王振濤 向明亮 吳皓李蘊(yùn)虞文偉 程嵐

耳蝸毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配的破壞解體是感音性聾的主要發(fā)病基礎(chǔ)。已發(fā)現(xiàn)鳥類耳蝸毛細(xì)胞損傷破壞后能夠獲得完全再生[1～4]，且毛細(xì)胞再生后即獲得神經(jīng)再支配，隨即有一重塑過程，最終，毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配這一復(fù)合結(jié)構(gòu)在形態(tài)上完全恢復(fù)正常，鳥聽功能亦恢復(fù)正常[1～4]。本研究擬在既往形態(tài)學(xué)研究[1～3]的基礎(chǔ)上，采用免疫組化熒光染色技術(shù)觀察雞卡那霉素耳中毒后聽神經(jīng)節(jié)ephrinA2蛋白的表達(dá)，并探討其表達(dá)與耳蝸毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配的再生及重塑有無關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 66只新生羅曼雞(德國(guó)進(jìn)口品種，由上海歸興種雞廠提供，雌雄兼用)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組48只，于生后3 d開始按200 mg·kg-1·d-1連續(xù)肌肉注射卡那霉素(sigma.華美生物工程公司上海分公司分裝)10 d，再將其設(shè)為施藥完畢前2 d、施藥完畢后1、3、7、10、15、21、30 d 8組，每組6只動(dòng)物。對(duì)照組18只，設(shè)3、13、43 d齡3組[1]，每組6只，處死時(shí)該三組動(dòng)物分別與施藥開始時(shí)、施藥完畢后0、30 d時(shí)之實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物同齡，對(duì)照組動(dòng)物不施與任何藥物。所有動(dòng)物按以上預(yù)定時(shí)間點(diǎn)行ABR檢測(cè)后處死，取聽神經(jīng)行免疫組化熒光染色。

1.2ABR檢測(cè)方法 各組動(dòng)物處死前先在聲電屏蔽室內(nèi)接受ABR檢測(cè)，采用Keypoint誘發(fā)電位處理系統(tǒng)，前置放大器靈敏度10 μv/d, 帶通濾波50～3 000 Hz, 分析時(shí)程10 ms,疊加200次。小雞用10%水合氯醛(240 mg/kg) 經(jīng)腹腔注射行全身麻醉后，將3枚針形不銹鋼電極分別插入小雞雙側(cè)乳突區(qū)及雙外耳道連線之顱頂正中處皮下，顱頂為記錄電極, 測(cè)試耳側(cè)為參考電極, 對(duì)側(cè)接地線；耳機(jī)距外耳道口約0.5 cm。由于卡那霉素耳中毒時(shí)，鳥基底乳頭的損傷區(qū)域約限于近端1/3，該區(qū)域的聲音感受頻率約為3 000 Hz以上，故采用4 000 Hz濾波短聲誘發(fā)ABR, 刺激率10次/秒。

