來自于2008年12月至2010年5月萍鄉(xiāng)市第三人民醫(yī)院門診及住院的結(jié)核感染復(fù)治患者，其中男性患者15例，女性患者7例，年齡分別為27至60歲。經(jīng)痰標(biāo)本結(jié)核菌培養(yǎng)及一線藥物敏感實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為同時(shí)對異煙肼及利福平此兩種藥物耐藥，符合耐多藥結(jié)核菌感染定義。

1.2 儀器

生物安全柜BIOSAfe12Ⅱ.A2購自上海力申科學(xué)儀器有限公司，37℃恒溫培養(yǎng)箱購自湖北黃石市醫(yī)療器械廠。

1.3 試劑

含對氨基水楊酸(PAS)，左旋氧氟沙星(LOF)，硫酸阿米卡星(AMK)，硫酸卷曲霉素(CPM)藥敏培養(yǎng)基及中性改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基購自臺灣貝索(BASO)公司。

1.4 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37 RV由江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

2 方法

2.1 標(biāo)本處理

將22株于對異煙肼及利福平同時(shí)耐藥的培養(yǎng)保存的陽性結(jié)核菌株，復(fù)蘇接種至羅氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)25d。

2.2 藥物敏感實(shí)驗(yàn)

采用比例法：對上述菌種復(fù)蘇培養(yǎng)25d后，挑取培養(yǎng)基上菌落，用無菌0.5%TWEEN80生理鹽水溶解、稀釋，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarland No.1)比濁，即制成1 mg/ml菌懸液，繼而稀釋至10-2和10-4mg/ml，分別用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)(0.07mm粗的金屬絲制成的內(nèi)徑3mm的接種環(huán)，1環(huán)可轉(zhuǎn)移菌液0.01ml)以劃線法接種至對照及含藥培養(yǎng)基斜面。

2.3 結(jié)果判斷

37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果并計(jì)算耐藥百分比(耐藥百分比＝(含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù))/(對照培養(yǎng)基上菌落數(shù))×100%，＜1%者報(bào)告敏感 (S)，≥1%者報(bào)告耐藥(R)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

患者的資料來源于本院門診及住院病歷，標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù)來自實(shí)驗(yàn)記錄，結(jié)果的統(tǒng)計(jì)采用Microsoft Excel，藥物敏感性分析實(shí)用 WHO的SDRTB4結(jié)核病耐藥檢測軟件，統(tǒng)計(jì)耐藥率及95%可信區(qū)間(95%C1)。

結(jié) 果

1 22 株耐多藥結(jié)核菌對四種二線抗結(jié)核單種藥物敏感率結(jié)果見表1。

2 22 株耐多藥結(jié)核菌對四種二線抗結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)多種藥物耐藥率結(jié)果見表2。

討 論

表1 單種藥物敏感率

表2 藥物敏感試驗(yàn)多種藥物耐藥結(jié)果

WHO 2008年報(bào)道顯示，全球結(jié)核病總耐藥率為20.0%，耐多藥率為5.3%，估計(jì)全球MDR-TB為50萬例，其中有三分之一已死亡，被WHO認(rèn)定的27個(gè)MDR-TB、XDR-TB高負(fù)擔(dān)國家占了病例總數(shù)的85%[6-7]。我國有500萬肺結(jié)核患者，占全球患者總數(shù)的1/4，每年新發(fā)傳染性結(jié)核病人150萬，每年大約有13萬人死于結(jié)核病。每年新發(fā)生耐多藥結(jié)核病患者12萬人，廣泛耐藥患者近1萬，結(jié)核在我國的流行危害已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過艾滋病及其它傳染病的威脅。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萍鄉(xiāng)地區(qū)耐多藥結(jié)核菌對二線抗結(jié)核藥物的敏感性總體上還保持在較高水平，其敏感性表現(xiàn)從高到低依次為丁胺卡那、卷曲霉素、左旋氧氟沙星、對氨基水楊酸。作者通過走訪調(diào)查實(shí)驗(yàn)組22例患者的病程情況及病歷資料發(fā)現(xiàn)，22例患者的治療方案都沒有嚴(yán)格參照1998年我國制定的標(biāo)準(zhǔn)耐多藥治療方案，基于培養(yǎng)時(shí)間等原因，有的也沒有參照我們的藥敏實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果。所有患者中，有近60%的患者因癥狀復(fù)發(fā)而重新入院或轉(zhuǎn)入其他醫(yī)院就診住院治療。因此，對于治愈耐多藥結(jié)核患者，明確的診斷，合理規(guī)范的治療都有賴于結(jié)核菌的培養(yǎng)及相應(yīng)的藥物敏感實(shí)驗(yàn)及有力的經(jīng)濟(jì)保障。治療的不規(guī)范使得普通的結(jié)核病轉(zhuǎn)變成耐多藥結(jié)核，在更加惡劣的情形下，耐多藥結(jié)核進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)閺V泛耐多藥結(jié)核。由于對目前絕大部分一線、二線抗結(jié)核藥物均有耐藥性，廣泛耐藥結(jié)核幾乎成為不治之癥。

綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及患者的臨床表現(xiàn)、抗結(jié)核治療用藥過程，作者認(rèn)為本文中有六例患者符合廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)感染診斷，該六例患者均為結(jié)核感染后久治不愈、病程遷延達(dá)4～9年，反復(fù)多次住院治療者，藥敏結(jié)果表現(xiàn)在同時(shí)耐異煙肼、利福平、左旋氧氟沙星該三種藥物的基礎(chǔ)上對卷曲霉素或丁胺卡那耐藥。該結(jié)果基本符合作者在一線藥物敏感試驗(yàn)中得出的推斷[8]。廣泛耐藥結(jié)核感染率占22例耐多藥結(jié)核標(biāo)本的27.3%，占總數(shù)44例結(jié)核培養(yǎng)陽性標(biāo)本的13.6%。

鑒于此次是本地區(qū)首次開展二線抗結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)，該批標(biāo)本篩選自80例結(jié)核感染患者，其中82%為結(jié)核復(fù)治患者，因此陽性率存在被統(tǒng)計(jì)高估的可能。但出現(xiàn)了典型的近似于不治之癥且極具傳播感染威脅的廣泛耐藥結(jié)核感染患者，應(yīng)引起抗結(jié)核治療專家及主管部門的高度重視。對于初治患者貫徹DOTS治療，不僅可治愈95%以上的患者，治療時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本也較低。對于耐多藥結(jié)核病(MDRTB)患者則應(yīng)選用敏感的二線抗結(jié)核藥物，參照國家的耐多藥結(jié)核病治療原則組合治療，阻止其發(fā)展為廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)。我們開展二線藥物敏感實(shí)驗(yàn)，只是為耐多藥結(jié)核病治療提供了相應(yīng)的藥物敏感數(shù)據(jù)，使得臨床耐多藥結(jié)核病治療的藥物組合有科學(xué)依據(jù)，以期提高其治愈率并控制其在本地區(qū)的感染流行嚴(yán)重趨勢。但是，同樣高昂的培養(yǎng)藥敏實(shí)驗(yàn)費(fèi)用也使更多貧困的耐多藥結(jié)核病患者及臨床醫(yī)生望而卻步，從而無法確診認(rèn)定出泛耐藥結(jié)核病患者，也使耐多藥結(jié)核病患者的治療更難控制而轉(zhuǎn)變?yōu)閺V泛耐藥結(jié)核病。為此，作者期待本文研究能引起主管部門對耐多藥、尤其是廣泛耐藥的結(jié)核患者投入更多經(jīng)濟(jì)、技術(shù)及政策上的支持，給結(jié)核患者更多的關(guān)懷，真正有效的控制結(jié)核病、耐藥結(jié)核病的流行傳播。

[1]唐神結(jié),肖和平.嚴(yán)重耐多藥結(jié)核病的成因與對策[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2009,3(3):460-466.

[2]唐神結(jié).耐藥結(jié)核病防治手冊[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:44-150.

[3]World Health Organization.Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis:emergency update 2008[M].Geneva：World Health Organization,2008:4-6.

[4]Chiang CY,Yew WW.Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis[J].Int J Tuberc Lung Dis,2009,13(3):304-311.

[5]Gandhi NR,Shah NS,Andrews JR,et al.HIV coinfection in multidrug-and extensively drug-resistant tuberculosis results in high early mortality[J].Am J Respir Crit Care Med,2010,181(1):80-86.

[6]World Health Organization.Global tuberculosis control：epidemiology，strategy，financing：WHO report 2009[M].Geneva:World Health Organization,2008:1.

[7]World Health Organization.Anti-tuberculosis drug resistance in the world fourth global report[M].Geneva:WHO Press,2008:14-17.

[8]胡冬華,李 琴,王祖康,等.萍鄉(xiāng)地區(qū)44株結(jié)核分枝桿菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2010,28(2):137-138.

The experimental study on susceptibility of multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis to secondline anti-TB drugs

HU Donghua,OUYANG Fugui,LI Ying,et al.Pingxiang Third People’s Hospital,Jiangxi Pingxiang 337000,China

ObjectiveTo understand the susceptibility of multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis to second-line anti-TB drugs for clinical treatment.MethodsThe susceptibility to CPM,AMK,PAS and LOF for multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis was tested by the reformed L-J culture media and proportional method.ResultsThe susceptibility of 22 strains showed CPM was 72.7%,and with 90.9%of AMK,63.6%of LOF,45.5%of PAS,respectively.Conclusions The rate of multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis retains a higher level against PAS,and at lower levels against LOF,AMK,CPM in our area.However,extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains should be noticed in clinical treatment.

Mycobacterium tuberculosis;Multi-drug resistance;Second-line anti-TB drug

R378.91+1,R446.5,R521,R825.2,Q939.92

A

1674-1129(2010)06-0543-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.06.004

江西省萍鄉(xiāng)市科技局2010年科研立項(xiàng)課題。

胡冬華，女，1977年生，本科學(xué)歷，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)及研究。