王艷莉 郭玉芬,2 徐百成 袁逸銘 朱一鳴 歷建強(qiáng) 李倩 王秋菊

大前庭水管綜合征(large vestibular aqueduct syndrome, LVAS)是一種臨床常見的隱性遺傳性非綜合征型聽力障礙性疾病，在兒童和青少年感音神經(jīng)性聾中占1%～12%[1，2]。它是先天性內(nèi)耳畸形的一種。臨床上將只有前庭水管擴(kuò)大畸形，不伴有其他內(nèi)耳發(fā)育異常和其他器官系統(tǒng)的異常(如pendred’s Syndrome, Branchiootorenal Syndrome)，合并感音神經(jīng)性聽力損失的患者診斷為大前庭水管綜合征。其致病基因與Pendred綜合征的致病基因相同,即SLC26A4, 定位于人類染色體7q31上，編碼Pendrin蛋白[3]。為了明確SLC26A4基因在大前庭水管綜合征家系親子代間的傳遞規(guī)律，闡明家系中患者的發(fā)病率及患者后代的發(fā)病情況，本研究收集3個(gè)大前庭水管綜合征家系，對(duì)其SLC26A4基因的傳遞特征進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料的收集 所有家系資料均來自蘭州大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉科門診，該項(xiàng)目的倫理論證由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可。本研究共收集3個(gè)大前庭水管綜合征家系，分別命名為502家系、506家系和513家系。影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)5名大前庭水管綜合征患者，包括男性1名，女性4名。

所有納入者均進(jìn)行了詳細(xì)的病史調(diào)查和系統(tǒng)的全身體格檢查，并根據(jù)各成員檢測(cè)年齡及配合程度分別行純音測(cè)聽、聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)及畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emission, DPOAE)檢查。臨床病史資料的收集、家系各成員耳部檢查及聽力學(xué)檢查由蘭州大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉科專業(yè)醫(yī)師完成。所有聽力損失患者均行顳骨軸位高分辨率CT掃描。經(jīng)各成員本人或其監(jiān)護(hù)人知情同意后抽取外周靜脈血5 ml。用Cyrillic2.1軟件繪制家系圖譜(圖1)。對(duì)大前庭水管綜合征患者進(jìn)行隨訪，反復(fù)檢查其聽力。

圖1 502、506、513家系圖譜

1.2聽力學(xué)檢查方法 純音測(cè)聽：運(yùn)用Madsen502便攜式聽力計(jì)，以0.5、1、2、4 kHz的平均聽閾作為聽力損失的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，參照世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)[4]將聽力減退劃分為5級(jí)，即正?！?5 dB HL,輕度：26～40 dB HL，中度：41～60 dB HL；重度：61～80 dB HL；極重度≥81 dB HL。ABR和DPOAE應(yīng)用美國(guó)智聽公司Smart EP 聽覺誘發(fā)電位儀，常規(guī)進(jìn)行測(cè)試。

1.3影像學(xué)檢查 顳骨高分辨率軸位CT示：從半規(guī)管總腳到前庭水管外口的1/2處直徑大于1.5 mm，即診斷為前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大(EVA)[5]。

1.4基因組DNA提取 應(yīng)用鹽析法在全血中提取基因組DNA，TE溶解，經(jīng)瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)定量和純度分析后分裝，-20℃保存。

1.5PCR反應(yīng) 應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3針對(duì)外顯子8、19和其內(nèi)含子的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，所有引物由invitrogen公司合成。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction ，PCR) 采用25 μl反應(yīng)體系,10×Buffer 2.5 μl,2.5 mM dNTP 2 μl,10 μM引物0.6 μl,Tag酶1.5 U,gDNA 100 ng,加去離子水至25 μl。外顯子的引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件參照wang等[6]所述。取2 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.6PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析 用Millipore純化板對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,去除多余dNTPs和引物后應(yīng)用ABI公司 3 730DNA測(cè)序儀進(jìn)行正向和反向直接測(cè)序,引物與PCR擴(kuò)增引物相同。測(cè)序結(jié)果與來自NCBI上的SLC26A4基因標(biāo)準(zhǔn)序列(NT_007933)在DNAStar 7.0和Sequencher 4.9上進(jìn)行對(duì)比分析，確定突變位點(diǎn)。

1.7家系其他成員的基因檢測(cè) 針對(duì)患者中檢測(cè)到的SLC26A4基因突變位點(diǎn)，進(jìn)行對(duì)應(yīng)的序列分析。

2 結(jié)果

2.1顳骨高分辨率軸位CT檢查結(jié)果 顳骨CT共發(fā)現(xiàn)5名大前庭水管綜合征患者，未合并其他內(nèi)耳畸形(圖2)。

圖2顳骨CT圖A:正常雙側(cè)前庭水管；B:502家系先證者雙側(cè)擴(kuò)大的前庭水管(箭頭所示)；C: 502家系患者Ⅲ:4雙側(cè)擴(kuò)大的前庭水管(箭頭所示)；D: 513家系先證者雙側(cè)擴(kuò)大的前庭水管(箭頭所示)

