吳明和，周錫昌，梅秀麗，梅啟明，2，#，郭鵬

1.武漢大學生命科學學院，武漢430072

2.武漢大學園林與環(huán)衛(wèi)中心，武漢430072

3.武漢大學藥學院，武漢430072

1 引言（Introduction）

聯(lián)苯胺（Benzidine，學名：4,4-二氨基聯(lián)苯）是聯(lián)苯的衍生物之一，目前作為染料合成的中間體被廣泛應用于紡織印染業(yè)中.聯(lián)苯胺可與血紅蛋白結合成高鐵血紅蛋白，使血紅蛋白與氧結合能力下降；可導致人體急性或慢性中毒，記憶力嚴重下降，長期與該類物質(zhì)接觸可引起癌癥（International Agency for Research on Cancer, 1982）.近年來，人體因聯(lián)苯胺引起的膀胱癌、肝癌、腎癌和膽管癌等疾病已屢有報道（Choudhary, 1996）.

六氯苯（1,2,3,4,5,6-Hexachlorocyclohexane，學名：六氯化苯）是一種易揮發(fā)的持久性有機污染物（International Agency for Research on Cancer, 1982）.六氯苯作為農(nóng)作物的殺蟲劑和氯化物產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物和雜質(zhì)進入環(huán)境，并廣泛殘留于各環(huán)境介質(zhì)中.六氯苯可在人體和各種生物體內(nèi)累積（Courtney,1979;Billi de Catabbi et al., 2000），其毒性作用的主要靶器官是動物的肝臟.六氯苯的致突變性研究發(fā)現(xiàn)，暴露六氯苯引起的卟啉癥有引起原發(fā)性肝癌的傾向（Axelson,1986）.

目前有關聯(lián)苯胺和六氯苯的毒性作用研究已取得了一些進展（劉紅玲等，2007;戴捷和楊慧慧，2009），但其毒性作用機制研究很少深入到細胞器水平，對哺乳動物肝臟線粒體酶活性的影響尚鮮有報道.為此，我們通過體內(nèi)染毒方式建立毒性作用動物模型，研究了聯(lián)苯胺和六氯苯對大鼠肝線粒體抗氧化物酶及呼吸代謝和能量轉(zhuǎn)換酶——超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、細胞色素C氧化酶（COX）及鈣、鎂 ATP酶（Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）活性的影響.對聯(lián)苯胺和六氯苯在線粒體水平上的毒性作用進行探討，將為進一步深入研究其毒性機制提供實驗依據(jù).

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 主要試劑

聯(lián)苯胺、六氯苯、鄰苯三酚、核黃素、還原型細胞色素C、K3Fe（CN）6、1-萘酚、ATP鈉鹽、甘露醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均為分析純，購自上海試劑公司產(chǎn)品.考馬斯亮藍G-250，購自華美試劑公司，為Sigma進口分裝.其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

2.2 大鼠的分組及處理

選用健康成年二級SD大鼠，雌雄不分，體重（260±30）g左右，隨機分成4組，分別為對照組和3個聯(lián)苯胺處理組或3個六氯苯處理組，每組10只.其中3個聯(lián)苯胺處理組按大鼠體重分別以50、100、200mg·kg-1的聯(lián)苯胺溶液（配制：先將2g聯(lián)苯胺用5mL冰醋酸充分溶解后再用50mL滅菌雙蒸水稀釋）進行腹腔注射；3個六氯苯處理組按大鼠體重分別以 200、400、800mg·kg-1的六氯苯溶液（配制80mg·mL-1六氯苯水溶液（母液），土溫-20助溶，其含量為1.0%，注：最高濃度組大鼠的注射劑量不超過10mL·kg-1）進行腹腔注射，每天1次，共25d.對照組注射等體積量的生理鹽水.

2.3 大鼠肝臟線粒體的提取及線粒體酶樣品液的制備

采用文獻方法進行（梅啟明和朱英國，1990;梅啟明等，2004）.

2.4 酶活性測定及數(shù)據(jù)處理

2.4.1 線粒體蛋白含量測定

線粒體蛋白定量采用Lowry法測定（李如亮，1997）.

2.4.2 SOD酶活性測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定（謝衛(wèi)華等，1988），酶活性單位以U·mg（pro）-1表示.

2.4.3 GSH-Px活性測定

采用DNTB直接法測定（夏奕明和朱蓮珍，1987），酶活性單位以U·mg（pro）-1表示.