1.3免疫組化熒光染色及陽性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn) 將雛雞用10%水合氯醛腹腔注射全麻后迅速斷頭處死，暴露耳蝸，消毒鑷取出聽神經(jīng)組織，儲(chǔ)存于液氮中；將組織標(biāo)本置入充滿OCT的冰模中定向包埋，-23℃；LECA-CM1000型冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，厚20 μm，每3張取1張；用涂有APES防脫膠的切玻片撈起切片，室溫下干化；將切片用2%NGS、1%牛血清白蛋白、0.2%Triton X-100孵化以阻滯非特異性抗體配體反應(yīng)，20分鐘；上抗Ephrin A2羊抗雞多克隆抗體(1：100)(上海寶船生物有限公司)，4℃濕化箱中孵化過夜；PBS清洗后，上驢抗羊IgG-FITC第二抗體(1：200)，室溫下孵化2小時(shí)；蓋片；OLYMPUS BX51熒光顯微鏡下觀察、拍照。陽性細(xì)胞判斷標(biāo)準(zhǔn)：熒光顯微鏡下觀察，聽神經(jīng)節(jié)細(xì)胞細(xì)胞膜及細(xì)胞漿發(fā)出強(qiáng)綠色熒光，細(xì)胞核無明顯熒光可見。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件統(tǒng)計(jì)包非參數(shù)統(tǒng)計(jì)Mann-Whitney法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1ABR檢測(cè)結(jié)果 正常對(duì)照組雛雞3、13 d齡ABR反應(yīng)閾分別為82.9±4.4、71.6±2.6 dB SPL，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。43 d齡組ABR反應(yīng)閾值(70.1±3.3 dB SPL)與13 d齡組基本一致。各組間波Ⅰ潛伏期、振幅無明顯差異。實(shí)驗(yàn)組3 d齡雛雞連續(xù)施與卡那霉素10 d完畢時(shí)，ABR反應(yīng)閾提高達(dá)到最大程度(116.3±4.3 dB SPL)。停藥后3 d反應(yīng)閾(112.0±5.2 dB SPL)與停藥后1 d反應(yīng)閾(116.3±4.6 dB SPL)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，藥畢7d時(shí)ABR反應(yīng)閾(101.5±4.3 dB SPL)較藥畢3 d時(shí)顯著降低(P<0.01)，藥畢10 d時(shí)ABR反應(yīng)閾(94.3±4.8 dB SPL)較藥畢7 d時(shí)進(jìn)一步降低(P<0.01)，其后反應(yīng)閾無明顯變化。

2.2聽神經(jīng)節(jié)組織免疫組化染色結(jié)果 正常對(duì)照組聽神經(jīng)節(jié)組織Ephrin A2陽性染色細(xì)胞數(shù)較多，呈梯度分布現(xiàn)象(圖1)。各時(shí)間點(diǎn)ephrin A2陽性染色細(xì)胞數(shù)無明顯差異，由于聽神經(jīng)節(jié)組織結(jié)構(gòu)本身較小，故所計(jì)數(shù)的細(xì)胞為全部節(jié)細(xì)胞，平均每一切面陽性細(xì)胞數(shù)約160個(gè)左右(圖2)。

實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Ephrin A2陽性染色細(xì)胞數(shù)變化明顯(圖3)，用藥完畢前2 d、完畢后1、3、7 d組聽神經(jīng)組織ephrin A2陽性染色細(xì)胞數(shù)較正常對(duì)照明顯減少(圖4)，每一切面陽性細(xì)胞數(shù)平均不足20個(gè)，藥畢后15 d時(shí)Ephrin A2陽性染色細(xì)胞數(shù)較前增多，平均每一切面陽性細(xì)胞數(shù)約70個(gè)左右，至藥畢后30 d時(shí)(圖5)ephrin A2陽性染色細(xì)胞數(shù)已接近正常對(duì)照，平均每一切面陽性細(xì)胞數(shù)約130個(gè)左右。

圖1正常對(duì)照組動(dòng)物生后13d時(shí)聽神經(jīng)組織冰凍切片ephrinA2免疫組化熒光(FITC標(biāo)記)染色陽性染色細(xì)胞數(shù)多，有呈梯度分布現(xiàn)象。黑色箭頭示陽性細(xì)胞，空白箭頭示陽性細(xì)胞稀少處(×200)

圖4實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物藥畢后1 d時(shí)聽神經(jīng)組織冰凍切片Ephrin A2免疫組化熒光(FITC標(biāo)記)染色陽性染色細(xì)胞極少(黑色箭頭所示)，空白箭頭示無陽性細(xì)胞處(×200)

圖5實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物藥畢后30 d時(shí)聽神經(jīng)組織冰凍切片Ephrin A2免疫組化熒光(FITC標(biāo)記)染色陽性染色細(xì)胞(黑色箭頭所示)數(shù)明顯增多,基本接近正常(×200)

圖2正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)聽神經(jīng)節(jié)組織Ephrin A2免疫組化熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)

圖3實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物聽神經(jīng)節(jié)組織Ephrin A2免疫組化熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)