2.2臨床檢查結(jié)果 經(jīng)過系統(tǒng)的全身體格檢查，所有納入者僅表現(xiàn)為聽力損失，未見其它系統(tǒng)的異常。3個(gè)家系中，父母均正常，患者為同胞，無(wú)其他大前庭水管綜合征患者。5名大前庭水管綜合征患者發(fā)病時(shí)均不超過3歲，最小3個(gè)月，平均1.8歲，只有簡(jiǎn)單言語(yǔ)發(fā)育。

2.3聽力學(xué)檢查結(jié)果 所有大前庭水管綜合征患者的聽力損失程度均達(dá)重度或極重度。家系各成員的聽力損失情況見表1。

2.4SLC26A4基因檢測(cè)結(jié)果 本研究共發(fā)現(xiàn)2種SLC26A4基因的突變類型，即IVS7-2A>G和H723R。5名大前庭水管綜合征患者均檢測(cè)出雙等位基因的突變，患者父母為單個(gè)突變基因的攜帶者。家系各成員的基因型見表1。

表1 家系成員聽力情況及其SLC26A4基因檢測(cè)結(jié)果

注：*即wild type，野生基因型

3 討論

本研究對(duì)3個(gè)大前庭水管綜合征家系15名成員的SLC26A4基因進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)5名成員攜帶SLC26A4雙等位基因突變，7名成員攜帶單個(gè)等位基因突變，3名正常人。檢測(cè)到兩種SLC26A4基因突變類型，即IVS7-2A>G和H723R，這兩種突變類型在國(guó)人大前庭水管綜合征患者中最常見[6，7]。IVS7-2A>G位于外顯子8剪切位點(diǎn)的位置，即內(nèi)含子7的3’末端，其突變使前體mRNA不能正常剪接，外顯子8整個(gè)丟失，外顯子7和外顯子9直接相連，從而導(dǎo)致Pendrin的翻譯發(fā)生移框或提前終止，影響Pendrin的結(jié)構(gòu)和功能[8]。H723R突變使該位置正常的組氨酸變成精氨酸，影響Pendrin的表達(dá)而致病[9]。

在502家系中，先證者Ⅲ:3、雙胞胎妹妹Ⅲ:4和其同胞弟弟Ⅲ:5的SLC26A4基因檢測(cè)結(jié)果均為IVS7-2A>G和H723R的復(fù)合雜合突變。父母(Ⅱ:3、Ⅱ:4)聽力正常，但分別為IVS7-2A>G和H723R的攜帶者。祖父Ⅰ:1和祖母Ⅰ:2聽力正常，但祖父是IVS7-2A>G突變的攜帶者，祖母未攜帶致病基因。同胞姐姐Ⅲ:1和Ⅲ:2聽力正常，均未攜帶致病基因。506家系和513家系的構(gòu)成相似：兩家系先證者的基因型均為IVS7-2A>G的純合突變，父母聽力均正常，都為IVS7-2A>G雜合突變攜帶者，506家系先證者的同胞姐姐和513家系先證者的同胞弟弟聽力均正常，血樣未獲得。由遺傳規(guī)律可知，子代的染色體分別來自父母雙方，分析502家系圖譜和各成員的基因型，可以得出如下結(jié)論：先證者的祖父攜帶的IVS7-2A>G突變傳遞給了先證者的父親，當(dāng)他與攜帶H723R突變的先證者母親婚配時(shí)，兩者各自的致病突變分別會(huì)遺傳給子代，當(dāng)患者同時(shí)遺傳了父母雙方各自的致病基因，組成自身染色體時(shí)就會(huì)導(dǎo)致患病。由此可見，SLC26A4突變的等位基因會(huì)穩(wěn)定的由親代向子代傳遞，506家系和513家系的SLC26A4基因同樣具有這種遺傳特征。

大前庭水管綜合征屬于常染色體隱性遺傳病，家系中常僅見一代人發(fā)病，先證者的父母為無(wú)臨床癥狀的單個(gè)突變攜帶者，患者常攜帶雙等位基因突變。上述3個(gè)家系中，均僅見一代人發(fā)病，父母聽力都正常，但均為致病基因的攜帶者，其子代中既有大前庭水管綜合征患者，又有聽力完全正常者，且患者中有男性也有女性，這些特點(diǎn)均符合大前庭水管綜合征的遺傳特征。根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，兩個(gè)攜帶者婚配后，其子代中患者、攜帶者和正常者的發(fā)生幾率分別為25%、50%和25%。由此可以預(yù)測(cè)，506家系先證者的同胞姐姐和513家系先證者的同胞弟弟為IVS7-2A>G攜帶者的幾率為67%，完全正常的幾率為33%[10]。本研究502家系的子代中未發(fā)現(xiàn)致病基因的攜帶者，患者的發(fā)病幾率是60%(3/5)，506家系和513家系中患者的幾率均為50%(1/2)，均較理論值25%高。那么，先證者父母再生育一個(gè)大前庭水管綜合征患兒的幾率可能會(huì)低于25%。因而，臨床醫(yī)生在對(duì)大前庭水管綜合征家系再生育一個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。