2.4.4 COX活性測定

COX酶活性測定采用分光光度法（Smith, 1955）測定.測定的酶樣品中加入10mmol·L-1pH 7.0磷酸鉀緩沖液1.5mL、酶液10μL（含線粒體蛋白50μg）、加雙蒸水至2.9mL；對照含同量磷酸鉀緩沖液和酶液、加入 100mmol·L-1K3Fe（CN）630μL、加雙蒸水至 2.9mL；30℃溫育 5min，加入0.18mmol·L-1還原型細胞色素 C 0.1mL,直接測定還原型細胞色素C被氧化的速度（即立即記錄550nm波長下光譜吸收值（A）下降的速度），計算COX活性，以一級反應速度常數(shù)K表示酶活性，酶活性單位以K［min-1·mg（pro）-1］表示.

2.4.5 Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性測定

采用微量定磷法測定（Furui,1990）.酶活性單位以μmolPi·h-1·mg（pro）-1表示.

3 結果與分析（Results and analysis）

3.1 聯(lián)苯胺對SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的影響

SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的檢測結果見表1.

表1 聯(lián)苯胺對大鼠肝臟線粒體酶活性的影響Table 1 Effect of benzidine on enzyme activity of rat liver mitochonria

表1顯示，在不同濃度聯(lián)苯胺作用下，大鼠臟臟線粒體中SOD、GSH-Px和Ca2+-ATPase的活性隨聯(lián)苯胺作用濃度增加，呈現(xiàn)出先上升再下降趨勢，在聯(lián)苯胺的處理濃度為50mg·kg-1時酶活性最高，其中SOD、GSH-Px、Ca2+-ATPase分別為對照組的102.0%、126.0%和123.0%.表明大鼠肝臟線粒體對聯(lián)苯胺的毒性作用存在應激反應.聯(lián)苯胺濃度升高至200mg·kg-1時酶活性最低，其中SOD下降30.4%，GSH-Px下降27.1%，Ca2+-ATPase下降26.8%.而COX和Mg2+-ATPase的活性則是隨聯(lián)苯胺作用濃度增加一直呈現(xiàn)下降趨勢，其中200mg·kg-1濃度處理組COX和Mg2+-ATPase的活性分別只有對照組的67.0%和48.8%.

3.2 六氯苯對SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的影響

SOD、GSH-Px、COX、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性的檢測結果見表2.

表2顯示，在不同濃度六氯苯作用下，大鼠肝臟線粒體中GSH-Px、COX和Ca2+-ATPase的活性隨六氯苯作用濃度的增加，呈現(xiàn)先上升再下降趨勢.COX和 Ca2+-ATPase在六氯苯處理濃度為200mg·kg-1時酶活性最高，其中COX為對照組的107.8%，Ca2+-ATPase為對照組的112.5%；GSH-Px在六氯苯處理濃度為400mg·kg-1時活性最高，其活性為對照組的122.2%.表明大鼠肝臟線粒體對六氯苯的毒性作用存在應激反應.六氯苯濃度升高至800mg·kg-1時酶活性最低，GSH-Px、COX和Ca2+-ATPase分別僅為對照組的 94.7%、70.9%和65.5%.而SOD和Mg2+-ATPase的活性則隨著六氯苯作用濃度增加一直呈現(xiàn)下降趨勢，至800mg·kg-1濃度處理組時，SOD和Mg2+-ATPase的活性分別只有對照組的75.5%和57.0%.

表2 六氯苯對大鼠肝臟線粒體酶活性的影響Table 2 Effect of 1,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane on enzyme activity of rat liver mitochonria