3 討論

對(duì)卡那霉素中毒后雞耳蝸的掃描及透射電鏡觀察到[1～3]，連續(xù)施藥8 d(即施藥完畢前2 d)時(shí), 雞耳蝸近端毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配損傷明顯,施藥10 d完畢時(shí),耳蝸近端損傷區(qū)域毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配已完全破壞消失；施藥10 d完畢后1 d時(shí)，損傷區(qū)域可見少數(shù)幼稚再生毛細(xì)胞，并已獲傳入和傳出神經(jīng)再支配，與正常對(duì)照組相比，其時(shí)再生毛細(xì)胞的神經(jīng)再支配模式極為幼稚，其后，隨著毛細(xì)胞的發(fā)育，其神經(jīng)支配形態(tài)變化亦趨成熟；藥畢15 d時(shí)，再生毛細(xì)胞的神經(jīng)支配已接近正常對(duì)照組；藥畢60 d時(shí)，再生毛細(xì)胞的神經(jīng)支配已與正常對(duì)照基本相同。

從文中結(jié)果看，連續(xù)施藥8 d(藥畢前2 d組)，也就是當(dāng)雞耳蝸近端毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配損傷明顯時(shí)，聽神經(jīng)節(jié)組織中ephrinA2的蛋白表達(dá)明顯降低；施藥10 d完畢時(shí)，即當(dāng)原始毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配破壞最為明顯、耳蝸毛細(xì)胞神經(jīng)連接開始再生時(shí)，ephrinA2的蛋白表達(dá)降低達(dá)到最大程度。 Lee[5]等亦曾觀察到，雞慶大霉素中毒后，其耳蝸ephrinA2的蛋白表達(dá)明顯降低，與文中結(jié)果相似。此外，還觀察到，藥畢15 d， 即當(dāng)再生毛細(xì)胞神經(jīng)再支配的重塑大部分完成時(shí)，ephrinA2的陽性染色細(xì)胞數(shù)較前明顯增多；藥畢30 d，當(dāng)再生毛細(xì)胞神經(jīng)神經(jīng)再支配的重塑進(jìn)一步完成時(shí)，ephrinA2的陽性染色細(xì)胞數(shù)已基本接近正常，與相關(guān)形態(tài)學(xué)研究[1～3]比較，說明雞卡那霉素耳中毒后其耳蝸聽神經(jīng)節(jié)中ephrinA2蛋白的表達(dá)變化與耳蝸毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配的再生及重塑過程基本相同步。

此前的相關(guān)形態(tài)學(xué)研究觀察到，當(dāng)耳蝸原始毛細(xì)胞被卡那霉素?fù)p傷破壞時(shí)，支配它的神經(jīng)末梢亦從其正常所在位置消失[1]。由于神經(jīng)末梢在組織結(jié)構(gòu)上主要為軸膜和流動(dòng)的軸漿，要達(dá)到多個(gè)研究對(duì)象觀察目標(biāo)的一致性難度極高，而支配再生毛細(xì)胞的神經(jīng)末稍來源于聽神經(jīng)節(jié)，故通過觀察聽神經(jīng)節(jié)組織中某些因子的變化來探討其與相關(guān)形態(tài)變化的關(guān)系就顯得較為實(shí)際。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，ephrinA2作為酪氨酸激酶受體最大亞族Eph的配體ephrin的重要成員，其與受體結(jié)合后所產(chǎn)生的重要作用即與軸索生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)、局部空間定位、以及突觸的形成及重塑有關(guān)[6]，同時(shí)，ephrinA2的表達(dá)不僅與神經(jīng)組織的形態(tài)發(fā)生發(fā)育有關(guān)，還與神經(jīng)組織的損傷修復(fù)亦有關(guān)[7]；將成年大鼠視神經(jīng)切斷后，殘存的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中ephrinA2的表達(dá)明顯上調(diào)[7]，因此，認(rèn)為雞卡那霉素耳中毒后其耳蝸聽神經(jīng)節(jié)中ephrinA2蛋白的表達(dá)變化與耳蝸毛細(xì)胞及其神經(jīng)支配的再生及重塑過程基本相同步可能并非一偶然現(xiàn)象，提示其在雞卡那霉素中毒后耳蝸毛細(xì)胞神經(jīng)連接的再生及重塑過程中有著重要作用。此有待于進(jìn)一步的深入研究去證實(shí)。

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