大前庭水管綜合征的致病基因會(huì)由親代向子代穩(wěn)定的遺傳，上述3個(gè)家系中患者的致病基因同樣會(huì)遺傳給其后代，若她(或他)與正常人婚配，其子代均為攜帶者；若與攜帶者婚配，子代為攜帶者或患者，且患者的幾率較兩個(gè)攜帶者婚配后子代患病的幾率增加一倍。因此，倘若婚前進(jìn)行SLC26A4基因的檢測(cè)，查明致病突變，并給予積極的遺傳指導(dǎo)或進(jìn)行產(chǎn)前診斷，就可以對(duì)大前庭水管綜合征聾兒的出生做出早期預(yù)警，從而減輕家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)。

近年來，國(guó)內(nèi)學(xué)者已在SLC26A4基因熱點(diǎn)突變及突變頻率、遺傳特征等方面進(jìn)行了比較全面、深入的研究[6，7,11，12]。在此基礎(chǔ)上本研究又對(duì)3個(gè)大前庭水管綜合征家系的SLC26A4基因進(jìn)行序列分析，查明了各家系成員的基因型，明確了各家系的致聾原因，并闡述了該基因由親代向子代穩(wěn)定傳遞的規(guī)律，明確了502、506和513家系中子代的患病幾率分別為60%、50%和50%，均高于理論值25%；同時(shí)對(duì)患者與不同類型的配偶婚后所生子代發(fā)病情況進(jìn)行預(yù)測(cè)、分析，若給予積極的遺傳咨詢和適當(dāng)?shù)呐R床指導(dǎo)，及早進(jìn)行預(yù)防和干預(yù)，就可以降低耳聾的發(fā)生率，提高患者生活質(zhì)量。

4 參考文獻(xiàn)

1 Griffith AJ, Arts A, Downs C, et al. Familial large vestibular aqueduct syndrome[J].Laryngoscope,1996, 106, 8:960.

2 Mafong DD, Shin EJ,Lalwani AK. Use of laboratory evaluation and radiologic imaging in the diagnostic evaluation of children with sensorineural hearing loss[J].Laryngoscope,2002, 112, 1:1.

3 Abe S, Usami S, Hoover DM., et al. Fluctuating sensorineural hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct maps to 7q31, the region containing the Pendred gene[J].Am J Med Genet,1999, 82: 322.

4 孫喜斌，李興啟，張華.全國(guó)第二次殘疾人抽樣調(diào)查聽力殘疾標(biāo)準(zhǔn)介紹[J].聽力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志，2006，14：447.

5 Wu CC, Chen YS, Chen PJ, et al. Common clinical features of children with enlarged vestibular aqueduct and Mondini dysplasia[J].Laryngoscope,2005, 115:132.

6 Wang QJ, Zhao YL, Rao SQ, et al. A distinct spectrum of SLC26A4 mutations in patients with enlarged vestibular aqueduct in China[J].Clin Genet,2007, 72:245.

7 趙亞麗，王秋菊，李慶忠，等.95例前庭水管擴(kuò)大核心家系SIC26a4基因特異突變圖譜[J].聽力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志,2008, 16:178.

8 Yang JJ, Tsai CC, Hsu HM, et al. Hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct and Mondini dysplasia is caused by splice-site mutation in the PDS gene[J].Hear Res,2005, 199:22.

9 Tsukamoto K, Suzuki H, Harada D, et al. Distribution and frequencies of PDS (SLC26A4) mutations in Pendred syndrome and nonsyndromic hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct: A unique spectrum of mutations in Japanese[J].Eur J Hum Genet,2003, 11： 916.

10 趙亞麗，王秋菊，蘭蘭，等, 大前庭水管綜合征家系SLC26A4基因突變分析[J].中華耳科學(xué)雜志，2006, 4:322.

11 李琦，戴樸， 黃德亮，等.SLC26A4基因IVS7-2A>G突變?cè)谥袊?guó)不同地區(qū)和民族重度感音聾患者中分布頻率的觀察[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007, 42:5.

12 Dai P, Li Q, Huang D, et al. SLC26A4 c.919-2A>G varies among Chinese ethnic groups as a cause of hearing loss[J].Genet Med,2008,10:586.