4 討論（Discussion）

接觸聯(lián)苯胺的職業(yè)性膀胱癌高危人群的原癌基因AN43基因的檢出率及mRNA的定量PCR讀數(shù)均明顯高于對照組人群（秦逸秋等，1999）.抑癌基因谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶GSTs基因型的分布在上海膀胱癌患者和聯(lián)苯胺接觸人群中顯著低于一般人群（陳紀剛等，1999）.表明聯(lián)苯胺可能對某些抑癌基因的表達具有阻遏作用而產(chǎn)生細胞毒性，對某些原癌基因的表達具有誘導激活的作用而使細胞產(chǎn)生癌變.在本實驗中，聯(lián)苯胺導致大鼠肝臟線粒體COX和Mg2+-ATPase活性持續(xù)下降，而SOD、GSH-Px和Ca2+-ATPase出現(xiàn)一定應激反應后活性同樣持續(xù)下降.這表明聯(lián)苯胺可能經(jīng)體內(nèi)代謝活化后，直接對線粒體DNA及其轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生作用，使酶的合成受阻，活性氧自由基和脂質(zhì)過氧化物大量產(chǎn)生.COX活性的降低表明電子傳遞過程已出現(xiàn)障礙，氧自由基的形成和泄漏的增加.由于聯(lián)苯胺的毒性作用，線粒體已處于病理狀態(tài).一方面，在聯(lián)苯胺毒性作用下，肝細胞線粒體氧自由基泄漏增加，線粒體內(nèi)單價氧大量產(chǎn)生；另一方面，由于線粒體內(nèi)單價氧大量產(chǎn)生，各類脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物大量增加，使SOD、GSH-Px過量消耗.脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的大量增加導致Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase活性降低.線粒體膜鈣泵、鎂泵（Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase）活性減弱直接導致細胞內(nèi)鈣超載，也是導致線粒體膜電位降低、線粒體氧化磷酸化障礙，造成線粒體膜結構受損和細胞壞死的重要原因（Zydowo et al.,1985;Elimadi et al., 1997）.

動物的肝臟是六氯苯毒性作用的主要靶器官，六氯苯通過影響肝臟的血紅素和膜磷脂代謝而引起卟啉血癥，甚至肝癌的產(chǎn)生（Cochón et al., 1999）.六氯苯的致突變性試驗研究發(fā)現(xiàn)，暴露六氯苯引起的卟啉癥有引起原發(fā)性肝癌的傾向（Axelson,1986）.在本實驗中，當六氯苯劑量濃度升高到800mg·kg-1時，COX和ATPase活性的下降幅度最大.分析認為，六氯苯可能經(jīng)過兩種途徑對鼠肝細胞線粒體產(chǎn)生毒性.一方面，經(jīng)體內(nèi)代謝活化及-OH-自由基與苯環(huán)反應而大量產(chǎn)生活性氧自由基，并對線粒體DNA及其轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生作用，使大鼠肝細胞線粒體COX合成被阻遏，酶的活性減弱.另一方面，由于線粒體COX活性被阻斷和減弱而造成呼吸鏈障礙電子泄露增加，以致活性氧自由基和脂質(zhì)過氧化物大量產(chǎn)生.結果是SOD、GSH-Px等功能酶被大量消耗，線粒體內(nèi)膜被損傷，外膜鈣泵活性降低，使線粒體及細胞內(nèi)鈣鎂平衡紊亂，導致細胞凋亡和死亡.

本實驗結果表明，線粒體內(nèi)COX電子傳遞鏈的完善與否和SOD、GSH-Px的水平是決定線粒體內(nèi)單價氧自由基泄漏多寡及各類脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生的關鍵.在本實驗中，聯(lián)苯胺、六氯苯經(jīng)體內(nèi)代謝活化后，可能直接對線粒體DNA及其轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生作用，使酶的合成受阻，由于線粒體COX代謝活性被阻斷和減弱，以至呼吸鏈障礙和電子泄露增加，線粒體活性氧自由基和脂質(zhì)過氧化物大量產(chǎn)生.超過線粒體SOD清除和GSH-Px的還原能力時，線粒體膜結構和功能受到損傷，線粒體正常的氧化磷酸化功能障礙，外膜鈣泵活性降低，線粒體及細胞內(nèi)鈣、鎂平衡紊亂.這可能是聯(lián)苯胺、六氯苯等環(huán)境化學致癌物對線粒體損傷的主要機制.結果還表明，聯(lián)苯胺、六氯苯等環(huán)境化學致癌物可能作為呼吸鏈阻礙劑，不僅影響呼吸鏈功能，而且促進活性氧自由基大量逸出線粒體，損傷細胞質(zhì)和細胞膜，導致細胞惡變.

Axelson O.1986.A review of porphyria and cancer and the missing link with human exposure to hexachlorobenzene［J］. IARC Scientific Publishings,（77）:585-589

Billi de Catabbi S C,Setton-Advruj C P,Sterin-Speziale N,San Martín de Viale L C,Cochón A C.2000.Hexachlorobenzeneinduced alterations on neutral and acidic sphingomyelinases and serine palmitoyltransferase activities.A time course study in two strains of rats［J］.Toxicology,149（2-3）:89-100

Choudhary G.1996.Human health perspectives on environmental exposure to benzidine:a review［J］.Chemosphere,32（2）:267-291

Cochón A C,San Martín de Viale L C,Billi de Catabbi S C. 1999.Effects of hexachlorobenzene on phospholipid and porphyrin metabolism in Harderian glands:a time-course study in two strains of rats［J］.Toxicology Letters,106（2-3）:129-136

Courtney K D.1979.Hexachlorobenzene（HCB）:a review［J］. Environmental Research,20（2）:225-266

Elimadi A,Morin D,Sapena R,Chauvet-Monges A M,Crevat A, Tillement J P. 1997. Comparison of the effects of cyclosporine A and trimetazidine on Ca2+-dependent mitochondrial swelling［J］.Fundamental& ClinicalPharmacology,11（5）: 440-447

FuruiT,Tanaka I,Iwata K.1990.Alterationsin Na+-K+-ATPase activity and beta-endorphin content in acute ischemic brain with and withoutnaloxone treatment［J］.Journalof Neurosurgery,72（3）:458-462

International Agency for Research on Cancer.1982.Benzidine and its sulfate,hydrochloride and dihydrochloride［R］.IARC Monographs on the Evaluation ofthe Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans,29（Supplement 1）:149-183

Li R L.1997.Biochemical Experiments［M］.Wuhan:Wuhan University Press,50-53（in Chinese）

Liu H L,Yu H X,Jiang W,Wang X R,Shi S J,Zhu L. 2007.Preliminary study on zebrafish embryo-toxicity of benzidine congeners［J］.Asian Journal of Ecotoxicology,2（1）:94-99（in Chinese）

Mei Q M,Guo P,Zhou P J,Liu Y.2004.Effects of various poisons on mitochondrial COX and Ca2+-ATPase isozymesof liver of pig［J］.Hubei Agricultural Sciences,（3）:89-92（in Chinese）

Mei Q M,Zhu Y G.1990.Comparative study on mitochondrial DNA from cytoplasmic male sterile lines of Honglian type and Yiebai type rice［J］.Journal of Wuhan Botanical Research,8（1）:25-33（in Chinese）

Qin Y Q,Liu Z B,Gu Z W,Zhang Y Y,Yuan S Y,Zhong S M.1999.An applied study on the detection of gene AN43 in peripheral white blood cells in high risk population of occupational bladder cancer［J］.Journal of Labour Medicine,16（3）:138-142（in Chinese）

Smith L.1955.Spectrophotometric assay of cytochrome c oxidase［J］.Methods Biochemical Analysis,2:427-434

Xie W H,Yao J F.Yuan Q S.1988.Modification of pyrogallol autoxidation method for assay of superoxide dismutase［J］. Chinese Journal of Pharmaceuticals,（5）:19-21（in Chinese）

Zydowo M M,Swierczynski J,Nagel G,Wrzolkowa T.1985. The respiration and calcium content of heart mitochondria from ratswith vitamin D-induced cardionecrosis［J］.Biochemistry Journal,226（1）:155-161

中文參考文獻

陳紀剛,林國芳,項翠琴,馬晴雯,張云英,秦逸秋,沈建華. 1999.谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）基因型多態(tài)性在上海聯(lián)苯胺接觸人群中分布的初步研究［J］.癌變·畸變·突變,11（6）: 330-334

戴捷,楊慧慧.2009.六氯苯對魚肝線粒體抗氧化酶活性及同工酶的影響［J］.長江大學學報（自然科學版）,6（1）:161-163

李如亮.1997.生物化學實驗［M］.武漢:武漢大學出版社, 50-53

劉紅玲,于紅霞,姜威,王曉蓉,史淑潔,朱琳.2007.聯(lián)苯胺類化合物對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的初步研究［J］.生態(tài)毒理學報,2（1）:94-99

梅啟明,郭鵬,周培疆,劉義.2004.不同毒物對豬肝線粒體COX和Ca2+-ATPase同工酶的影響［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學,（3）: 89-92

梅啟明,朱英國.1990.紅蓮型和野敗型水稻細胞質(zhì)雄性不育系線粒體DNA（mtDNA）的比較研究［J］.武漢植物學研究,8（1）:25-33

秦逸秋,劉卓寶,顧祖維,張云英,阮素云,鐘淑梅.1999.聯(lián)苯胺接觸人群外周血白細胞AN43基因檢測研究［J］.勞動醫(yī)學,16（3）:138-142

夏奕明,朱蓮珍.1987.血和組織中谷胱甘肽過氧化物酶活力的測定方法I.DTNB直接法［J］.衛(wèi)生研究,16（4）:29-31

謝衛(wèi)華,姚菊芳,袁勤生.1988.連苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的改進［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,（5）:19-21